この作品は、NIDDK（LO）、アメリカ心臓協会（AB）、スウェーデンとKungliga Fysiografiska Sällskapet、ルンド、スウェーデン（UB）のウェナーグレングレン基礎からポスドクからR01 DK078161によってサポートされていました。追加のサポートは、病理組織学、バイオインフォマティクスおよびFACS用メイン医療センター研究所の中核施設（2P20RR18789 - 06でサポートされている）とMMCRIの動物施設で提供されていました。

1。腎臓の消化のために試薬の準備<ol><li> 0.25％コラゲナーゼ1.5mlを（w / v）の、1％パンクレアチンダイジェスト（w / v）の溶液を8 E17.5腎臓から腎性ゾーンの細胞（NZCs）の抽出に必要となります。パンクレアチンは、室温で溶解するために約2時間がかかるため、十分な事前実験になされるべきであると予想胚腎臓の最大の数のためのソリューションを消化。第一10ミリリットルダルベッコのリン酸にコラゲナーゼ25mgの追加することで、ダイジェストの溶液を調製する明確な15ミリリットル、滅菌遠心管に（DPBS）緩衝生理食塩水。これは酵素消化を妨害するため、DPBSは、カルシウムやマグネシウムが含まれていないことが重要です。コラゲナーゼA.が溶解するコラゲナーゼに少なくとも2時間nutatorに関するソリューションとミックスをパンクレアチン100 mgを追加溶解するために10分間nutator上でソリューションを混ぜる。また、コラゲナーゼ/パンクレアチン消化液を4℃で一晩nutator上に混在することができますそれはコラゲナーゼはとパンクレアチン、計量と鼻腔を刺激する際に大気中に容易に分散させるように、マスクを着用することをお勧めします。 </li><li>ハンクス緩衝生理食塩溶液（HBSS）で5％ウシ胎児血清（FBS）（v / v）の溶液を調製します。ミックスに反転。 8腎臓の各チューブに1 mlは必要になります。 </li><li> 1％グルタミン（v / v）および1％ペニシリン - ストレプトマイシン（PenStrep）（v / v）でケラチノサイト無血清培地を補充することによって培養液を準備します。 </li><li>成長表面の1cm 2あたり5mgの濃度で、ヒトフィブロネクチン溶液によるコーティング滅菌平底ポリスチレン組織培養プレート（96、48、24またはウェル6）。フィブロネクチン粉末5mgを滅菌H 2 Oの5 mlに再懸濁されているこれは、カルシウムまたはマグネシウムなしで滅菌DPBSで午前1時25分を希釈し、250mlを24ウェルプレートの各ウェルに追加されます。プレートはその後、4℃あるいはで1時間に続いて1時間室温でフィブロネクチン溶液と共にインキュベートされ、プレートを4℃で一晩インキュベートすることができます℃の溶液は、次いで、層流フードで吸引する前に培地/のほかに細胞。 </li></ol> 2。解剖腎臓＆削除カプセル（室温で行わ） <ol><li> E17.5で、、あなたの動物実験使用の委員会によって承認された手順を使用して、母を犠牲に子宮を除去し、カルシウムとマグネシウムとのDPBSを含むペトリ皿に入れてください。解剖顕微鏡下では、子宮からそれぞれの胚を削除し、それぞれの胚を斬るために時計製作の鉗子を使用する。全体のゴミが子宮外になると、完全に可能な限り多くの血液と組織の残骸として残して胚をカバーするために、カルシウムとマグネシウムとの十分なDPBSを含むクリーンなシャーレに胚を移す。 </li><li>鉗子を使用して、臍のレベルでの胚の腹壁に円周切開を行います。その後、その背中に胚を置いて鉗子の一組で肩でそれを突き止める、と鉗子の他のセットを使用して膀胱に肺から内臓を取り除く。練習すればこれは1つの動きで行うことができます。腎臓は、臓器の質量の背面に接続する必要があります。腎臓がeviscerated臓器に接続されたままにしない場合、それらは慎重に背側体壁から削除することができます。それらが不適切な細胞型で、最終的な文化を汚染するので、この解剖の過程で損傷した腎臓は破棄されるべきである。 </li><li>ゆっくりとお互いに接続されている腎臓を保つように注意しながら、臓器の残りの部分から腎臓を離れていじめる。鉗子の一組と腎臓の間の組織を持ち、他の鉗子で腎臓の1つに接続副腎をつかむ。副腎は腎臓のカプセルに接続する必要があります。静かにバナ​​ナの皮をむくと似て離れて腎臓の外側から副腎やカプセル、皮。剥離しながら半分に腎臓を分割しないように注意してください、そしてカプセルの下に腎組織を損傷しないようにしてください。それがまだアタッチされている場合、慎重に、残りのカプセルだけでなく、尿管を取り外します。残りの腎臓を繰り返します。 </li><li> HBSSの5 mlのポリスチレンチューブに腎臓を配置するカット転送ピペットを使用してください。各胚のためのステップ2.2から2.4を繰り返します。腎臓は、チューブ当たり8をプールすることが。練習すれば、解剖やカプセル除去は、胚当たり2〜3分かかります。 </li></ol> 3。腎臓の酵素消化（特に断りのない限り常温、すべてのステップ） <ol><li>慎重に腎臓との接触を避けながら、ピペッターで腎臓を含む5 mlチューブからHBSS溶液を除去。すぐに次のサンプルに移動する前に、腎臓を含む5 mlのチューブにコラゲナーゼA /パンクレアチン消化物の溶液1.5mlを加える。腎臓の各チューブに対して繰り返します。 </li><li>酵素/腎臓のある場所のチューブは、15分間予め温めておいた37℃のインキュベーターでnutatorにダイジェスト。 2分前にダイジェストの完了は、実行されるごとにダイジェスト用の新鮮な5mlのポリスチレンチューブにDNaseの3μlを（1 U / ml）を加える。 </li><li>迅速に削除するインキュベーターからダイジェストを、FBSの75μlを加え、混ぜるを3回転倒。 2分間のベンチに放置。 </li><li>背後にある残りの0.2ミリリットルの細胞懸濁液と腎臓を残したままのDNase（1 U / ml）を含む5 mlのポリスチレンチューブに細胞懸濁液1.4 mlを。残された解決策の追加の0.2mLのは、このような細胞外マトリックスなどの不純物が含まれます。 </li><li>予め温めておいた37のnutatorのミックス細胞懸濁液/ DNaseは℃で10分間インキュベーター。 </li><li>すぐにインキュベーターから細胞懸濁液を除去し、1.5mlのエッペンドルフチュー​​ブにそれぞれ転送します。 5分間325グラムで、マイクロの細胞懸濁液をスピン。 </li><li> 5〜6回のピペッティング5％FBS / HBSS、1 mlに細胞ペレットを再懸濁しますペレットから上清を取り除く。次のサンプルに移動する前に、各チューブにフタを。 </li><li> 5分間325グラムで、微量遠心機で細胞懸濁液をスピン。 </li><li>上清を除去し、次のサンプルに移動する前に、各チューブに添加し、キャップのチューブでケラチノサイト無血清培地（KSFM）0.5 mlを加える。培地はすべてのチューブに追加された後、軽く1ミリリットルマイクロピペットで5〜6回ピペッティングすることにより、各細胞ペレットを再懸濁します。新鮮な5mlのポリスチレンチューブ内のすべての細胞懸濁液を組み合わせる。 </li><li>サンプルあたりKSFMで5 mlのポリスチレン丸底チューブに置かれたプリウェット2つの40ミクロ​​ンセルストレーナーキャップ。 1 mlのマイクロピペットで転送することにより、一つのセルストレーナーキャップを介して細胞懸濁液を渡します。ピペットの先端でフィルターに触れないようにしてください。フロースルーを収集すると第二ストレーナーキャップを通してろ過を繰り返す。セルストレーナーのキャップを取り外し、通常の5 mlのポリスチレンチューブから新しいキャップと交換してください。 </li><li>添加剤とKSFMで必要に応じて希釈し、血球計算盤または1cm 2当たり10万個の細胞の密度で、フィブロネクチンコート培養プレートのウェルに、デバイスとの転送の細胞をカウントする他の細胞と細胞を数える。一般的に、我々は10胚の腹当たり約4.5x10 6個の細胞を取り出す。 </li><li> 5％CO 2で37℃の加湿インキュベーターで細胞をインキュベート。 </li><li>細胞が回復し、追加の試薬で刺激前に培地中で2〜4時間のために添付することができます。 1〜48時間のために関心のある化合物で細胞を刺激する。製造元の指示に従ってキアゲンしたRNeasyマイクロキットを用いてPCR分析のためのRNAを精製または蛍光細胞を免疫染色するには、以下の手順に従ってください。 </li></ol> 4。細胞を固定するための試薬を準備し、免疫染色<ol><li> 4％PFAを準備：55でPBS（v / v）を4％パラホルムアルデヒドを溶解し、° Cの正規撹拌しながら。使用前に室温に冷却してください。このソリューションは、毒性があり、指定された廃棄物容器に破棄する必要があります。 </li><li> 0.3％（v / v）の溶液を得たPBSにトリトンX - 100を追加することにより透過液を準備します。 </li><li>使用する二次抗体を発生させるために使用されたものと同じ種からの血清を含むPBSで5％ブロッキング溶液を準備します。あなたがロバ抗ウサギのAlexa Fluor 568であなたの標的抗原に対するウサギの抗体を検出する場合たとえば、5％ロバ血清を含むブロッキング溶液を準備。 4℃で保存します。 </li><li>ブロッキング溶液は5％に抗体の適切な濃度を追加することによって、一次抗体溶液を準備します。 </li><li>使用直前に二次抗体溶液を準備します。核対比DAPIとこのようなブロッキング溶液：5％〜ファロイジンなど、他のオルガネラマーカーと一緒にメーカーの推奨濃度で蛍光物質標識抗体を追加。ストレージが必要な場合は、4℃、暗所で解決策を保つ° Cを使用するまで。 </li><li>免疫染色の細胞の保存のため50％グリセロール/ PBS溶液（v / v）を準備する。また、Vectashieldを使用することができます。 </li></ol> 5。細胞の固定と免疫染色<ol><li>以下のプロトコールは24ウェルプレートでNZCsの固定と染色のために設計されています。与えられたボリュームは、単一のよくのためのものです。試薬は、穏やかに細胞の剥離を避けるために、全てのステップにおいて、ピペッティングされるべきである、とプレートの攪拌は、インキュベーションのステップで推奨されていません。 </li><li>ゆっくりと1 mlのマイクロピペットで培地を除去し、接続された培養細胞を4％PFAの0.5 mlを加える。室温で静かに15分間インキュベートする。 </li><li> 4パーセントのPFAを取り外し、0.5 mlあたりもの透過液を加える。室温で10分間インキュベートする。 </li><li>透過溶液を除去し、穏やかにリンス当たりPBS 0.5mlを二回すすいでください。 </li><li>ブロッキング溶液0.5 mlを加え60分間室温でインキュベートする。 </li><li>ブロッキング溶液を除去し、0.225ミリリットル一次抗体溶液を加える。 </li><li> 4℃で2時間または一晩℃の室温でインキュベート</li><li>一次抗体溶液を除去し、優しく里リンス当たりPBS 0.5 mlでNSE回。 </li><li> 0.225ミリリットル二次抗体溶液を追加。 60分間室温で暗所でインキュベートする。 </li><li>二次抗体溶液を除去し、穏やかにリンス当たりPBS 0.5mlを二回すすいでください。 </li><li> 50％グリセロール/ PBS溶液（V / V）またはうまく表面の底をカバーするのに十分なVectashield 0.3 mlを加え。 </li><li> 4時ホイルに包んで落射蛍光顕微鏡またはストアを持つ画像セル℃の</li></ol> 6。代表的な結果<img src="/files/ftp_upload/2555/2555fig1.jpg" alt="図1" /> 図1。NZCsが1cm 2当たり20万セルで播種、E17.5胚から精製し、24時間計、37℃でインキュベートした。細胞は、免疫蛍光染色の前にライカDMのIRB倒立顕微鏡と位相差により画像化した。文化の中で24時間後にNZCsの（）20X位相コントラストビュー。 （B）細胞は、ネフロンの前駆細胞（赤）と二次のAlexa Fluor 568結合ロバ抗ウサギのための特異的ウサギ抗PAX2抗体を用いて固定し、染色した。青色の核はDAPIで対比に注意してください。文化の中で24時間後のネフロン前駆細胞のクラスターの（C）40X位相コントラストのビュー（中央）。 （D）にLacZ + Foxd1プロモーターの制御下でβ-ガラクトシダーゼを発現しFoxd1 LacZの株の胚。Foxd1から分離されたNZCsの40Xの画像は、発展途上腎臓の腎性ゾーン内の間質細胞集団に発現している。細胞は、F -アクチンマーカーファロイジン（オレゴングリーン一次複合体）、核染色DAPI（青）とウサギ抗β-ガラクトシダーゼで染色した- Foxd1の検出のための（二次のAlexa Fluorロバ抗ウサギ568）+間質細胞（赤）。

<ol>
	<li>Blank, U., Brown, A., Adams, D. C., Karolak, M. J., Oxburgh, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BMP7+promotes+proliferation+of+nephron+progenitor+cells+via+a+JNK-dependent+mechanism.">BMP7 promotes proliferation of nephron progenitor cells via a JNK-dependent mechanism.</a> Development. 136, 3557-3566 (2009).</li><li>Brunskill, E. W., Aronow, B. J., Georgas, K., Rumballe, B., Valerius, M. T., Aronow, J., Kaimal, V., Jegga, A. G., Grimmond, S., McMahon, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atlas+of+gene+expression+in+the+developing+kidney+at+microanatomic+resolution.">Atlas of gene expression in the developing kidney at microanatomic resolution.</a> Developmental Cell. 15, 781-791 (2008).</li><li>Godin, R. E., Takaesu, N. T., Robertson, E. J., Dudley, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+BMP7+expression+during+kidney+development.">Regulation of BMP7 expression during kidney development.</a> Development. 125, 3473-3482 (1998).</li><li>Grobstein, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inductive+epitheliomesenchymal+interaction+in+cultured+organ+rudiments+of+the+mouse.">Inductive epitheliomesenchymal interaction in cultured organ rudiments of the mouse.</a> Science. 118, 52-55 (1953).</li><li>Grobstein, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphogenetic+interaction+between+embryonic+mouse+tissues+separated+by+a+membrane+filter.">Morphogenetic interaction between embryonic mouse tissues separated by a membrane filter.</a> Nature. 172, 869-870 (1953).</li><li>Hatini, V., Huh, S. O., Herzlinger, D., Soares, V. C., Lai, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Essential+role+of+stromal+mesenchyme+in+kidney+morphogenesis+revealed+by+targeted+disruption+of+Winged+Helix+transcription+factor+BF-2.">Essential role of stromal mesenchyme in kidney morphogenesis revealed by targeted disruption of Winged Helix transcription factor BF-2.</a> Genes and Development. 10, 1467-1478 (1996).</li><li>Oxburgh, L., Chu, G. C., Michael, S. K., Robertson, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TGFb+superfamily+signals+are+required+for+morphogenesis+of+the+kidney+mesenchyme+progenitor+population.">TGFb superfamily signals are required for morphogenesis of the kidney mesenchyme progenitor population.</a> Development. 131, 4593-4605 (2004).</li><li>Srinivas, S., Watanabe, T., Lin, C. S., William, C. M., Tanabe, Y., Jessell, T. M., Costantini, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cre+reporter+strains+produced+by+targeted+insertion+of+EYFP+and+ECFP+into+the+ROSA26+locus.">Cre reporter strains produced by targeted insertion of EYFP and ECFP into the ROSA26 locus.</a> BMC Developmental Biology. 1, 4-4 (2001).</li><li>Yu, J., Carroll, T. J., McMahon, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sonic+hedgehog+regulates+proliferation+and+differentiation+of+mesenchymal+cells+in+the+mouse+metanephric+kidney.">Sonic hedgehog regulates proliferation and differentiation of mesenchymal cells in the mouse metanephric kidney.</a> Development. 129, 5301-5312 (2002).</li></ol>

利害の衝突は宣言されません。

このプロトコルでは、胚性腎臓の腎性ゾーンから細胞を単離、培養する方法を説明します。それは最初に腎性ゾーン（ブランクら 、2009）の細胞へのBMP7治療の効果の研究の一環として公表された方法の開発である。初期の研究では、NZC人口の中で表されるセルのタイプを特徴づけるために一連の実験を行った。 （のSrinivas ら、2001; Yu らを 、簡単に言えば、皮質の間質（Foxd1 + / lacZ）に（。Hatiniら 、1996）のための遺伝的レポーターからNZCsの精製は、（R26 rEYFP Hoxb7 + / CRE）ダクト収集。 、2002）、およびキャップ間充織は（BMP7 + / lacZの ）（ゴダンら 、1998）収穫NZCsの約35％は皮質の間質であることを明らかに、52％が上限の間充織で、ダクトの汚染を収集すると、0.04％未満を表している。 R26 rEYFP株（オックスボローら、2004;。。のSrinivas ら、2001）BMP7 + / CREを用いて実験をマーキングリネージュNZCsの約10％がBMP7表現を差別化し、失われているキャップの間充織の系統の細胞であってもよいことを示した。 7AADと生存率の研究は約95％の孤立NZCsの生存率を示した。我々は最近、フローサイトメトリー選別を通してNZCs内細胞サブセットを分離することで成功​​を経験している。しかし、腎性ゾーンの亜集団のそれぞれに固有の膜関連マーカーの不足は、これらの分析を制限している、と蛍光マーカー遺伝子を持つマウスから派生した現在のところ唯一の細胞が可能です。 このプロトコルの有効性は、解離ステップの速度に大きく依存する。腎臓の酵素消化の前に時間の短い期間HBSSに残っている成長因子の刺激の増加に、細胞の生存と応答性の両方。短い準備時間は、したがって、より高い細胞の生存とより堅牢な応答で両方をもたらす。細胞ペレットを簡単に重要な細胞の損失につながる邪魔されている細胞懸濁液をスピンした後上清を除去するときにまた、注意が必要です。 胚の器官培養を（Grobstein、1953a; Grobstein、1953b）を記述クリフォードGrobsteinの初期の作品以来、腎臓は、器官形成と発展における上皮と間葉細胞間の相互作用のモデル系となっています。最近のmicroanatomic遺伝子発現の研究は、これらの細胞区画の各々 （ブランスキルら 、2008）内の細胞型の予期せぬ複雑さを明らかにした、とそのようなNZC文化などの補完的な方法はnephrogenesis中にこれらの細胞間の相互関係を理解する必要があります。私たちの主要な細胞の研究の究極の目標は、腎性ゾーンの細胞が無期限の両方大人のnephrogenesisと生着の研究のためにin vitroで拡張することができる条件を定義することです。 NZC培養系ではこの目標に向けた重要なステップである、と私たちの研究室の目的で継続的な研究は、これらの細胞の増殖制御のメカニズムを定義する。

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Watchmaker&#x2019;s forceps #5</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Roboz</td>
<td>RS-4905</td>
<td>2 pairs required</td>
</tr>
<tr>
<td>Collagenase A</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Roche</td>
<td>10 103 578 001</td>
<td>Wear mask</td>
</tr>
<tr>
<td>Porcine Pancreatin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>P8096</td>
<td>Wear mask</td>
</tr>
<tr>
<td>DPBS w/ Ca, Mg</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Lonza</td>
<td>17-513F</td>
<td>With Mg &amp; Ca</td>
</tr>
<tr>
<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>BioWhittaker</td>
<td>14-901E</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>HBSS</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Gibco</td>
<td>14175</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>KSFM</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Gibco</td>
<td>10724-011</td>
<td>without added growth factors</td>
</tr>
<tr>
<td>L-Glutamine 200mM</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>G7513</td>
<td>Use @ 1% v/v</td>
</tr>
<tr>
<td>PenStrep 10,000 U penicillin / ml 10 mg streptomycin / ml</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>P4333</td>
<td>Use @ 1% v/v</td>
</tr>
<tr>
<td>Fibronectin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>BD Biosciences</td>
<td>356008</td>
<td>Supplied as powder</td>
</tr>
<tr>
<td>24 well culture plate</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Thermo Scientific </td>
<td>142485</td>
<td>Nunclon</td>
</tr>
<tr>
<td>DPBS w/o Mg &amp; Ca</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Lonza</td>
<td>17-512F</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>5mL polystyrene tubes</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>BD Biosciences</td>
<td>352235</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>DNase (1 U/&mu;l)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>18068-015</td>
<td>4 &mu;l per 1.5 ml</td>
</tr>
<tr>
<td>40 micron cell-strainer </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>BD Biosciences</td>
<td>352235</td>
<td>w/cap and tube</td>
</tr>
<tr>
<td>Paraformaldehyde</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>P6148</td>
<td>Use @ 4 % w/v</td>
</tr>
<tr>
<td>Triton X100</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>VWR</td>
<td>VW3929-2</td>
<td>Use @ 0.3 % v/v</td>
</tr>
<tr>
<td>PBS</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>P3813</td>
<td>Supplied as powder</td>
</tr>
<tr>
<td>Donkey serum</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Jackson ImmunoResearch</td>
<td>017-000-121</td>
<td> Use @ 5 % v/v</td>
</tr>
<tr>
<td>Rabbit anti-PAX2 </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>71-6000</td>
<td>Dilute 1:100</td>
</tr>
<tr>
<td>Rabbit anti-&beta;-gal</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>MP Biomedicals</td>
<td>559762</td>
<td>Dilute 1:200</td>
</tr>
<tr>
<td>Oregon Green 488 phalloidin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>O7466</td>
<td>Dilute 1:200</td>
</tr>
<tr>
<td>Donkey anti-rabbit Alexa Fluor 568</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>A10042</td>
<td>Dilute 1:200</td>
</tr>
<tr>
<td>DAPI</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>D1306</td>
<td>Dilute 1:5000</td>
</tr>
<tr>
<td>Vectashield</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Vector Laboratories</td>
<td>H-1000</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Glycerol</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>EMD</td>
<td>GX0185-6</td>
<td>Mix 50 % with H2O</td>
</tr>
<tr>
<td>RNeasy Micro Kit</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Qiagen</td>
<td>74004</td>
<td>Use "DNase on column" protocol</td>
</tr>
<tr>
<td>Transfer pipettes, 3ml</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>BD Falcon</td>
<td>357575</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

isolation and culture of cells from the nephrogenic zone of the embryonic mouse kidney

腎臓の胚発生は広範囲に器官形成における上皮 - 間葉相互作用のモデルとして、先天性腎臓病の起源の理解を得るために両方が検討されている。さらに最近では、腎性運命に向かってナイーブな胚性幹細胞をステアリングの可能性は、再生医療の新たな分野で検討されている。マウスの遺伝学的研究は、腎臓の開発に必要ないくつかの経路を同定し、そして臓器における遺伝子転写のグローバルカタログは最近生成されて<a href="http://www.gudmap.org/">http://www.gudmap.org/~~V</a> 、本質的な発達機能の多数の候補のレギュレータを提供しています。げっ歯類の腎臓の器官形成は、器官培養で検討することができる、と多くの報告は、どちらかの候補タンパク質を適用したり、siRNAまたはモルフォを使用して候補遺伝子の発現をノックダウンの成果を分析するためにこのアプローチを使用している。培養臓器が巨大分子及びウイルス粒子の拡散を制限するコンパクトな細胞外マトリックスを含んでいるのでしかし、発展途上腎臓における幹細胞/前駆細胞の分化に対する更新を制御するシグナル伝達の研究に器官培養の適用性が制限されています。腎臓に幹細胞/前駆細胞のニッチに影響を与えるイベントを細胞シグナル伝達を研究するために我々は、分化の上皮誘導因子から独立して開発する腎臓のex vivoでの腎性ゾーンまたは前駆細胞のニッチを確立する主要な細胞システムを開発した。制限酵素消化を用いて、腎性ゾーンの細胞はE17.5で腎臓の開発と選択的に解放することができます。ろ過に続いて、これらの細胞は最適化された条件を使用して不規則な単層として培養することができる。マーカー遺伝子の解析は、これらの培養物は、in vivoでの腎性ゾーンの特性の細胞型の分布を含んでいること、そして彼らは培養期間中に適切なマーカー遺伝子の発現を維持することを示している。これらの細胞は、小分子および組換えタンパク質の治療に、そして重要なことにも大いに候補幹細胞/前駆細胞の調節効果の研究を容易にウイルスの伝達、に非常にアクセス可能です。このような増殖と細胞死だけでなく、in vivoでのネフロンの幹細胞/前駆細胞の特徴的分子マーカーの発現の変化などの基本的な細胞生物学的パラメータは正常に実験的な成果として使用することができます。この小説の主細胞技術を用いて、我々の研究室で進行中の作業は、ネフロンの幹細胞/前駆細胞の自己再生対分化の調節を支配する基本的なメカニズムを解明することを目指しています。

Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Culture of Cells from the Nephrogenic Zone of the Embryonic Mouse Kidney at JoVE.com

Isolation and Culture of Cells from the Nephrogenic Zone of the Embryonic Mouse Kidney

本報告書では、発展途上腎臓の幹細胞/前駆細胞を調節するシグナル伝達経路を研究するために使用できるマウス胎児の腎臓から前駆細胞のニッチの分離と培養のための方法を説明します。これらの培養細胞は、候補の経路の効率的な操作を可能にする、小分子および組換えタンパク質の治療に、そして重要なことは、ウイルス形質導入に非常にアクセス可能です。

マウス胎児の腎臓の腎性帯からの細胞の単離と培養

Embryonic development of the kidney has been extensively studied both as a model for epithelial-mesenchymal interaction in organogenesis and  to gain ...

isolation-culture-cells-from-nephrogenic-zone-embryonic-mouse

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

18.0K ビュー.  Maine Medical Center Research Institute. 本報告書では、発展途上腎臓の幹細胞/前駆細胞を調節するシグナル伝達経路を研究するために使用できるマウス胎児の腎臓から前駆細胞のニッチの分離と培養のための方法を説明します。これらの培養細胞は、候補の経路の効率的な操作を可能にする、小分子および組換えタンパク質の治療に、そして重要なことは、ウイルス形質導入に非常にアクセス?...

ビデオ: Isolation and Culture of Cells from the Nephrogenic Zone of the Embryonic Mouse Kidney

Isolation and Derivation of Mouse Embryonic Germinal Cells

The ability of embryonic germinal cells (EG) to differentiate into primordial germinal cells (PGCs) and later into gametes during early developmental stages is a perfect model to address our hypothesis about cancer and infertility. This protocol shows how to isolate primordial germinal cells from developing gonads in 10.5-11.5 days post coitum (dpc) mouse embryos.  Developing gonadal ridges from mouse embryos (C57BL6J) were dissociated by mechanical disruption with collagenase, then plated in a mouse embryo fibroblast feeder layer (MEF-CF1) that was previously mitotically inactivated with mitomycin C in the presence of knockout media and supplemented with Leukemia Inhibitor Factor (LIF), basic Fibroblast Growth Factor (bFGF), and Stem Cell Factor (SCF).  Using these optimized methods for PCG identification, isolation, and establishment of culture conditions permits long term cultures of EG cells for more than 40 days.  The embryonic germinal cell lines showed embryonic phenotype and expression of common used markers of the pluripotent state.  Isolation and derivation of germinal cells in culture provide a tool to understand their development in vitro and offer the opportunity to monitor cumulative damage at genetic and epigenetic levels after exposure to oxidative stress.

The ability of embryonic germinal cells to differentiate into primordial germinal cells during early development stages is a perfect model to address our hypothesis about cancer and infertility. This protocol shows how to isolate primordial germinal cells from developing gonads in 10.5-11.5 days post coitum mouse embryos.

マウスES胚細胞の単離と導出

The ability of embryonic germinal cells (EG) to differentiate into primordial germinal cells (PGCs) and later into gametes during early developmental ...

生物学

Isolation and Culture of Avian Embryonic Valvular Progenitor Cells

Proper formation and function of embryonic heart valves is critical for developmental progression. The early embryonic heart is a U-shaped tube of endocardium surrounded by myocardium. The myocardium secretes cardiac jelly, a hyaluronan-rich gelatinous matrix, into the atrioventricular (AV) junction and outflow tract (OFT) lumen. At stage HH14 valvulogenesis begins when a subset of endocardial cells receive signals from the myocardium, undergo endocardial to mesenchymal transformation (EMT), and invade the cardiac jelly. At stage HH25 the valvular cushions are fully mesenchymalized, and it is this mesenchyme that eventually forms the valvular and septal apparatus of the heart. Understanding the mechanisms that initiate and modulate the process of EMT and cell differentiation are important because of their connection to serious congenital heart defects. In this study we present methods to isolate pre-EMT endocardial and post-EMT mesenchymal cells, which are the two different cell phenotypes of the prevalvular cushion. Pre-EMT endocardial cells can be cultured with or without the myocardium. Post-EMT AV cushion mesenchymal cells can be cultured inside mechanically constrained or stress-free collagen gels. These 3D in vitro models mimic key valvular morphogenic events and are useful for deconstructing the mechanisms of early and late stage valvulogenesis.

This article will provide a method for isolating and culturing quail or chicken HH14- valve endocardial cells and HH25 valve cushion mesenchymal cells.

鳥類胚弁膜前駆細胞の単離と培養

Proper formation and function of embryonic heart valves is critical for developmental progression. The early embryonic heart is a U-shaped tube of ...

Isolation of Retinal Stem Cells from the Mouse Eye

The adult mouse retinal stem cell (RSC) is a rare quiescent cell found within the ciliary epithelium (CE) of the mammalian eye1,2,3. The CE is made up of non-pigmented inner and pigmented outer cell layers, and the clonal RSC colonies that arise from a single pigmented cell from the CE are made up of both pigmented and non-pigmented cells which can be differentiated to form all the cell types of the neural retina and the RPE. There is some controversy about whether all the cells within the spheres all contain at least some pigment4; however the cells are still capable of forming the different cell types found within the neural retina1-3. In some species, such as amphibians and fish, their eyes are capable of regeneration after injury5, however; the mammalian eye shows no such regenerative properties. We seek to identify the stem cell in vivo and to understand the mechanisms that keep the mammalian retinal stem cells quiescent6-8, even after injury as well as using them as a potential source of cells to help repair physical or genetic models of eye injury through transplantation9-12. Here we describe how to isolate the ciliary epithelial cells from the mouse eye and grow them in culture in order to form the clonal retinal stem cell spheres. Since there are no known markers of the stem cell in vivo, these spheres are the only known way to prospectively identify the stem cell population within the ciliary epithelium of the eye.

In this video, we will demonstrate how to isolate retinal stem cells from the ciliary epithelium of the mouse eye and grow them in culture to form clonal retinal spheres. The spheres that are isolated possess the cardinal properties of stem cells: self-renewal and multipotentiality.

マウスの眼から網膜幹細胞の単離

The adult mouse retinal stem cell (RSC) is a rare quiescent cell found within the ciliary epithelium (CE) of the mammalian eye1,2,3. The CE is made up of ...

Generation of Mice Derived from Induced Pluripotent Stem Cells

The production of induced pluripotent stem cells (iPSCs) from somatic cells provides a means to create valuable tools for basic research and may also produce a source of patient-matched cells for regenerative therapies. iPSCs may be generated using multiple protocols and derived from multiple cell sources. Once generated, iPSCs are tested using a variety of assays including immunostaining for pluripotency markers, generation of three germ layers in embryoid bodies and teratomas, comparisons of gene expression with embryonic stem cells (ESCs) and production of chimeric mice with or without germline contribution2. Importantly, iPSC lines that pass these tests still vary in their capacity to produce different differentiated cell types2. This has made it difficult to establish which iPSC derivation protocols, donor cell sources or selection methods are most useful for different applications.
The most stringent test of whether a stem cell line has sufficient developmental potential to generate all tissues required for survival of an organism (termed full pluripotency) is tetraploid embryo complementation (TEC)3-5. Technically, TEC involves electrofusion of two-cell embryos to generate tetraploid (4n) one-cell embryos that can be cultured in vitro to the blastocyst stage6. Diploid (2n) pluripotent stem cells (e.g. ESCs or iPSCs) are then injected into the blastocoel cavity of the tetraploid blastocyst and transferred to a recipient female for gestation (see Figure 1). The tetraploid component of the complemented embryo contributes almost exclusively to the extraembryonic tissues (placenta, yolk sac), whereas the diploid cells constitute the embryo proper, resulting in a fetus derived entirely from the injected stem cell line.
Recently, we reported the derivation of iPSC lines that reproducibly generate adult mice via TEC1. These iPSC lines give rise to viable pups with efficiencies of 5-13%, which is comparable to ESCs3,4,7 and higher than that reported for most other iPSC lines8-12. These reports show that direct reprogramming can produce fully pluripotent iPSCs that match ESCs in their developmental potential and efficiency of generating pups in TEC tests. At present, it is not clear what distinguishes between fully pluripotent iPSCs and less potent lines13-15. Nor is it clear which reprogramming methods will produce these lines with the highest efficiency. Here we describe one method that produces fully pluripotent iPSCs and "all- iPSC" mice, which may be helpful for investigators wishing to compare the pluripotency of iPSC lines or establish the equivalence of different reprogramming methods.

Generating induced pluripotent stem cell (iPSC) lines produces lines of differing developmental potential even when they pass standard tests for pluripotency. Here we describe a protocol to produce mice derived entirely from iPSCs, which defines the iPSC lines as possessing full pluripotency1.

人工多能性幹細胞に由来するマウスの作製

The production of induced pluripotent stem cells (iPSCs) from somatic cells provides a means to create valuable tools for basic research and may also ...

Isolation and Culture of Dental Epithelial Stem Cells from the Adult Mouse Incisor

Understanding the cellular and molecular mechanisms that underlie tooth regeneration and renewal has become a topic of great interest1-4, and the mouse incisor provides a model for these processes. This remarkable organ grows continuously throughout the animal&#39;s life and generates all the necessary cell types from active pools of adult stem cells housed in the labial (toward the lip) and lingual (toward the tongue) cervical loop (CL) regions. Only the dental stem cells from the labial CL give rise to ameloblasts that generate enamel, the outer covering of teeth, on the labial surface. This asymmetric enamel formation allows abrasion at the incisor tip, and progenitors and stem cells in the proximal incisor ensure that the dental tissues are constantly replenished. The ability to isolate and grow these progenitor or stem cells in vitro allows their expansion and opens doors to numerous experiments not achievable in vivo, such as high throughput testing of potential stem cell regulatory factors. Here, we describe and demonstrate a reliable and consistent method to culture cells from the labial CL of the mouse incisor.

The continuously growing mouse incisor provides a model for studying renewal of dental tissues from dental epithelial stem cells (DESCs). A robust system for consistently and reliably obtaining these cells from the incisor and expanding them in vitro is reported here.

成体マウス切歯から歯科上皮幹細胞の単離および培養

Understanding the cellular and molecular mechanisms that underlie tooth regeneration and renewal has become a topic of great interest1-4, and the mouse ...

Isolation of Murine Valve Endothelial Cells

Normal valve structures consist of stratified layers of specialized extracellular matrix (ECM) interspersed with valve interstitial cells (VICs) and surrounded by a monolayer of valve endothelial cells (VECs). VECs play essential roles in establishing the valve structures during embryonic development, and are important for maintaining life-long valve integrity and function. In contrast to a continuous endothelium over the surface of healthy valve leaflets, VEC disruption is commonly observed in malfunctioning valves and is associated with pathological processes that promote valve disease and dysfunction. Despite the clinical relevance, focused studies determining the contribution of VECs to development and disease processes are limited. The isolation of VECs from animal models would allow for cell-specific experimentation. VECs have been isolated from large animal adult models but due to their small population size, fragileness, and lack of specific markers, no reports of VEC isolations in embryos or adult small animal models have been reported. Here we describe a novel method that allows for the direct isolation of VECs from mice at embryonic and adult stages. Utilizing the Tie2-GFP reporter model that labels all endothelial cells with Green Fluorescent Protein (GFP), we have been successful in isolating GFP-positive (and negative) cells from the semilunar and atrioventricular valve regions using fluorescence activated cell sorting (FACS). Isolated GFP-positive VECs are enriched for endothelial markers, including CD31 and von Willebrand Factor (vWF), and retain endothelial cell expression when cultured; while, GFP-negative cells exhibit molecular profiles and cell shapes consistent with VIC phenotypes. The ability to isolate embryonic and adult murine VECs allows for previously unattainable molecular and functional studies to be carried out on a specific valve cell population, which will greatly improve our understanding of valve development and disease mechanisms.

The ability to isolate heart valve endothelial cells (VECs) is critical for understanding mechanisms of valve development, maintenance, and disease. Here we describe the isolation of VECs from embryonic and adult Tie2-GFP mice using FACS that will allow for studies determining the contribution of VECs in developmental and disease processes.

ネズミ弁内皮細胞の単離

Normal valve structures consist of stratified layers of specialized extracellular matrix (ECM) interspersed with valve interstitial cells (VICs) and ...

Protein Isolation from the Developing Embryonic Mouse Heart Valve Region

Western blot analysis is a commonly employed technique for detecting and quantifying protein levels. However, for small tissue samples, this analysis method may not be sufficiently sensitive to detect a protein of interest. To overcome these difficulties, we examined protocols for obtaining protein from adult human cardiac valves and modified these protocols for the developing early embryonic mouse counterparts. In brief, the mouse embryonic aortic valve regions, including the aortic valve and surrounding aortic wall, are collected in the minimal possible volume of a Tris-based lysis buffer with protease inhibitors. If required based on the breeding strategy, embryos are genotyped prior to pooling four embryonic aortic valve regions for homogenization. After homogenization, an SDS-based sample buffer is used to denature the sample for running on an SDS-PAGE gel and subsequent western blot analysis. Although the protein concentration remains too low to quantify using spectrophotometric protein quantification assays and have sample remaining for subsequent analyses, this technique can be used to successfully detect and semi-quantify phosphorylated proteins via western blot from pooled samples of four embryonic day 13.5 mouse aortic valve regions, each of which yields approximately 1 &#956;g of protein. This technique will be of benefit for studying cell signaling pathway activation and protein expression levels during early embryonic mouse valve development.

The analysis of protein expression in young embryonic mouse valves has been hampered by the limited tissue available. This manuscript provides a protocol for preparing protein from developing embryonic mouse valve regions for western blot analysis.

途上胚性マウス心臓弁地域からのタンパク質の単離

Western blot analysis is a commonly employed technique for detecting and quantifying protein levels. However, for small tissue samples, this analysis ...

Isolation and Primary Culture of Mouse Aortic Endothelial Cells

The vascular endothelium is essential to normal vascular homeostasis. Its dysfunction participates in various cardiovascular disorders. The mouse is an important model for cardiovascular disease research. This study demonstrates a simple method to isolate and culture endothelial cells from the mouse aorta without any special equipment. To isolate endothelial cells, the thoracic aorta is quickly removed from the mouse body, and the attached adipose tissue and connective tissue are removed from the aorta. The aorta is cut into 1 mm rings. Each aortic ring is opened and seeded onto a growth factor reduced matrix with the endothelium facing down. The segments are cultured in endothelial cell growth medium for about 4 days. The endothelial sprouting starts as early as day 2. The segments are then removed and the cells are cultured continually until they reach confluence. The endothelial cells are harvested using neutral proteinase and cultured in endothelial cell growth medium for another two passages before being used for experiments. Immunofluorescence staining indicated that after the second passage the majority of cells were double positive for Dil-ac-LDL uptake, Lectin binding, and CD31 staining, the typical characteristics of endothelial cells. It is suggested that cells at the second to third passages are suitable for in vitro and in vivo experiments to study the endothelial biology. Our protocol provides an effective means of identifying specific cellular and molecular mechanisms in endothelial cell physiopathology.

The vascular endothelial cells play a significant role in many important cardiovascular disorders. This article describes a simple method to isolate and expand endothelial cells from the mouse aorta without using any special equipment. Our protocol provides an effective means of identifying mechanisms in endothelial cell physiopathology.

マウス大動脈内皮細胞の単離および初代培養

The vascular endothelium is essential to normal vascular homeostasis. Its dysfunction participates in various cardiovascular disorders. The mouse is an ...

Isolation of Enteric Glial Cells from the Submucosa and Lamina Propria of the Adult Mouse

The enteric nervous system (ENS) consists of neurons and enteric glial cells (EGCs) that reside within the smooth muscle wall, submucosa and lamina propria. EGCs play important roles in gut homeostasis through the release of various trophic factors and contribute to the integrity of the epithelial barrier. Most studies of primary enteric glial cultures use cells isolated from the myenteric plexus after enzymatic dissociation. Here, a non-enzymatic method to isolate and culture EGCs from the intestinal submucosa and lamina propria is described. After manual removal of the longitudinal muscle layer, EGCs were liberated from the lamina propria and submucosa using sequential HEPES-buffered EDTA incubations followed by incubation in commercially available non-enzymatic cell recovery solution. The EDTA incubations were sufficient to strip most of the epithelial mucosa from the lamina propria, allowing the cell recovery solution to liberate the submucosal EGCs. Any residual lamina propria and smooth muscle was discarded along with the myenteric glia. EGCs were easily identified by their ability to express glial fibrillary acidic protein (GFAP). Only about 50% of the cell suspension contained GFAP+ cells after completing tissue incubations and prior to plating on the poly-D-lysine/laminin substrate. However, after 3 days of culturing the cells in glial cell-derived neurotrophic factor (GDNF)-containing culture media, the cell population adhering to the substrate-coated plates comprised of &#62;95% enteric glia. We created a hybrid mouse line by breeding a hGFAP-Cre mouse to the ROSA-tdTomato reporter line to track the percentage of GFAP+ cells using endogenous cell fluorescence. Thus, non-myenteric enteric glia can be isolated by non-enzymatic methods and cultured for at least 5 days.

Here, we describe the isolation of enteric-glial cells from the intestinal-submucosa using sequential EDTA incubations to chelate divalent cations and then incubation in non-enzymatic cell recovery solution. Plating the resultant cell suspension on poly-D-lysine and laminin results in a highly enriched culture of submucosal glial cells for functional analysis.

粘膜と粘膜固有層において大人のマウスから腸のグリア細胞の分離

The enteric nervous system (ENS) consists of neurons and enteric glial cells (EGCs) that reside within the smooth muscle wall, submucosa and lamina ...

Simultaneous Isolation and Culture of Atrial Myocytes, Ventricular Myocytes, and Non-Myocytes from an Adult Mouse Heart

The isolation and culturing of cardiac myocytes from mice has been essential for furthering the understanding of cardiac physiology and pathophysiology. While isolating myocytes from neonatal mouse hearts is relatively straightforward, myocytes from the adult murine heart are preferred. This is because compared to neonatal cells, adult myocytes more accurately recapitulate cell function as it occurs in the adult heart in vivo. However, it is technically difficult to isolate adult mouse cardiac myocytes in the necessary quantities and viability, which contributes to an experimental impasse. Furthermore, published procedures are specific for the isolation of either atrial or ventricular myocytes at the expense of atrial and ventricular non-myocyte cells. Described here is a detailed method for isolating both atrial and ventricular cardiac myocytes, along with atrial and ventricular non-myocytes, simultaneously from a single mouse heart. Also provided are the details for optimal cell-specific culturing methods, which enhance cell viability and function. This protocol aims not only to expedite the process of adult murine cardiac cell isolation, but also to increase the yield and viability of cells for investigations of atrial and ventricular cardiac cells.

A method is described for the simultaneous isolation of myocytes and non-myocytes from both the atria and ventricles of a single adult mouse heart. This protocol results in consistent yields of highly viable cardiac myocytes and non-myocytes and details optimal cell-specific culture conditions for phenotyping and in vitro analysis.

心房筋細胞、心室筋細胞、および非筋細胞の同時分離と培養

The isolation and culturing of cardiac myocytes from mice has been essential for furthering the understanding of cardiac physiology and pathophysiology. ...