העבודה נתמכה בחלקה על ידי המכון הלאומי לבריאות (R01GM079688, R21RR024439 ו R21GM075838), הקרן הלאומית למדע (CBET 0941055), וקרן MSU.

1. בידוד של עכברוש MSCs בתאי גזע mesenchymal בודדו 6-8 עכברים בשבוע הישן Sprague-Dawley הנשי כפי שתואר לעיל 1, 2. מבודד MSCs יכול לדבוק משטח פלסטיק להרחיב בקלות במהלך בתרבות חוץ גופית. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החיה הוכנס לחדר הרדמה מורדם במשך כחמש דקות. במהלך ההרדמה, לבחון את קצב הנשימה, ממצמצת ופעילות מוטורית. הסר את החיה מהאולם מיד אחרי זה מפסיק פעילות מוטורית ושיעור מהבהב והלכו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח את חיה על תחנת פעולה להרוג את בעל החיים על ידי נקע בצוואר הרחם. חותכים את עצמות הירך לבין tibias מן הגפיים בחזרה, להסיר את העור והשרירים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שים את עצמות הירך גזור tibias ו ב 70% isopropanol במשך כמה שניות ומעבירים 1X D-PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בארון biosafety, עצמות הירך ושל tibias הועברו צלחת 10 ס&quot;מ המכיל DMEM. כל עצם התקיים אז עם פינצטה את שני הקצוות נחתכו לפתוח עם מספריים. צרף מחט 22g כדי מזרק 3ml ולמלא אותו DMEM, ולאחר מכן לשטוף את מוח לשפופרת 50 מ&quot;ל על ידי החדרת מחט בקצה אחד פתוח של העצם. חזור על 2 ~ 3 פעמים עבור כל עצם. כאשר כל הדלועים התקבלו, resuspend התאים ולהעביר את ההשעיה התא דרך מסננת תא 70μm להסיר את פסולת עצם אגרגטים דם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספין למטה תאים ב 200 גרם, 4 ° C למשך 5 דקות ולהסיר את supernatant על ידי שאיפה. תאים Resuspend במדיום MSC 25ml (DMEM המכיל 10% FBS ו -1% עט סטרפטוקוקוס). ההשעיה 10ml התא היה seeded לתוך צלחת 10 ס&quot;מ כל תרבות עבור סכום כולל של שתי מנות. שמור את הכלים תרבות 37 ° C ו 5% CO 2 חממה 1 ~ 2 שבועות. בינוני שונתה כל 2 ~ 3 ימים. </li></ol> 2. העשרה של עכברוש MSCs מספר חלבונים השטח שימשו להעשיר MSCs, כולל CD54, CD90, CD73, CD105 CD271 ו 3-5. במחקר, השתמשנו CD54 ו CD90 כסמנים להעשיר MSCs ידי מיון התא מגנטי. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כאשר תאים הגיע סביב 80% confluency, לשאוב הבינוני להוסיף 4 ~ 5 מ&quot;ל טריפסין-EDTA על כל מנה. שים את הכלים בחזרה החממה דגירה כ 5 דקות, כדי לאפשר ניתוק התא. לאחר התאים היו מנותקים, להוסיף כמות שווה של המדיום תרבות להשבית טריפסין. איסוף ההשעיה התא לתוך שפופרת 15 מ&quot;ל ותאי ספין למטה על 200 גרם, 4 ° C למשך 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השלבים הבאים מתארים כיצד להעשיר MSCs על ידי שני סמנים משטח CD54 ו - CD90 על פי המדריך להפרדת תאים באמצעות BD IMagnet. תא גלולה היה resuspended במאגר תא מכתים (FBS חום 3% מומת ב 1X D-PBS) ב 20 מיליון תאים / מ&quot;ל. נוגדן Biotinylated CD54 (0.25μg למיליון תאים) ו נוגדן biotinylated CD90 (0.15μg למיליון תאים) נוספה מעורב בעדינות עם ההשעיה התא. לאחר דגירה על קרח במשך 15 דקות, תאים שכותרתו נשטפו עם נפח עודף של חיץ 1X מתאר לעצמי BD. התאים היו שכותרתו הסתובב לעבר 200 גרם, 4 ° C למשך 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> וורטקס מתאר לעצמי BD חלקיקים streptavidin ביסודיות, להוסיף חלקיקים 40μl לכל 10 מיליון תאים. מערבבים את החלקיקים עם תאים שכותרתו ביסודיות דגירה התאים ב 6 ~ 12 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות. זה מאפשר את חלקיקי streptavidin כדי לאגד את biotinylated אנטי CD54 אנטי CD90, אשר חייב את החלבונים פני השטח CD54 ו CD90 בהתאמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בזמן הדגירה, תווית צינור עגול התחתונה מבחן כדי לאסוף את חלק חיובי. לאחר דגירה, להביא את נפח תיוג עד 20 מיליון תאים / מ&quot;ל ​​עם חיץ 1X מתאר לעצמי BD ולהעביר את התאים שכותרתו צינור חלק חיובי את האוסף. המקום צינור חלק חיובי אל IMagnet BD ולתת לו להישאר במשך 6 דקות, ואז להסיר את supernatant עם פיפטה פסטר זכוכית עם צינור חלק חיובי עדיין IMagnet את BD. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את הצינור חיובי חלק מן IMagnet BD ולמקם אותו על הקרח. הוסף 1ml קרים 1X BD מתאר לעצמי חיץ ותאי resuspend ידי ערבוב עדין. מניחים את הצינור בחזרה אל IMagnet BD ולתת לו להישאר 2 ~ 4 דקות. הסר את supernatant חדש עם זכוכית פיפטה פסטר. חזור הכביסה כפי שתואר פעם אחת 2.5 יותר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוצא את הצינור מתוך IMagnet BD ותאי resuspend במדיום תרבות, זרע one 75 ס&quot;מ 2 בקבוק לשמירה על תאים צלחת 10 ס&quot;מ עבור cytometry הזרימה. </li></ol> 3. אימות הביטוי מרקר Surface על ידי זרימת cytometry Cytometry ניתוח תזרים בוצעה לאמת את התאים השגנו לבטא CD54 ו - CD90. סמן CD45 HSC שימש כדי לוודא MSCs היו מתרוקנים של HSCs. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כאשר תאים הופכים ומחוברות ~ 80%, trypsinize תאים עם טריפסין-EDTA לאסוף תאים לתוך שפופרת 15 מ&quot;ל. צנטריפוגה ב 200 גרם, 4 ° C למשך 5 דקות כדי לאסוף את התאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב supernatant והיהh תאים עם 1X D-PBS פעם. תאים Resuspend במאגר מכתים תאים (1X D-PBS המכיל 2% FBS ו אזיד הנתרן 0.05%) לריכוז סופי של 5 ~ 10 מיליון תאים / מ&quot;ל ​​ולשמור תאים על הקרח. 100μl Aliquot תא ההשעיה תוך שישה צינורות שכותרתו (1 תאים בלבד. 2 אלוטיפ לשלוט IgG2a:.. 3 שליטת אלוטיפ IgG1; 4 CD45; 5. CD54,.. 6 CD90). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת פקדי אלוטיפ ונוגדנים העיקרי בריכוזים המתאים (IgG2a ו IgG1: 20μl למיליון תאים; CD45: 0.5μg למיליון תאים; CD54: 0.25μg למיליון תאים; CD90: 0.15μg למיליון תאים) ו דגירה על 4 מעלות 30 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטפו תאים עם 1X D-PBS פעמיים ואז התאים resuspend במאגר תא 100μl מכתים. הוסף SA-PE (streptavidin-phycoerythrin, להשתמש 0.15μg למיליון תאים) ו דגירה על 4 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות בחושך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטפו תאים שכותרתו עם 1X D-PBS פעמיים. Resuspend תאים חיץ תא 400μl מכתים והעברת צינור בז לניתוח cytometry הזרימה. </li></ol> 4. ההפרדה של המושבה, סינגל נגזר MSCs MSCs אוכלוסייה הטרוגנית המורכבת subpopulations שונים עם צורה תאים שונים, קצב הצמיחה, כמו גם יכולת הבחנה 6. עם זאת, כל subpopulations מבטאים סמנים MSC ידוע ולכן הוא לא ריאלי להשתמש סמנים להפריד את אלה subpopulations. לכן, אנחנו מוחלים צילינדרים שיבוט להפריד את subpopulations שונים, אשר הוקמה על ידי מושבות תאים בודדים. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פלייט תאים בערך 50 ~ 100 תאים לכל צלחת 10 ס&quot;מ. דגירה של 37 ° C ו 5% CO 2 חממה 1 ~ 2 שבועות. במהלך תקופה זו, לבחון מושבות מבודדות היטב עם מיקרוסקופ הפוכה. לאחר המושבות הגיעו לגודל מספיק גדול (טוב יותר מ 100 תאים במושבה כל אחת), לסמן את מושבות עם לנוכל בתחתית המנה. מתי לקחת את המושבה להיות מסומן, לוודא שאין סביב מושבות ליד אחד הרים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב בינוני לשטוף את צלחת אחת עם 1X D-PBS. תרימי גליל שיבוט סטרילי עם מלקחיים סטריליות ומניחים בעדינות אותו סביב המושבה המסומן. חזור על פעולה זו עד שכל המושבות מסומן יש להציב מעל גליל שיבוט. מושבות הרים צריך להיות רחוק כל כך אחרת, שכל צילינדר שיבוט רק מכיל המושבה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 100μl טריפסין-EDTA על גליל כל שיבוט ולשים את המנה חזרה חממה ~ 5 דקות. אחרי 5 דקות, לבדוק את התאים תחת מיקרוסקופ כדי לראות אם הם עיגול למעלה. כאשר תאים יש הרים, מוסיפים כמות שווה של המדיום תרבות להשבית טריפסין. מערבבים את ההשעיה תא עם micropipettor 200μl ולהעביר את ההשעיה התא לצלחת 60mm המכיל 3ml בינוני תרבות prewarmed. לייבל את הכלים שצריך לשים אותם בחזרה לתוך החממה. מעקב אחר שינוי מורפולוגי במהלך הימים הקרובים. </li></ol> 5. נציג תוצאות על פי הפרוטוקול המתואר בחלק לבידוד MSCs חולדה, MSCs חסיד פלסטיק צריך להיות גלוי למחרת לאחר ציפוי. כאשר התאים ממשיכים להתרבות, התאים ומחוברות צריך להיראות כמו תאים שמוצג באיור 1 א. כאשר תאים להגיע confluency ~ 80% (איור 1B), subculturing יכול להתבצע. במהלך תת, טריפסין-EDTA שימש לנתק תאים תאים הרים קטנים ועגולים, כפי שמוצג באיור 1C. <img src="/files/ftp_upload/1852/1852fig1.jpg" alt="איור 1" /> באיור 1. בניגוד לשלב תמונות של עכברוש MSCs. (א) ומחוברות MSCs. רוב התאים הם ציר דמוי כוכב או דמוי. (ב) MSCs סביב 80% confluency. (ג) תאים הרים לאחר trypsinization קטנים ועגולים. לאחר MSCs מועשרים ידי מיון התא מגנטי, cytometry ניתוח תזרים מבוצע כדי לאמת את הסמן הבעות פני השטח. אם העשרה הוא טוב, התאים צריכים להראות מכתים חיובי נגד סמנים MSC CD54 ו CD90 אבל שלילי נגד סמן CD45 HSC (איור 2). אלוטיפ שולטת IgG2a ו IgG1 משמשים שולטת שלילית. <img src="/files/ftp_upload/1852/1852fig2.jpg" alt="איור 2" /> איור 2. Cytometry זרימה ניתוח MSCs עבור סמנים פני השטח. MSCs תויגו עם נוגדנים נגד IgG2a (אלוטיפ בקרה 1), IgG1 (אלוטיפ בקרה 2), CD45, CD54 ו - CD90. MSCs ביטוי CD54 ו CD90 אבל לא CD45. כאשר התאים זורעים בצפיפות המשובטים ראויה, מושבות צריך לעלות מ תאים בודדים. איור 3A מייצג המושבה שהוקמה על ידי תא בודד. שכפול צילינדרים לאחר מכן ניתן להשתמש כדי להפריד בין מושבות תאים שמקורם במושבות יכול להיות מתורבת בנפרד. איור 3B ו - 3C מייצג בתאים שמקורם שתי המושבות בודדים. בתאים שמקורם המושבה 1 הם כמו כישור (איור 3B) ואילו בתאים שמקורם המושבה 2 עגולים (איור 3 ג). <pclass = &quot;jove_content&quot;&gt; <img src="/files/ftp_upload/1852/1852fig3.jpg" alt="איור 3" /> איור 3. הקמת מושבה על ידי MSCs תאים שמקורם מושבת יחיד. MSCs תרבותי על המשובטים טופס צפיפות מושבות בודדות. מושבות אלה יכולים להיות מופרדים על ידי צילינדרים שיבוט ותאי ממושבות שונות יכול להיות מתורבת בנפרד. (א) נציג המושבה שהוקמה על ידי MSCs כאשר מצופה בצפיפות משובט. (ב) Spindle כמו בתאים שמקורם מושבה אחת. (ג) תאים עגולים נגזר מושבה אחרת.

<ol>
	<li>de Hemptinne, I., Vermeiren, C., Maloteaux, J. M., Hermans, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+glial+glutamate+transporters+in+adult+mesenchymal+stem+cells.">Induction of glial glutamate transporters in adult mesenchymal stem cells.</a> J Neurochem. 91, 155-166 (2004).</li><li>Porter, R. M., Huckle, W. R., Goldstein, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+dexamethasone+withdrawal+on+osteoblastic+differentiation+of+bone+marrow+stromal+cells.">Effect of dexamethasone withdrawal on osteoblastic differentiation of bone marrow stromal cells.</a> J Cell Biochem. 90, 13-22 (2003).</li><li>Chamberlain, G., Fox, J., Ashton, B., Middleton, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Concise+review:+mesenchymal+stem+cells:+their+phenotype,+differentiation+capacity,+immunological+features,+and+potential+for+homing.">Concise review: mesenchymal stem cells: their phenotype, differentiation capacity, immunological features, and potential for homing.</a> Stem Cells. 25, 2739-2749 (2007).</li><li>Abdallah, B. M., Kassem, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+mesenchymal+stem+cells:+from+basic+biology+to+clinical+applications.">Human mesenchymal stem cells: from basic biology to clinical applications.</a> Gene Ther. 15, 109-116 (2008).</li><li>Erica, L., Herzog, L. C., Diane, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Krause+Plasticity+of+marrow-derived+stem+cells.">Krause Plasticity of marrow-derived stem cells.</a> Blood. 102, 3483-3493 (2003).</li><li>Colter, D. C., Sekiya, I., Prockop, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+subpopulation+of+rapidly+self-renewing+and+multipotential+adult+stem+cells+in+colonies+of+human+marrow+stromal+cells.">Identification of a subpopulation of rapidly self-renewing and multipotential adult stem cells in colonies of human marrow stromal cells.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 98, 7841-7845 (2001).</li></ol>

פרוטוקול זה מתאר כיצד לבודד ולהעשיר MSCs. שיטה להפריד את המושבה חד תאים שמקורם היא גם Incorporated. ישנם כמה צעדים חשובים עבור הפרדה, בידוד העשרה המושבה מוצלח. אמנם עושה את תא הבידוד מן החולדה, מומלץ לסנן דרך מסננת או תא רשת ניילון סטריליים בגודל דומה להיפטר של קרישי דם ושברים בעצמות. לאחר ציפוי התאים לילה, תאים מתים רבים יהיה צף בינוני לבין תאים מתים יוסרו על ידי החלפת בינוני עם טרי שאמור לעזור את הצמיחה של תאים המצורפת. התא מגנטי ומיון פרוטוקול זה מתאר כיצד לבצע סלקציה חיובית, נהלים דומים ניתן להשתמש כדי לבצע סלקציה שלילית. כמות הנוגדנים שיתווספו עשוי להשתנות ואופטימיזציה נדרש כדי להשיג מיון טוב יותר. הדבר נכון גם עבור תיוג התאים לניתוח cytometry הזרימה. אם לא פועל cytometry ניתוח תזרים עבור דגימות מתויג מיד, דגימות יכול להיות קבוע עם פורמלדהיד 2% ולהפעיל מאוחר יותר. עם זאת, אחסון לטווח ארוך אינו מומלץ כיוון זה נוטה להגדיל את פלואורסצנציה אוטומטי מדגם איכות הקרבה. חלק מרכזי להפרדה המושבה היא זריעת בצפיפות התא הימני (שאמור להיות מותאם באופן ניסיוני) ואיתור שיבוטים אחד שלא מוקפים שיבוטים אחרים. אם יש שיבוטים אחרים בקרבת מקום, גליל השיבוט עשוי להקיף את שיבוטים סמוך התאים המתקבלים כבר לא יהיה מן לשבט אחד. כאשר הנחת גליל שיבוט על שיבוט, גם להיזהר שלא להחליק אותו על פני צלחת כמו זו תגרום גריז סיליקון בחלק התחתון של הגליל שיבוט כדי לכסות את התאים ולמנוע טריפסין מלהגיע תאים לנתק אותם.

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>1X D-PBS</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>14040-133</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>DMEM</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>11885-084</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Cell strainer</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>BD Bioscience</td>
<td>352350</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>FBS</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>26140-079</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Pen-Strep</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>15140</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Trypsin-EDTA</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>25200-056</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>BD Imagnet</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>BD Bioscience</td>
<td>552311</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Biotin mouse IgG2a</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>BD Bioscience</td>
<td>555572</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Biotin mouse IgG1</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>BD Bioscience</td>
<td>555747</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Biotin anti-rat CD54</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Cedarlane Labs</td>
<td>CL054B</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Biotin anti-rat CD90</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Cedarlane Labs</td>
<td>CL005B</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Biotin anti-rat CD45</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Cedarlane Labs</td>
<td>CL001B</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>BD Imag buffer</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>BD Bioscience</td>
<td>552362</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Round-bottom tube</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>BD Bioscience</td>
<td>352063</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Streptavidin particles</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>BD Bioscience</td>
<td>557812</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>SA-PE</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>R&amp;D systems</td>
<td>F0040</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Cloning cylinder</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>C2059</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

isolation and enrichment of rat mesenchymal stem cells (mscs) and separation of single-colony derived mscs

MSCs הם אוכלוסייה של בתאי גזע בוגרים, כי הוא מקור מבטיח עבור יישומים רפואיים. תאים אלה יכולים להיות מבודדים במח העצם ניתן להפריד בקלות מתאי גזע hematopoietic (HSCs) בשל הדבקות הפלסטיק שלהם. פרוטוקול זה מתאר כיצד לבודד MSCs עצמות הירך של חולדות tibias. התאים היו מבודדים מועשר נוספת נגד שני סמנים MSCs משטח CD54 ו - CD90 על ידי מיון התא מגנטי. הביטוי של סמנים משטח CD54 ו CD90 אושרו אז על ידי ניתוח cytometry הזרימה. HSC סמן CD45 נכלל גם כדי לבדוק אם MSCs מיון היו מתרוקנים של HSCs. MSCs באופן טבעי הטרוגני למדי. יש subpopulations של תאים בעלי צורות שונות, ריבוי ויכולות בידול. Subpopulations כל אלה מבטאים את סמנים ידועים MSCs ואין סמן ייחודי שטרם זוהו עבור subpopulations שונים. לכן, גישה חלופית להפריד את subpopulations שונים היא באמצעות צילינדרים שיבוט להפריד את התאים שמקורם המושבה יחיד. התאים שמקורם יחיד מושבות אז יכול להיות מתורבת והערכה בנפרד.

Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Enrichment of Rat Mesenchymal Stem Cells MSCs and Separation of Single-colony Derived MSCs at JoVE.com

Isolation and Enrichment of Rat Mesenchymal Stem Cells MSCs and Separation of Single-colony Derived MSCs

עכברוש MSCs נותקו מן עצמות הירך לבין tibias והעשירו מכן על ידי מיון התא מגנטי. תאים ממוין אושרו עבור ביטוי של סמני פני השטח על ידי cytometry הזרימה. תאים אלה בתרבית גם בצפיפות משובטים כדי ליצור מושבות אחת ואז מושבות אלה היו מופרדים על ידי שכפול צילינדרים.

בידוד והעשרה של תאים עכברוש mesenchymal גזע (MSCs) והפרדה של המושבה, סינגל נגזר MSCs

MSCs are a population of adult stem cells that is a promising source for therapeutic applications. These cells can be isolated from the bone marrow and ...

isolation-enrichment-rat-mesenchymal-stem-cells-mscs-separation

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

Isolation and Enrichment of Rat Mesenchymal Stem Cells (MSCs) and Separation of Single-colony Derived MSCs

28.3K Views.  City of Hope Cancer Center. עכברוש MSCs נותקו מן עצמות הירך לבין tibias והעשירו מכן על ידי מיון התא מגנטי. תאים ממוין אושרו עבור ביטוי של סמני פני השטח על ידי cytometry הזרימה. תאים אלה בתרבית גם בצפיפות משובטים כדי ליצור מושבות אחת ואז מושבות אלה היו מופרדים על ידי שכפול צילינדרים.

Video: Isolation and Enrichment of Rat Mesenchymal Stem Cells MSCs and Separation of Single-colony Derived MSCs

Isolation and Transplantation of Hematopoietic Stem Cells (HSCs)

Isolation and Transplantation of Hematopoietic Stem Cells HSCs

I am Christina Ceso. I am a postdoc in David's Den lab and I work on the hematopoietic stem cells. Today we are going to purify long-term recuperating hematopoietic stem cells and we'll transplant them into a mouse.We start by spraying the mice with alcohol so that first of all, the mind starts sterilized and also the hair doesn't interfere with the dissection. We use PBS with 2%serum for the dissection. I cut the back skin and I pull the skin apart in order to expose the tissue.In order to isolate the tibia, I hold the tibia with tweezers. I cut the tendon on top of the knee and I cut the muscles below the knee and after that I cut through the knee so that the TBI is not connected to the rest of the limb anymore and I pull in order to isolate it. I then hold the TB upside down and with the scissors I separate the foot from the tibia In order to obtain the femur.I cut the muscles around the femur and then I dislocate the femur from the hip. In order to isolate the hip, I cut the muscle around the hip bone on the side of the tail of the mouse and then I pull the hip away from the body of the mouth In order to isolate the spine. I cut through the tail as close as I can to the beginning of the back and then I cut on the two sides of the spine and below the spine, trying to stay as close as possible to the spine so that the peritoneum is not cut and the intestine is left untouched.A first round of cleaning of the bones is done with a scalpel, which is used to scrape the bone, the muscles away from the bone. The scalpel is good to clean the femurs, the hip and the spine. In order to clean the tibia, I hold them with forceps and I use the forceps to remove as much tissue as possible.A second round of cleaning is done using clean wipe to completely clean the bones outta the muscle, and I use the F wipe to clean the tibia, the femurs and the hips. So this is how bones look. After cleaning, I prefer 50 amount tubes with filters on top and I transfer the bones into the mortar.I add the section media and I crush the bones ask of the first round of crashing of the bones. I piped the mixture in order to release as many styles as possible into solution and reduce clumps. I transferred the mixture on the tubes through the filters and this is what the bone fragments look like after the first round of crushing.So I add more dissection medium to the bone fragments and I flash them again. I transferred the seline mixture to the tubes through the filters and at this point the remaining bone fragments are white and there is no bone marrow left. The tubes are filled with PBS 2%serum and in order to have them all with the same weight so that they're balanced in the centrifuge, but also in order to wash the filters so that we obtain as many cells as possible, I then centrifuge the cell mixture and after centrifugation, the palt includes the bone marrow cells.I aspirate the medium and I move back and forward the tube on the rack so that the pelle is becomes loose and fewer clamps are formed. When I add medium, at this point I add one ml of medium per tube and I ics since I'm sorting hematopoietic stem cells. Later on, I'm going to store an ALI output of total bone marrow sizes at this point, which I will use later for the fact single color control.I add lineage antibody cocktail. I ordered the samples to mix them well and I invaded four degrees for 15 minutes. In the meantime, I start preparing the columns for the lineage division.I put the columns on the magnet and I prepare Ian tubes under the columns. I also prepared the gas PBS using aster flip filter and attaching it to the vacuum so that all the bubbles of air move in the top part of the filter. I then add three ml of the gas DBS to each column in order for the column to become wet.After the incubation with the antibodies, I add medium to the cell samples and I centrifuge them in order to remove the excess of antibodies. After the centrifugation, the stain cells are in the pallet. I aspirate the medium and I suspend the pallet in one mile of the gas PBSI Add the strip tab beans, I mix the cells and I incubate for 15 minutes at four degrees.After the incubation, I put new elucian tubes under the columns. I add two ml of PBS to each tube with the cells and I transferred the cell mixture to the column through a 40 micron filter. I wash the tubes with more medium in order to collect all the cells remaining and I apply the remaining medium through the filters to the columns.The progenitor cells lineage low are alluded into the collection views. I pulled the luted samples and I sent tofu them. So after the centrifugation, the depleted cells are in a white pate.I aspirate the medium and re suspend the cells. I store an adequate of the depleted cells and I add the antibodies to the cell mixture for the sorting and also to all the single color controls. The antibodies are incubated in that with the size for 15 minutes in the fridge.After the ation, I add medium to the cells and and centrifuge them to remove the ex excess of antibodies. After the centrifugation, the cells are in the pt, I aspirate the media that I suspend the cells and I transfer the cells into fox tubes with a blue filter. At this point, the cells are ready to be sorted.I place, I place the mouse under a heating lamp for a few minutes so that the veins dilate and they are more easily seen. When preparing the syringe, you have to be careful to eliminate all the bubbles from the, the mixture that is in the syringe and then you bend the needle at 90 degrees. I put the mouse under a glass cup with a weight on top so that it can run away.I sterilize the tail with the alcohol pad so that the site of injection is sterile, but also it's easier to identify the vein. If you look at the tail of the mouse from the top in the middle and top of the tail, there is an artery while on the two sides there are the two veins and we inject the cells in one of the two veins. I insert the needle into the vein and I inject following injection.It is to wait for a couple of seconds before removing the needle, the needle, and after that I clean the side of injection. This is a representation of the syringe with the ben needle bent at 90 degrees with the knee, the at this ankle compared to the tail, which makes the injection the easiest. When you injecting the tail of the mouse, you have to keep in mind that the tail vein is extremely superficial, so really this is the orientation of the needle compared to the tail.And it looks like you will just keep sliding on top of the tail, but actually you will get into the tail then. I am Christina Ceso. I am a post in David Kaden lab, and I work on the hematopoietic stem cells.I usually use for animals to start with, and I had more variability at the beginning, but once you become consistent with your methods, I consistently get about 50, 000 to 60, 000 stem cells out for mice. I did my PhD in London with Dr.Fiona Wat working on derma stem cells. After that, I just wanted to have a wider knowledge of adult stem cells in various tissues, and so I decided to move to David Kaden lab to work on hematopoietic stem cells, mainly because the things that are known about hematopoietic stem cells are the things that are not known for the epidermic stem cells and a number of assays that can be done with epi.Epidermal stem cells are not really done yet with the hematopoietic stem cells, and so at this point I'm trying to put together the, the knowledge from the two different fields and ultimately I'm interested in the study of the mechanism to regulate adult tissue sensors in general, so not just the epidermis or the stem cells, but also different tissues because there are, there are similar mechanism that is, it's always the same genes that are involved in the regulation that just interact with each other in different ways, and it's just interesting to understand what makes each stem cell be a stem, but then ultimately a stem cell in a different tissue. So giving rise to a different protein.

בידוד והשתלות של בתאי גזע hematopoietic (HSCs)

Isolation and Animal Serum Free Expansion of Human Umbilical Cord Derived Mesenchymal Stromal Cells (MSCs) and Endothelial Colony Forming Progenitor Cells (ECFCs)

The umbilical cord is a rich source for progenitor cells with high proliferative potential including mesenchymal stromal cells (also termed mesenchymal stem cells, MSCs) and endothelial colony forming progenitor cells (ECFCs). Both cell types are key players in maintaining the integrity of tissue and are probably also involved in regenerative processes and tumor formation.
To study their biology and function in a comparative manner it is important to have both cells types available from the same donor. It may also be beneficial for regenerative purposes to derive MSCs and ECFCs from the same tissue.
Because cellular therapeutics should eventually find their way from bench to bedside we established a new method to isolate and further expand progenitor cells without the use of animal protein. Pooled human platelet lysate (pHPL) replaced fetal bovine serum in all steps of our protocol to completely avoid contact of the cells to xenogeneic proteins.
This video demonstrates a methodology for the isolation and expansion of progenitor cells from one umbilical cord.
All materials and procedures will be described.

Isolation and Animal Serum Free Expansion of Human Umbilical Cord Derived Mesenchymal Stromal Cells MSCs and Endothelial Colony Forming Progenitor Cells ECFCs

This protocol describes the isolation and subsequent expansion of mesenchymal stromal cells and endothelial colony forming cells without the use of animal serum to generate autologous pairs for experimental transplantation purposes.

בידוד בעלי חיים הרחבת חינם סרום של טבורי האדם נגזר תאים סטרומה mesenchymal (MSCs) ו האנדותל יצירת המושבה ובתאים (ECFCs)

The umbilical cord is a rich source for progenitor cells with high proliferative potential including mesenchymal stromal cells (also termed mesenchymal ...

Isolation and Derivation of Mouse Embryonic Germinal Cells

The ability of embryonic germinal cells (EG) to differentiate into primordial germinal cells (PGCs) and later into gametes during early developmental stages is a perfect model to address our hypothesis about cancer and infertility. This protocol shows how to isolate primordial germinal cells from developing gonads in 10.5-11.5 days post coitum (dpc) mouse embryos.  Developing gonadal ridges from mouse embryos (C57BL6J) were dissociated by mechanical disruption with collagenase, then plated in a mouse embryo fibroblast feeder layer (MEF-CF1) that was previously mitotically inactivated with mitomycin C in the presence of knockout media and supplemented with Leukemia Inhibitor Factor (LIF), basic Fibroblast Growth Factor (bFGF), and Stem Cell Factor (SCF).  Using these optimized methods for PCG identification, isolation, and establishment of culture conditions permits long term cultures of EG cells for more than 40 days.  The embryonic germinal cell lines showed embryonic phenotype and expression of common used markers of the pluripotent state.  Isolation and derivation of germinal cells in culture provide a tool to understand their development in vitro and offer the opportunity to monitor cumulative damage at genetic and epigenetic levels after exposure to oxidative stress.

The ability of embryonic germinal cells to differentiate into primordial germinal cells during early development stages is a perfect model to address our hypothesis about cancer and infertility. This protocol shows how to isolate primordial germinal cells from developing gonads in 10.5-11.5 days post coitum mouse embryos.

בידוד גזירת תאים עובריים בעכבר ז&#39;רמינל

The ability of embryonic germinal cells (EG) to differentiate into primordial germinal cells (PGCs) and later into gametes during early developmental ...

Isolation &#38; Characterization of Hoechstlow CD45negative Mouse Lung Mesenchymal Stem Cells

Tissue resident mesenchymal stem cells (MSC) are important regulators of tissue repair or regeneration, fibrosis, inflammation, angiogenesis and tumor formation. Taken together these studies suggest that resident lung MSC play a role during pulmonary tissue homeostasis, injury and repair during diseases such as pulmonary fibrosis (PF) and arterial hypertension (PAH). Here we describe a technology to define a population of resident lung MSC. The definition of this population in vivo pulmonary tissue using a define set of markers facilitates the repeated isolation of a well-characterized stem cell population by flow cytometry and the study of a specific cell type and function.

Isolation & Characterization of Hoechstlow CD45negative Mouse Lung Mesenchymal Stem Cells

In this article we demonstrate the isolation of murine resident lung mesenchymal stem cells (lung MSC), their expansion, characterization and analysis of immunomodulatory properties.

בידוד &amp; אפיון Hoechst נמוך CD45 שלילי עכבר mesenchymal ריאות בתאי גזע

Tissue resident mesenchymal stem cells (MSC) are important regulators of tissue repair or regeneration, fibrosis, inflammation, angiogenesis and tumor ...

Isolation and Primary Culture of Rat Hepatic Cells

Primary hepatocyte culture is a valuable tool that has been extensively used in basic research of liver function, disease, pathophysiology, pharmacology and other related subjects. The method based on two-step collagenase perfusion for isolation of intact hepatocytes was first introduced by Berry and Friend in 1969 1 and, since then, has undergone many modifications. The most commonly used technique was described by Seglenin 1976 2. Essentially, hepatocytes are dissociated from anesthetized adult rats by a non-recirculating collagenase perfusion through the portal vein. The isolated cells are then filtered through a 100 &mu;m pore size mesh nylon filter, and cultured onto plates. After 4-hour culture, the medium is replaced with serum-containing or serum-free medium, e.g. HepatoZYME-SFM, for additional time to culture. These procedures require surgical and sterile culture steps that can be better demonstrated by video than by text. Here, we document the detailed steps for these procedures by both video and written protocol, which allow consistently in the generation of viable hepatocytes in large numbers.

Primary hepatocytes provide a valuable tool to evaluate biochemical, molecular, and metabolic functions in a physiologically relevant experimental system. We describe a reliable protocol for rat in situ liver perfusion, which consistently generates viable hepatocytes up to 1.0 &times; 108 cells per preparation with cell viability between 88 ~ 96%.

בידוד תרבות ראשונית של תאים בכבד עכברוש

Primary hepatocyte culture is a valuable tool that has been extensively used in basic research of liver function, disease, pathophysiology, pharmacology ...

Induction and Analysis of Epithelial to Mesenchymal Transition

Epithelial to mesenchymal transition (EMT) is essential for proper morphogenesis during development. Misregulation of this process has been implicated as a key event in fibrosis and the progression of carcinomas to a metastatic state. Understanding the processes that underlie EMT is imperative for the early diagnosis and clinical control of these disease states. Reliable induction of EMT in vitro is a useful tool for drug discovery as well as to identify common gene expression signatures for diagnostic purposes. Here we demonstrate a straightforward method for the induction of EMT in a variety of cell types. Methods for the analysis of cells pre- and post-EMT induction by immunocytochemistry are also included. Additionally, we demonstrate the effectiveness of this method through antibody-based array analysis and migration/invasion assays.

A straightforward method is described for the induction of epithelial to mesenchymal transition (EMT) in a variety of cell types. Methods for the analysis of cells in EMT states by immunocytochemistry are included.

אינדוקציה וניתוח של אפיתל לmesenchymal מעבר

Epithelial  to mesenchymal transition (EMT) is essential for proper morphogenesis during  development. Misregulation of this  process has been implicated ...

Manual Isolation of Adipose-derived Stem Cells from Human Lipoaspirates

In 2001, researchers at the University of California, Los Angeles, described the isolation of a new population of adult stem cells from liposuctioned adipose tissue that they initially termed Processed Lipoaspirate Cells or PLA cells. Since then, these stem cells have been renamed as Adipose-derived Stem Cells or ASCs and have gone on to become one of the most popular adult stem cells populations in the fields of stem cell research and regenerative medicine. Thousands of articles now describe the use of ASCs in a variety of regenerative animal models, including bone regeneration, peripheral nerve repair and cardiovascular engineering. Recent articles have begun to describe the myriad of uses for ASCs in the clinic. The protocol shown in this article outlines the basic procedure for manually and enzymatically isolating ASCs from large amounts of lipoaspirates obtained from cosmetic procedures. This protocol can easily be scaled up or down to accommodate the volume of lipoaspirate and can be adapted to isolate ASCs from fat tissue obtained through abdominoplasties and other similar procedures.

In 2001, researchers at UCLA described the isolation of a population of adult stem cells, termed Adipose-derived Stem Cells or ASCs, from adipose tissue. This article outlines the isolation of ASCs from lipoaspirates using a manual, enzymatic digestion protocol using collagenase.

בידוד ידני של תאי גזע שמקורם בשומן מLipoaspirates האדם

In 2001, researchers at the University of  California, Los Angeles, described the isolation of a new population of adult  stem cells from liposuctioned ...

Isolation, Culture, and Transplantation of Muscle Satellite Cells

Muscle satellite cells are a stem cell population required for postnatal skeletal muscle development and regeneration, accounting for 2-5% of sublaminal nuclei in muscle fibers. In adult muscle, satellite cells are normally mitotically quiescent. Following injury, however, satellite cells initiate cellular proliferation to produce myoblasts, their progenies, to mediate the regeneration of muscle. Transplantation of satellite cell-derived myoblasts has been widely studied as a possible therapy for several regenerative diseases including muscular dystrophy, heart failure, and urological dysfunction. Myoblast transplantation into dystrophic skeletal muscle, infarcted heart, and dysfunctioning urinary ducts has shown that engrafted myoblasts can differentiate into muscle fibers in the host tissues and display partial functional improvement in these diseases. Therefore, the development of efficient purification methods of quiescent satellite cells from skeletal muscle, as well as the establishment of satellite cell-derived myoblast cultures and transplantation methods for myoblasts, are essential for understanding the molecular mechanisms behind satellite cell self-renewal, activation, and differentiation. Additionally, the development of cell-based therapies for muscular dystrophy and other regenerative diseases are also dependent upon these factors.

However, current prospective purification methods of quiescent satellite cells require the use of expensive fluorescence-activated cell sorting (FACS) machines. Here, we present a new method for the rapid, economical, and reliable purification of quiescent satellite cells from adult mouse skeletal muscle by enzymatic dissociation followed by magnetic-activated cell sorting (MACS). Following isolation of pure quiescent satellite cells, these cells can be cultured to obtain large numbers of myoblasts after several passages. These freshly isolated quiescent satellite cells or ex vivo expanded myoblasts can be transplanted into cardiotoxin (CTX)-induced regenerating mouse skeletal muscle to examine the contribution of donor-derived cells to regenerating muscle fibers, as well as to satellite cell compartments for the examination of self-renewal activities.

The isolation and culture of a pure population of quiescent satellite cells, a muscle stem cell population, is essential to the understanding of muscle stem cell biology and regeneration, as well as stem cell transplantation for therapies in muscular dystrophy and other degenerative diseases.&#160;

בידוד, תרבות והשתלה של תאי לווין שריר

Muscle satellite cells are a stem cell population required for postnatal skeletal muscle development and regeneration, accounting for 2-5% of sublaminal ...

Isolation and Culture of Dental Epithelial Stem Cells from the Adult Mouse Incisor

Understanding the cellular and molecular mechanisms that underlie tooth regeneration and renewal has become a topic of great interest1-4, and the mouse incisor provides a model for these processes. This remarkable organ grows continuously throughout the animal&#39;s life and generates all the necessary cell types from active pools of adult stem cells housed in the labial (toward the lip) and lingual (toward the tongue) cervical loop (CL) regions. Only the dental stem cells from the labial CL give rise to ameloblasts that generate enamel, the outer covering of teeth, on the labial surface. This asymmetric enamel formation allows abrasion at the incisor tip, and progenitors and stem cells in the proximal incisor ensure that the dental tissues are constantly replenished. The ability to isolate and grow these progenitor or stem cells in vitro allows their expansion and opens doors to numerous experiments not achievable in vivo, such as high throughput testing of potential stem cell regulatory factors. Here, we describe and demonstrate a reliable and consistent method to culture cells from the labial CL of the mouse incisor.

The continuously growing mouse incisor provides a model for studying renewal of dental tissues from dental epithelial stem cells (DESCs). A robust system for consistently and reliably obtaining these cells from the incisor and expanding them in vitro is reported here.

בידוד והתרבות של תאי גזע השיניים אפיתל ממבוגרי העכבר הארקטיק

Understanding the cellular and molecular mechanisms that underlie tooth regeneration and renewal has become a topic of great interest1-4, and the mouse ...

Isolation of CD146+ Resident Lung Mesenchymal Stromal Cells from Rat Lungs

Mesenchymal stromal cells (MSCs) are increasingly recognized for their therapeutic potential in a wide range of diseases, including lung diseases. Besides the use of bone marrow and umbilical cord MSCs for exogenous cell therapy, there is also increasing interest in the repair and regenerative potential of resident tissue MSCs. Moreover, they likely have a role in normal organ development, and have been attributed roles in disease, particularly those with a fibrotic nature. The main hurdle for the study of these resident tissue MSCs is the lack of a clear marker for the isolation and identification of these cells. The isolation technique described here applies multiple characteristics of lung resident MSCs (L-MSCs). Upon sacrifice of the rats, lungs are removed and rinsed multiple times to remove blood. Following mechanical dissociation by scalpel, the lungs are digested for 2-3 hr using a mix of collagenase type I, neutral protease and DNase type I. The obtained single cell suspension is subsequently washed and layered over density gradient medium (density 1.073 g/ml). After centrifugation, cells from the interphase are washed and plated in culture-treated flasks. Cells are cultured for 4-7 days in physiological 5% O2, 5% CO2 conditions. To deplete fibroblasts (CD146-) and to ensure a population of only L-MSCs (CD146+), positive selection for CD146+ cells is performed through magnetic bead selection. In summary, this procedure reliably produces a population of primary L-MSCs for further in vitro study and manipulation. Because of the nature of the protocol, it can easily be translated to other experimental animal models.

Isolation of CD146+ Resident Lung Mesenchymal Stromal Cells from Rat Lungs

This protocol describes an isolation technique for obtaining primary lung resident mesenchymal stromal cells from rats, through the use of enzymatic digestion, density gradient separation, plastic adherence and CD146+ magnetic bead selection.

בידוד של CD146<sup&gt; +</sup&gt; תאי סטרומה mesenchymal ריאות התושב מריאות העכברוש

Mesenchymal stromal cells (MSCs) are increasingly recognized for their therapeutic potential in a wide range of diseases, including lung diseases. Besides ...