JJPC is supported by a Canadian Institutes of Health Research (CIHR) postdoctoral fellowship. MAM receives a merit scholarship from the German National Academic Foundation - Studienstiftung des Deutschen Volkes and is supported by a grant from the EFCNI (European Foundation for the Care of the Newborn Infant). BT is supported by CIHR, the Canadian Lung Association, the Stem Cell Network and the Children's Hospital of Eastern Ontario Research Institute.

כל ההליכים אושרו על ידי ועדת טיפול בבעלי חיים של אוניברסיטת אוטווה (פרוטוקול אתיקה חיה Ohri-1696). טיפול בחיות בוצעו בהתאם להנחיות מוסדיות. 1. בידוד של תאים סטרומה mesenchymal ריאות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מכינים את תערובת האנזים בתוך שפופרת 50 מ&quot;ל: לשקול 30 פרוטאז U Neutral, 2,500 U Collagenase ואני 500 U DNAse I. סכומים אלו להספיק הריאות של עכבר בוגר או גור חולדה. כן ביום של בידוד ולאחסן ב 4 ° C עד שימוש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> גורי חולדה הקורבן ביום 13 על ידי הזרקה תוך הצפק של נתרן pentobarbital (0.2 מ&quot;ל, 65 מ&quot;ג / מ&quot;ל). השתמש רפלקס קמצוץ הבוהן להקים הכרה. מוות של חיה מובטח על ידי פתיחת חזה, כמפורט להלן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לטהר את העור על ידי ריסוס החיה עם 70% אתנול ו בזהירות לפתוח את בית החזה באמצעות מספריים כירורגיות, החל מהשעה הסרעפת חיתוך כלפי הצד מקורי, נזהר מאוד לאלפגוע ריאות. מורחים את בית החזה פתוח באמצעות מלחציים עוצר דמום, או לחילופין לחתוך את בית החזה כדי לספק גישה החזה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ולגרום לדימום מחודש את החיה על ידי הסרת הלב. כדי להסיר את הלב, לתפוס את התימוס והלב עם מלקחיים קטנים וחותכים ממנו אלה עם מספריים כירורגיות. מייד לאחר מכן, לספוג את הדם עם תחבושת עד אין יותר דם יוצא של האאורטה הכרותה ואת עורק הריאה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את הריאות מן החזה כדלקמן: להחזיק את קנה הנשימה עם מלקחיים קטנים, ואז לנתק את קנה הנשימה עם מספרי כירורגיות בצד המקורי. תוך משיכת החבילה ריאות בעדינות מתוך בית החזה, לחתוך את כל רקמת החיבור בצד הגבי לאורך בית החזה כדי לשחרר את הריאות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנתק את הריאות מן האאורטה והוושט ידי חיתוך לאורך הסרעפת עם מספריים כירורגיות. עכשיו כי ריאות חופשיות לחלוטין מן החזה להסיר כל דם שנותר בעדינות עם גזה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את קנה הנשימה הסמפונות עם surgical מספריים ובזהירות להעביר האונות ריאות לצינור 50 מ&quot;ל המכיל קר 35 מ&quot;ל 30% ציטראט-פוספט דקסטרוז אדנין (CPDA-1) נוגד קרישה (מימית ציטראט Trisodium 26.30 גרם, 3.27 גרם מונוהידראט חומצה אסקורבית, 2.22 גרם פוספט dihydrogen גלוטמט, 31.80 גרם D- גלוקוז, 0.275 גרם אדנין ב 1 L מטוהרים H 2 O; סינון סטרילי הפתרון באמצעות מסנן הממברנה 0.22 מיקרומטר לפני השימוש) ב בופר פוספט (PBS) כדי להסיר דם ופסולת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר השטיפה 5 דקות ב -30% CPDA-1 / PBS, להעביר את הריאה לצינור חדש 50 מ&quot;ל המכיל 35 מ&quot;ל בופר פוספט סטרילית (PBS) (RT), להפוך בעדינות כדי להסיר ציטראט. העברה אל צינור המכיל 35 מ&quot;ל + PBS של Dulbecco נתרן-פירובט + גלוקוז (DPBS ++) (RT). כל שלב שטיפה אמור לקחת בערך 5 דקות. הערה: DPBS ++ ניתן להזמין מסחרית או מורכב כדלקמן 21: סידן כלוריד dihydrate 132.4 מ&quot;ג, hexahydrate מגנזיום כלוריד 100 מ&quot;ג, אשלגן כלורי (נטול מים) 200 מ &#39;g, monobasic פוספט אשלגן (נטול מים) 200 מ&quot;ג, נתרן כלורי (נטול מים) 8,000 מ&quot;ג, dibasic פוספט נתרן (נטול מים) 1,144.5 מ&quot;ג, מ&quot;ג D- גלוקוז 1000, פירובט נתרן 36 מ&quot;ג L 1 7.3 מטוהרים H 2 O, pH. סינון סטרילי הפתרון באמצעות מסנן הממברנה 0.22 מיקרומטר לפני השימוש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ממיסים את תמהיל האנזים על ידי הוספת 10 מ&quot;ל DPBS ++ (מחומם מראש ל 37 מעלות צלזיוס) ואת היפוך בעדינות עד שהיא נמסה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעבירים את הריאות לצינור 50 מ&quot;ל חדש וקוצצים את הריאות על הקיר של הצינור באמצעות אזמל עד טחון דק. מוסיפים את תערובת אנזים לרקמה (10 מ&quot;ל תערובת אנזים / לכל עכבר מבוגר / הגור עכברוש ריאות), לסגור את הצינור בחוזקה לדגור על 38 מעלות צלזיוס עם תסיסה עדינה (או במיקסר תרמית, באמבט מים רועד, או מים אמבטיה עם תסיסה ידנית קבוע). המשך תלוי בסוג של רקמות: דקות 60 רקמות עוברות, הדקה לנוער / מבוגרי רקמות 90-120, רקמה הבוגרת fibrotic 120-150 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עצור את מערכת העיכול על ידי chelating קטיונים דו ערכי wה- i 200 μl ethylenediaminetetraacetic חומצה (EDTA, 0.15 M, pH 7.4. סינון סטרילי הפתרון באמצעות מסנן הממברנה 0.22 מיקרומטר לפני השימוש). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 20 מ&quot;ל 5% בסרום שור עוברית (FBS) / PBS ולהעביר את ההשעיה כולו דרך מסננת 100 מיקרומטר התא לתוך צינור חדש 50 מ&quot;ל. יש לשטוף את מסננת צינור ותא עם 10 מ&quot;ל 5% FBS / PBS, מביא את הנפח הכולל עד 40 מ&quot;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגות במשך 5 דקות ב 500 XG, RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את supernatant (גלולה צריך להיות ברור לעין), resuspend ב 40 מ&quot;ל 5% FBS / PBS וחזור על שלב צנטריפוגה 1.13. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend ב FBS 4 מ&quot;ל 5% / PBS (RT) ואת שכבת בזהירות מעל 3 מדיה שיפוע צפיפות מ&quot;ל (1.073 g / ס&quot;מ 3) בצינור 15 מ&quot;ל 14. לקבלת שלבים טובים, חשוב כי השכבות של השעית התא הבודדה מתרחשות בזווית&gt; 45 ° במהירות מאוד נמוכה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה 20 דקות ב 900 XG, בינוני (5/10) תאוצה, לא האטה, 19 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אוספים את התאים המצויים בterphase resuspend אותם 10 מ&quot;ל סטרילי PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה במשך 5 דקות ב 500 XG, 21 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את supernatant ו resuspend התא גלולה ב 10 מ&quot;ל בינוני תרבות מחומם מראש הושלמה L-MSC (Eagle התקשורת חיוני מינימום, שינוי אלפא (αMEM), בתוספת 2 מילימול L-גלוטמין לכל 500 מ&quot;ל αMEM, 20% בנפח / FBS כרך ו -1% כרך / כרך פניצילין / סטרפטומיצין / Amphotericin ב </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 1.18 צעד צנטריפוגה חוזר. בהמשך לכך, הסר supernatant ו resuspend ב 10 מ&quot;ל מחומם מראש בינוני תרבות טריים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספירת תאים באמצעות hemocytometer או נגד תא אוטומטי צלחת בצפיפות גבוהה, שכן רוב התאים בשלב זה הם לא חסיד פלסטיק. צפיפות הציפוי מדויקת תלוי מזני חי הגיל, למשל, תאים של ריאות עכבר בוגרות הם זורעים ב 10 5 תאים / 2 סנטימטר, ואילו תאים מפני ריאת גור עכברוש הם צפופים מספיק בצפיפות זריעה של 1-2 x 10 4 תאים / 2 ס&quot;מ </sup&gt;. השתמש 0.2 מ&quot;ל בינוני תרבות L-MSC / 2 ס&quot;מ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> L-MSCs תרבות באווירה 5% O 2, 5% CO 2 humidified על 37 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שנה בינונית 24 שעות לאחר הזריעה הראשונית, ולאחר מכן כל 3 ימים אחרי שטיפת פעם עם PBS. תאים צריכים להיות מתורבת עד 80-90% המפגש, אשר לוקח 3-5 ימים בממוצע תלוי החיה המוצא. מפגש גבוה יקדם בידול לתוך פיברובלסטים. </li></ol> בחירת 2. של CD146 + mesenchymal ריאות סטרומה תאים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ציפוי של חרוזים מגנטיים עם נוגדנים משני <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעיל חרוזים מגנטיים עם נוגדנים משני biotinylated, ביחס של 10 מיקרוגרם חרוזים משני נוגדן / 100 μl מגנטי בתוך תחתית עגולה 2 סטרילי מ&quot;ל cryovial בתנאים סטריליים. השתמש 10 μl נוגדנים משני לכל צפוי 0.5 x 10 6 תאים, ולהשתמש מינימום של 100 μl חרוזים מגנטיים 10 נוגדן מיקרוגרם. הערה: היחס שלtibodies בשימוש לכל נפח של חרוזים עשויים להיות שונים בין יצרנים, יש לבדוק את הוראות היצרן עבור החרוזים של בחירה. עבור פרוטוקול זה, עיין בטבלה 1 עבור חרוזים ונוגדנים ששימשו אופטימיזציה של פרוטוקול זה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה במיקסר מדגם סיבוב במשך 30 דקות ב 30 סיבובים / min (סל&quot;ד), ב RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend את החרוזים 1.5 מ&quot;ל אלבומין 0.1% סטרילי בסרום שור (BSA) / PBS ולהעביר צינור עגול 3 מ&quot;ל התחתונה (cytometry זרימה בצינור). שוטפים את cryovial עם 0.1% BSA / PBS 1.5 מ&quot;ל נוספים ולהעביר אל הצינור 3 מ&quot;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את הצינור על מגנט המתאים ולהמתין 2 דקות עד שכל חרוזים מחוברים אל הקיר האחורי של הצינור והפתרון שרידים ברורים. הסר לשטוף נגר וחזור עם 3 מ&quot;ל 0.1% BSA / PBS פעמיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend את החרוזים 3 מ&quot;ל 0.1% BSA / PBS ולאחסן ב 4 ° C, מוגן מפני אור. יש להשתמש תוך 5 ימים. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תוויות CD146 + L-MSCs<ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קציר תאי mesenchymal לאחר השטיפה עם PBS באמצעות פתרון שאינו טריפסין עדין. הערה: כרכים תלוי בגודל של בקבוק תרבות (0.2 מ&quot;ל / ס&quot;מ 2 בינוני או PBS). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר בינוני תרבות לשטוף תאים שלוש פעמים עם PBS סטרילית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף נפח מתאים של פתרון שאינו טריפסין עדין (ראו טבלה 1). לדגור על 37 מעלות צלזיוס בחממה עד התאים יש המנותקים, כ 10 דקות בעת שימוש הפתרון בטבלה 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להשבית את האנזים על ידי הוספת בינוני תרבות L-MSC, צנטריפוגות במשך 5 דקות ב g 500 x. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר supernatant, תאי resuspend ב 0.1% BSA / PBS ולספור את התאים עם hemocytometer או נגד תא אוטומטי. הערה: נפח של 0.1% BSA / PBS תלוי בגודל של בקבוק תרבות: לשאוף 5 או 10 מ&quot;ל 0.1% BSA / PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על שלב 2.2.2 ו resuspend הסכום הייעודי של התאים 3 מ&quot;ל 0.1% BSA / PBS (בלוקים unאתרי קישור ספציפיים שומר על התאים בחיים). שמור את התאים על הקרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כן 3 מיליליטר עגול צינור תחתון עם הנוגדן אנטי CD146 העיקרי, ולשמור על קרח. הערה: ריכוז הנוגדן ראשוני זה יתווסף הסכום הייעודי של תאים תלויים הנוגדן המשמש. עבור נוגדן CD146 אנטי עכברוש הציע ר &#39;טבלה 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מוסיף את הנפח הכולל של תאים משלבים 2.2.3 אל צינור עם הנוגדן הראשוני. סוגרים היטב דגירה 30 דקות על מיקסר מדגם מסתובב ב 15 סל&quot;ד, 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה התאים למשך 5 דקות ב 500 XG, 4 ° C, להסיר תא גלולה supernatant ו resuspend ב 3 מ&quot;ל 0.1% BSA / PBS. צעד צנטריפוגה חוזר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend התאים הפתרון 3 מ&quot;ל המכילה חרוזים משני מצופה נוגדן שהוכן על פי ההוראות בסעיף 2.1 ו דגירה 30 דקות על מיקסר מדגם מסתובב ב 15 סל&quot;ד, 4 ° C. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחירת CD146 + L-MSCs<ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את הצינור המכיל את שכותרתו CD146 + L-MSCs על המגנט. התאים החיוביים יצוירו לחלק אחורי של צינור. מבלי להזיז את הצינור או נגיעה החרוזה, לקצור את supernatant עם התאים שהליליים לאט עם פיפטה פסטר סטרילית (אלה יכולים להיות שנאספו או מושלכים מבוססים על עיצוב ניסיוני). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את הצינור מתוך המגנט resuspend התאים BSA 3 מ&quot;ל 10% / PBS. חזור על הליך הבחירה מתואר בשלב 2.3.1. ארבע פעמים יותר (צעדי בחירת Σ 5). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend את CD146 + L-MSCs במדיום תרבות מחומם מראש L-MSC ולחזור המגנט. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר supernatant, resuspend במדיום תרבות L-MSC צלחת בתוך בקבוק תרבות בגודל מתאים (0.2 מ&quot;ל / 2 ס&quot;מ). ככלל אצבע, תאי צלחת בבקבוק אותה תרבות הגודל שממנו התאים הוסרו לפני בחירת חרוז. מספר CD146 + L-MSCs, ולכן צפיפות ציפוי, יהיהתלוי בגיל, מין ומתח של החיה מקור. תמיד לשאוף צפיפות ציפוי של ~ 5,000 תאים / 2 ס&quot;מ. הערה: החרוזים לא יפריע גדילת התא ייעלמו בהדרגה כמו התאים להתרבות. </li></ol></li></ol> 3. תאים מקפיאים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש בתקשורת ההקפאה הבאה: 60% פתרון pentastarch (pentastarch 10% ב 0.9% NaCl), 20 FBS%, 12.5% ​​CPDA-1, 2.5% NaCl (0.9%), sulfoxide דימתיל 5% (DMSO) 22. הערה: אם לא כל החומרים זמינים, בתמיסה המכילה DMSO 5%, 30% FBS ו 65% αMEM היא אלטרנטיבה טובה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאים Resuspend ב 0.5 x 10 6 תאים / מ&quot;ל, aliquot ב cryovials של 1 מ&quot;ל כל ולהקפיא O / N ב -80 ° C באמצעות מיכל הקפאה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעבירים מיכל אחסון חנקן נוזלי למחרת. </li></ol> 4. תאי פשרה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להפשיר בקבוקון של תאים בתוך אמבט מים 37 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאים Resuspend ב 10 מ&quot;לבינוני ו צנטריפוגות התרבות מחומם מראש במשך 5 דקות ב 500 XG, 21 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר supernatant ו resuspend התא גלולה במדיום תרבות 10 מ&quot;ל. תאי זרע בתוך תרבית תאים כובע פרקו מטופלים צלוחיות ב 5000 תאים / 2 ס&quot;מ במדיה 0.2 מ&quot;ל / cm2 (למשל, 15 מ&quot;ל עבור בקבוק 75 ס&quot;מ 2). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התרבות תאים ב 5% O 2, 5% CO 2 עד ומחוברות 80-90% לקציר ו / או שימוש ניסיוני. יתר confluency יהיה להשרות התמיינות. כאשר זריעה ב 5000 תאים / 2 ס&quot;מ, L-MSCs יגיעו 80-90% confluency בתוך 3-4 ימים של תרבות. </li></ol>

The authors have nothing to disclose.

הבידוד והתרבות של L-MSCs העיקרי מהווה הזדמנות כדי להבין טוב יותר את תפקידם ואת האינטראקציה שלהם עם אוכלוסיות תאים אחרים ברמה התאית, ותפקידם בהתפתחות הריאות, בבריאות ובחולי. זה חשוב במיוחד כאשר חוסר סמן ספציפי אחד של תאים אלה עושה את זה כמעט בלתי אפשרי ריבויים באתרו. כמו בכל אוכלוסיות תאים ראשוניים, יש לזכור כי תאים אלה נוטים יותר לשנות את האופי שלהם ככל שהם נשמרים תרבות 19 (הנסקרת ב 24). כדי לשמור L-MSCs במצב כי הוא קרוב ככל האפשר למצב הטבעי שלהם, זה חשוב מאוד כי הם בתרבית 5% O 2, 5% CO 2, חממה humidified 37 ° C. בפיזיולוגית נשימה מקובלת כי בהתבסס על החוק של לחצים חלקיים של דלטון, לחץ החמצן החלקי של אוויר סביבה (21% O 2) הוא 160 מ&quot;מ כספי, ויורד ל ~ 101 מ&quot;מ כספי במרחב אווירי המכתשית 25-27. בשנת ריאה בוגרת השיפוע 2 פאו עורקים-המכתשים הוא ~ 3-4 מ&quot;מ כספי, אבל זה עשוי להיות עלה באופן משמעותי ריאה חולה או לא בוגרת שמרחק עורקים-המכתשים הוא גדל 25,28. בתוך הגוף, גומחת mesenchymal חשוף בדרך כלל ריכוז חמצן של 2-8% 29,30. רק כמה ניירות למעשה מדדו את PO 2 בתוך הריאות, אך מחקר אחד נמדד זה בתוך הריאות של 20 חולים, איתור טווח בריאה נורמלי PO 2 מ 23 כדי 656 מ&quot;מ כספית, עם חציון של 42.8 מ&quot;מ כספית 27,31. על פי החוק של דלטון, חממה humidified עם טמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס, 5% O 2 יש PO 2 של ~ 36 מ&quot;מ כספית, אשר נופל לגמרי בטווח נמדד רקמת הריאה נורמלי מאוד קרוב לחציון. בנוסף, תנאי תרבות נמוך חמצן לקדם את התחזוקה של אוכלוסיות אב בתרבות 29. יחדיו, זה אניקשה לדעת בדיוק מה ריכוז L-MSCs חמצן נחשף באתרו בשלבים שונה במהלך התפתחות או מחלה לאחר לידה רגילות, אך נראה כי 5-10% O 2 צפוי המדויק ביותר מנקודת המבט פיזיולוגית 27,31. בהתבסס על המידע שהובא לעיל, בחרנו לקיים 5% O 2 בתנאי תרבותנו, ומצאנו כי כאשר התנאים הללו נשמרים במבחנה, L-MSCs יגדל מהר, להציג סיבי מתח פחות, ויש סבירות קטנה יותר בידול או הזדקנות ספונטני. גורמים נוספים שימנעו התמיינות ספונטנית או מומים אחרים הוא באמצעות סוכן דיסוציאציה הלא טריפסין עדין passaging, passaging-MSCs L כאשר הם מגיעים 80-90% confluency (תנאי צפוף יקדם בידול פיברובלסטים), והשמירה על מספר המעבר הנמוך (&lt;P4). במחקר שנערך על ידי הופמן ועמיתיו, טריפסין הוצגה להיות השפעות שליליות על תפקוד L-MSCs ופנוטיפ, ואילו סוכני דיסוציאציה חינם-טריפסין יכול לשמר 13 זה. כדי לייעל את התשואה במהלך תהליך הבידוד, חשוב לרכך את הריאות כמו דק ככל האפשר, תוך התחשבות כי הרקמה לא צריך להיות מותר יבש. במהלך העיכול אנזימטי, חשוב כי הצינורות הם נסערו לעתים קרובות אם לא באמצעות מכשיר רועד מחומם, כמו פיסות הרקמה תהיה משקעים לא יקבלו חשיפה אופטימלית של האנזימים. עוד צעד קריטי הוא הפרדת שיפוע הצפיפות: אם השכבות לא נעשתה לאט מאוד או בזווית &lt;45 °, זה יוביל הערבוב של שני הנוזלים במקום שכבות, שגרם להפסד של אוכלוסיית תא כולו. יתר על כן, צפיפות של מדיום שיפוע הצפיפות תלוי מאוד טמפרטורת הסביבה. בכל הטמפרטורה למעט 19 ° C (או RT), יגרום הפרדת שיפוע לא טובה או לא צפיפות. לעניין fמשתמשי uture של פרוטוקול זה הם שיש לנו מבודדי L-MSCs קיימא בהצלחה מריאות שנמסקו עד 24 שעות לפני הבידוד, ובלבד הריאות מאוחסנות ישירות תקשורת L-MSC קר על קציר, והמשיכו ב 4 מעלות צלזיוס. זה מאפשר תכנון ניסוי גמיש יותר, או אפילו משלוח של ריאות בין מעבדות שונות. התשואה דומה כלל לזו של ריאות שנקטפו זה עתה, ותאי לגדול באותה מידה. שינוי נוסף זה יהיה אפשרי, הוא להשתמש FACS במקום מבחר חרוז מגנטי, למרות שיטה זו מכפיפה את התאים יותר מתח כמו ההליך לוקח זמן יותר כתאים חשופים ללחצים במהירויות גבוהות, ונמלים את הסיכון לזיהום אם לא נעשה בתנאים סטריליים. החרוזים המגנטיים המשמשים כאן אינם מפריעים צמיחת תאים, ונעלמים תוך מספר ימים של תרבות. העדפת FACS או מיון חרוז מגנטי עשויה להיות תלויה גם על המתקנים זמיניםלמשתמש הקצה. בנוסף, ניתן יהיה לשנות בפרוטוקול זה כדי לבודד MSCs תושב מרקמות אחרות. במקרה זה יהיה חשוב להתאים את האנזימים לאיבר של עניין, שכן הרכב מטריקס משתנה בין איברים. מגבלה חשובה של רק באמצעות שיפוע הצפיפות ודבקות פלסטיק הבא לקבלת תאי mesenchymal, היא שהאוכלוסייה שתתקבל מכילה שני L-MSCs ו fibroblasts. בחירה עבור CD146 + תאים בתוקף תרופות למגבלה זו, אך למרות CD146 + הליך בחירה ואת תנאי culturing זהירים, אופי L-MSCs ואת ההשפעות של תרבית תאים במבחנה לעשות את זה בלתי אפשרי להימנע מידה מסוימת של הבידול לתוך פיברובלסטים. MSCs בכלל דווחו להכיל היררכיה של multipotency, שבו תאים בהמשך ההיררכיה לאבד פוטנציאל multilineage שלהם לאט עד שהם הופכים פיברובלסטים הבדיל סופני &lt;sup&gt; 23. ככל הנראה זה קורה גם בנישת L-MSC 4, ונראה להשתקף CD146 + אוכלוסייה בתרבית כפי שכבר קטע אחד לאחר בחירת CD146 + בערך 40% של תאים אבדו ביטוי CD146. בנוסף, באוכלוסיה זו יש רק 80% CD73 ו -40% ביטוי CD90. בחלקו, זה יכול להיות מוסבר על ידי ההיררכיה של multipotency MSC. זה יהיה אפשרי כי CD146 + לעבור התפשטות סימטרית, והוליד שני MSCs CD146 חיובי ושליליים, מובחן יותר, לתאי בת. MSCs תושב הבריאות עשויה גם סביר שצפויים יש פנוטיפ שונה במקצת ותפקוד מ MSCs במח העצם, שבו ההגדרה של CD73 וביטוי CD90 התבסס. החברה הבינלאומית טיפול בתא זיהתה כי לא כל MSCs להביע סמני MSC הקלסיים, כולל CD73 ו CD90, וכי הביטוי סמן פני השטח הוא לא דרך טובה ביותר להגדיר 32 MSCs. הדואריעילות CFU xceptionally גבוהה של ~ 70% מכלל האוכלוסייה CD146 + L-MSC תומכת בכך. בגלל אוכלוסיית CD146 + מבצעת טובה יותר בהתייחס למאפייני MSC מאשר באוכלוסיית mesenchymal הממוינת, המחברים לא עוד שאפיינו את CD146 - האוכלוסייה. אנו שאף להעשיר האוכלוסייה mesenchymal שלנו עם MSCs ו לרוקן אותם פיברובלסטים, אבל אנחנו לא טוענים כי מדובר באוכלוסייה נכון L-MSC בלבד. L-MSCs צפוי מאוד הטרוגנית, הוא במקורם, פנוטיפ ותפקוד. למרות CD146 הוא הודה נרחב להיות סמן של multipotency ב MSCs ו pericytes 16,17,33,34, מעט מאוד ידוע על האוכלוסייה CD146 + MSC in vivo. CD146 הוא מולקולת הידבקות תא שחשוב אנגיוגנזה ותפקוד תא האנדותל, ובא לידי הביטוי בתאי האנדותל, תאי שריר חלק, pericytes, MSCs ו- T לימפוציטים מסוג 15,16,35,36. בשנים האחרונותראיות, התפתחו כי MSCs מאכלס את נישת perivascular באיברים רבים, כמו CD146 + תאי שיתוף כתם עבור CD73 MSC-סמני CD105 37. ואכן, pericytes ו MSCs בתרבית יש פרופיל ביטוי גנים דומה מאוד 38, חיזוק לדעה כי MSCs נגזרת pericytes 4,39. למרות שאנו לא ביצעו immunohistochemical מנתח כדי לקבוע את המיקום של האוכלוסייה CD146 + L-MSC שלנו, זה מאוד סביר להניח כי הם גם יהיו ממוקמים במיקום perivascular. מחקרים עתידיים יהיה צורך לבדוק אם זה אכן המקרה. יתכן כי קבוצת המשנה של אוכלוסיית התא שלנו היא pericytes, אם כי יש לציין כי כל תאים נראים phenotypically דומה מאוד לאחר בחירת CD146 +. תאי סטרומה mesenchymal קשים לשמצת לזהות בשל חוסר סמן והמקיף יחיד. מחקרים שונים דיווחו שיטות שונות עבור בידודשל L-MSCs, הראו באופן משכנע כי אוכלוסיות תאים אלה דומים זה לזה ביחס ביטוי סמן MSC. בהתבסס על האפיון של CD146 + L-MSC כפי שהוצג כאן, אוכלוסיית CD146 + L-MSC דומה מאוד לאוכלוסיות L-MSC שדווחו בעבר כפי שהשיגו תוצאה או צורות שונות של FACS באמצעות סמני משטח הקשורים בתאי גזע כגון Sca -1, ABCG2 ו CD90. כשמשווים תולדה L-MSCs 13, CD146 + L-MSCs נראה שיש לך יכולת גדולה יותר להצמיח מושבות של תאים בודדים, המציין כי השיטה שלנו מניב מולטיפוטנטיים מועשר יותר באוכלוסייה L-MSC. יתרון זה נכון גם בהשוואה לשיטות שמבודדים L-MSCs מבוסס על CD90 7 או α הקולטן לגורם הצמיחה הנגזרות טסיות (PDGFRα) 40,41, כסמנים השטח הן גם לבחור עבור יותר lipofibroblasts הבדיל סופני המכתשית / פיברובלסטים מבניים לפיכך, אפשר רק סביר בדואר מזוהה בתאי סטרומה 20,42. לעומת זאת, הוא SCA-1 ו ABCG2 מתועד היטב סמנים מתואמים עם ביטוי stemness ו- MSC 9,43-46. ABCG2 + L-MSCs אולם יש אופי אנדותל יותר כפי שהם 99% חיובי עבור CD31 46, ואילו שיטת דיווח כאן בוחר נגד תאי אנדותל באמצעות שיפוע Ficoll ודבקות פלסטיק. היתרון העיקרי של שיטה שלנו לעומת פרוטוקול הבידוד המבוסס SCA-1 של 5,8 McQualter ועמיתיו הוא שזה נרחב החלים על מינים אחרים מאשר עכברים, שבו SCA-1 לא ניתן להשתמש. למרות זאת הוא מאוד מאתגר, כנראה קרוב על בלתי אפשרי, להשיג האוכלוסייה &quot;טהור&quot; של L-MSCs מן ריאה פיתוח או מבוגר מאוחר ולתחזק אותו במצב מובחן, הפרוטוקול המובא כאן מספק שיטה מהירה, אמינה, אחידה ועקבית של קבלת אוכלוסיית תא מועשרת ב מיל ריאות עצמי חידוש מולטיפוטנטייםMSCs הזיהוי. באמצעות שיטה זו תאפשר מחקר מוגדר יותר של תפקיד L-MSCs במגוון רחב של דגמי מחלה ותפקידם הריאה מתפתחת.

תאי סטרומה mesenchymal (MSCs) מוכרים יותר ויותר עבור הפוטנציאל הטיפולי שלהם במגוון רחב של מחלות, כולל מחלות ריאה. מלבד השימוש מח עצם MSCs טבורי עבור טיפול בתאי אקסוגניים, יש גם עניין גובר של תיקון פוטנציאל ההתחדשות של MSCs רקמות תושב. במהלך הפיתוח, לרבות הריאות, mesenchyme מהווה מקור חשוב של רמזים התפתחותית, ו MSCs תושב מועמד סביר להיות במרכז זה. יתר על כן, ראיות המתעוררים MSCs התושב מוטרדים במחלות מבוגרות, כולל 1,2 הסרטן ו -3 סיסטיק. המשוכה העיקרית לחקר MSCs רקמות תושב האלה היא חוסר סמן ברור עבור בידוד וזיהוי של תאים אלה 4. תא גזע אנטיגן-1 (SCA-1) זוהה בעכברים כסמן עבור מגוון רחב של תאי גזע רקמות, והוא יכול לשמש עבור בידוד של L-MSCs 5, אבל יש לצערילא ידוע orthologs במינים אחרים 6. חוקר דיווחתי במגוון שיטות בידוד שונה עבור בידוד של L-MSCs משתי רקמת ריאה או נוזל. אלה משתנה מתא מופעל קרינת מיון (FACS) שיטות המבוסס בחירה עבור CD31 - / CD45 - / CD90 + תאי 7, CD31 - / CD45 - / מולקולת הידבקות תא אפיתל (EpCAM) - / SCA-1 + תאי 8, התנגדות multidrug טרנספורטר ATP מחייבת קלטת G (ABCG2) תאים חיוביים 9 או בזרימה לצבוע Hoechst 33342 10, כדי דבקות פלסטיק 11,12 והגירה מתוך רקמות טחונות 13. היתרונות של שיטה המוצגת במסמך זה הוא פי כמה וכמה. באמצעות עיכול אנזימטי עדין שיפוע צפיפות 14, אחד מקבל את כל התאים של טווח צפיפות הכוללים MSCs אך אינם כוללים תאי אפיתל או האנדותל. הצעד הדבק הפלסטיק הבא מבטיח רק כי mesenchתאי ymal לדבוק ולהישאר בתרבות, ביטול לויקוציטים. והכי חשוב עם זאת, בשלב של בחירת CD146 + מאפשר החיסול פיברובלסטים, כמו תאים אלה אינם מבטאים CD146. ביטוי של מולקולת הידבקות תא CD146 מתואם חיובי עם multipotency, ולכן הוא סמן טוב על מנת לשרש פיברובלסטים מאוכלוסיית תא mesenchymal 15-19. זהו יתרון על פני שימוש CD90 כסמן בחירה, כפי שהוא לא מתבטא רק MSCs אלא גם lipofibroblasts 5,20. בפרוטוקול זה בחרנו במפורש מבחר חרוז מגנטי, כפי שהוא עדין על התאים, ואת ההליך כולו יכול להיעשות בתנאים סטריליים. יתרון חשוב נוסף של שיטת הבידוד הזה בניגוד לשיטת התולדה, הוא שזה מהיר יחסית, 6-10 ימיםלעומת חודש או יותר לשיטת התוצאה. שלושה עד חמישה ימים לאחר הבידוד הראשוני אוכלוסיית mesenchymal מוכנה CD146 + Sele גודל<html> ction; לאחר שלושה עד חמישה ימים אחר התאים + CD146 מוכנים לשמש בניסויים או אפשר להקפיא לשימוש מאוחר יותר. שעת תרבות הירד משפרת את איכות התאים כמו MSCs transdifferentiate כלפי פיברובלסטים בתרבות לשעבר ממושך vivo 19. לבסוף, בשל אופיו של פרוטוקול, אפשר ליישם את השיטה כדי מינים אחרים על ידי בחירת נוגדנים מתאימים, או אפילו מערכות איברים אחרות על ידי התאמת הבחירה של אנזימים לעיכול זמן דגירה. פרוטוקול מפורט של שיטת הבידוד הזה הוא כדלקמן, וכן סקירה סכמטית של הבידוד והבחירה הבאה של תת-האוכלוסייה + CD146 מסופקת באיור 1A ו -1 B בהתאמה. בנוסף, פרטים כלולים עבור passaging, הקפאה להפשרה תאים אלה. המודעה / 53,782 / 53782fig1.jpg &quot;/&gt; באיור 1. סקירה סכמטי של בידוד של תאים mesenchymal ריאתי (א) ו CD146 עוקבות + בחירת תא (B) מינ &#39;= דקות.; EDTA = חומצה Ethylenediaminetetraacetic; 2 nd Ab = נוגדנים משני; אלפא-CD146 Ab = העיקרי נוגדן אנטי CD146; תאי -ve = CD146 תאים שליליים; + יש תאים = תאים חיוביים CD146. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53782/53782fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a>

<table><tbody><tr><td>Neutral Protease</td><td>Worthington Biochemical Corporation</td><td>LS02104</td><td>Prepare on day of isolation and store at 4 &amp;deg;C until use</td></tr><tr><td>Collagenase I</td><td>Worthington Biochemical Corporation</td><td>LS004196</td><td>Prepare on day of isolation and store at 4 &amp;deg;C until use</td></tr><tr><td>DNAse I</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5025</td><td>Prepare on day of isolation and store at 4 &amp;deg;C until use</td></tr><tr><td>Pentobarbital sodium (Euthanyl)</td><td>Bimeda-MTC Animal Health Inc, Dublin, Ireland</td><td>-</td><td>Use 0.2 ml for rat pups between 20-30 g; larger animals may need more.</td></tr><tr><td>Dulbecco&amp;rsquo;s PBS + Sodium-pyruvate + Glucose</td><td>Life Technologies</td><td>14287-072</td><td>Very crucial to use this type of D-PBS, as the calcium and magnesium that are present in this D-PBS facilitate facilitate the enzymatic digestion</td></tr><tr><td>Ficoll-Paque PREMIUM (1.073 g/cm&lt;sup&gt;3&lt;/sup&gt;)</td><td>GE Healthcare</td><td>17-5446-52</td><td>Density gradient media. To obtain a good interphase, it is crucial that the layering of the single cell suspension occurs at a &gt;45&amp;deg; angle at very low speed, and that the subsequent centrifugation is done at 19 &amp;deg;C.</td></tr><tr><td>&amp;alpha;MEM</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M8042</td><td>Warm in 37 &amp;deg;C water bath before use</td></tr><tr><td>200 mM L-Glutamine</td><td>Life Technologies</td><td>25030-164</td><td></td></tr><tr><td>100x Antibiotic-Antimycotic</td><td>Life Technologies</td><td>15240-062</td><td>Penicillin/Streptomycin/Fungizone</td></tr><tr><td>M-280 Dynabeads</td><td>Life Technologies</td><td>11205D</td><td>Magnetic beads</td></tr><tr><td>biotinylated polyclonal rabbit-anti-mouse IgG</td><td>Dako, Agilent Technologies</td><td>E0464</td><td>Biotinylated secondary antibody that matches with the anti-rat CD146 antibody described below</td></tr><tr><td>DynaMag5-magnet</td><td>Life Technologies</td><td>12303D</td><td>Magnet that is recommended for use with Dynabeads. NOTE: magnet should be chosen based on the manufacturer&amp;rsquo;s instructions of the magnet beads of choice.</td></tr><tr><td>TrypLE express&amp;nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>12605-028</td><td>Gentle non-trypsin alternative, use 1 ml of TrypLE express/25 cm&lt;sup&gt;2&lt;/sup&gt; surface area. After detachment, 10 ml L-MSC culture medium is sufficient to inactivate 3 ml TrypLE</td></tr><tr><td>anti-rat CD146 antibody</td><td>Lifespan Biosciences Inc.</td><td>C35841</td><td>12.5 &amp;mu;l per 0.5 x 10&lt;sup&gt;6&lt;/sup&gt; cells</td></tr><tr><td>Pentaspan (pentastarch solution)</td><td>Bristol-Myers Squibb Canada</td><td>-</td><td>Can be obtained through local blood donation services or hematology departments. Alternatively, one could use the PSI 20% Pentastarch solution (Preservation Solutions, PST001) diluted 1:1 with 0.9% NaCl.</td></tr><tr><td>Mr. Frosty freezing container</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>5100-0001</td><td>Improves viability when freezing L-MSCs overnight at -80 &amp;deg;C</td></tr></tbody></table>

isolation of cd146+ resident lung mesenchymal stromal cells from rat lungs

תאי סטרומה mesenchymal (MSCs) מוכרים יותר ויותר עבור הפוטנציאל הטיפולי שלהם במגוון רחב של מחלות, כולל מחלות ריאה. מלבד השימוש מח עצם MSCs טבורי עבור טיפול בתאי אקסוגניים, יש גם עניין גובר של תיקון פוטנציאל ההתחדשות של MSCs רקמות תושב. יתר על כן, יש להם סיכוי תפקיד בהתפתחות איבר רגיל, יוחסו תפקידי מחלה, במיוחד אלה עם אופי fibrotic. המשוכה העיקרית לחקר MSCs רקמות תושב האלה היא חוסר סמן ברור עבור בידוד וזיהוי של תאים אלה. טכניקת הבידוד המתוארת כאן חלה מאפיינים מרובים של MSCs תושב ריאות (L-MSCs). עם הקרב של החולדות, ריאות יוסרו ושטף מספר פעמים כדי להסיר דם. בעקבות ניתוק מכני על ידי אזמל, הריאות מתעכלים במשך 2-3 שעות תוך שימוש בתמהיל שאני סוג collagenase, פרוטאז נייטרלי ואני סוג DNase obtaineהשעית תא בודד ד נשטפה לאחר מכן ו שכבתית מעל בינוני שיפוע צפיפות (צפיפות 1.073 גרם / מיליליטר). לאחר צנטריפוגה, תאים מן שלבי נשטפים מצופים צלוחיות תרבות שטופלה. הם תאים בתרבית עבור 4-7 ימים פיזיולוגיים 5% O 2, 5% CO 2 תנאים. כדי לרוקן פיברובלסטים (CD146 -) ולהבטיח אוכלוסייה של L-MSCs בלבד (CD146 +), סלקציה חיובית עבור תאי CD146 + מתבצע באמצעות מבחר חרוז מגנטי. לסיכום, הליך זה באופן מהימן מייצרת אוכלוסייה-MSCs L העיקרי למחקר נוסף במבחנה ומניפולציה. בגלל האופי של הפרוטוקול, זה יכול להיות מתורגם בקלות במודלים של בעלי חיים ניסיוניים אחרים.

שניים מן המאפיינים הפיזיים הכי אמין של MSCs, צפיפות ודבקות פלסטיק, משמשים בחלק הראשון של פרוטוקול זה כדי לקבל את החלק היחסי תא mesenchymal של הריאה המכיל L-MSCs. למרות שלבי שיפוע הצפיפות יכללו מונוציטים ומקרופגים בנוסף לתאי mesenchymal ריאות, דבקות הפלסטיק ואחריו 3-5 ימים של תרבות מבטיחה רק כי תאי mesenchymal הריאות להישאר. ואכן אוכלוסיית תאים זה מבטא את שטח MSC הקלסי הסמנים CD73, CD90 ו CD146 והוא שלילי על הסמנים CD34, CD45, הסוג מורכב histocompatibility הגדולה השני (MHCII) -RT1B, CD11b ו CD79a, המציין כי יש עוד כל לויקוציטים נוכח אוכלוסיית תאים (איור 2 א). מעניין הוא שמתוך מהשנה + CD146, מגוון% 44.4-65.7 גם CD73 + ו- CD90 + (מידע לא מוצג). יתר על כן, אוכלוסיית תא זה היא מסוגלתיחידת מושבה להרכיב (CFU) יעיל כי ב ~ 30% הם גבוה בהרבה ממה שמדווח בדרך כלל MSCs מח עצם או אפילו סוגי MSC אחרים (איור 2 ב), ומבדילה לאורך שלוש שושלות MSC הקלסיות (איור 2 ג). <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/53782/53782fig2.jpg" /> איור 2. מאפייני MSC לאחר עיכול אנזימטי, הפרדת שיפוע צפיפות ודבקות פלסטיק. (א) ביטוי של סמני משטח הקשורות MSC CD146, CD73 ו CD90 שוהים חלק מאוכלוסייה חסיד תא הפלסטיק, ואילו סמנים לויקוציטים השליליים CD11b, CD79a , CD34, CD45 ו MHCII-RT1B היו כמעט לא באה לידי ביטוי. (ב) מושבה להרכיב assay היחידה באמצעות הגבלת assay דילול (5 תאים / 2 סנטימטר) עולה כי כ -30% של תאי חסיד פלסטיק היו בו מקומות משובטים, מעיד על MSCs. (C) ce חסיד פלסטיקLLS מסוגל ייצור מטריקס osteogenic (אדום), שהכיל מספר גבוה של שלפוחית ​​שומנים קטנה (אדום) כאשר מושרה עם בינוני בידול adipogenic בהשוואה ללא-בדיל בקרות נוצרו chondrogenic כמו כדורים המכילים chondrocytes (אדום). הנתונים מוצגים כממוצע ± שגיאת התקן של הממוצע (SEM). כל הנתונים שנוצרו עם תאים מעבר 1-3. NM = סמנים שליליים; CFU = מושבה להרכיב יחידות. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53782/53782fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> עם זאת, האזהרה העיקרית היא שהאוכלוסייה זו סבירה מכילה שני L-MSCs ו תת-סוגים שונים של פיברובלסטים ריאות, L-MSCs בדיל צאצאים 23. מאז multipotency מתואם חיובית עם הביטוי CD146, ו פיברובלסטים צריכה להיות לך שום ביטוי של סמן זה, סלקציה חיובית של תת-אוכלוסייה + CD146 ostensibly הביא אוכלוסייה בתא אנושית מועשרת ב L-MSCs. זו באה לידי ביטוי באופן ברור על ידי אחוז גבוה של האוכלוסייה תא המבטא סמנים משטח הקשורים MSC (איור 3 א), פוטנציאל המושבה להרכיב גבוה משמעותית של ~ 80% (איור 3 ב) ו תגובה בידול חזק במיוחד בשושלת chondrogenic (איור 3 ג) בהשוואה לאוכלוסייה mesenchymal הכוללת מתקבלת לפני בחירת CD146. מן ראוי לציין כי הוא דרך ביטוי L-MSCs אלה רק מעט מאוד adipocytes נכון, אבל להראות תאים בצורה רבים יותר כישור כי הם מלאי שלפוחית ​​שומנים קטנה. אלה יכולים לשקף את שושלת lipofibroblast כי הוא חיוני הוא לפיתוח ריאות תמיכת תא מסוג II המכתשית. לאחר בחירת CD146, יותר adipocyte כמו תאים מלאי שלפוחית ​​שומנים גדולה ניתן לצפות (איור 3 ג) לעומת לפני בחירת CD146, עדיין רוב התאים הם עדיין lipofibroblasts הדמוי ceLLS המכיל שלפוחית ​​שומנים קטנה. <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/53782/53782fig3.jpg" /> איור 3. מאפיינים MSC לאחר בחירה חרוזה מגנטי נוסף CD146 +. לאחר סלקציה חיובית של תת-האוכלוסייה + CD146, תאים אלה הראו ביטוי הגבוה של סמני משטח הקשורות MSC, CD73 בפרט (א), יעילות CFU גבוהה באופן משמעותי לאחר תא בודד ציפוי (B), ואת תגובת בידול חזקה במיוחד בשושלת chondrogenic ובמידה פחותה שושלת adipogenic (C). הנתונים מוצגים כממוצע ± SEM. כל הנתונים שנוצרו עם 3 תאי מעבר. NM = סמנים שליליים; מושבת CFU = הקמת יחידות. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53782/53782fig3large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן t</a>o לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

Watch this Scientific Journal Video about Isolation of CD146+ Resident Lung Mesenchymal Stromal Cells from Rat Lungs at JoVE.com

Isolation of CD146+ Resident Lung Mesenchymal Stromal Cells from Rat Lungs

פרוטוקול זה מתאר טכניקת בידוד לקבלת תאי סטרומה mesenchymal תושב ריאה הראשית של חולדות, באמצעות עיכול אנזימטי, הפרדת שיפוע צפיפות, דבקות פלסטיק CD146 + מבחר חרוז מגנטי.

בידוד של CD146<sup&gt; +</sup&gt; תאי סטרומה mesenchymal ריאות התושב מריאות העכברוש

Mesenchymal stromal cells (MSCs) are increasingly recognized for their therapeutic potential in a wide range of diseases, including lung diseases. Besides ...

isolation-cd146-resident-lung-mesenchymal-stromal-cells-from-rat

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

Isolation of CD146+ Resident Lung Mesenchymal Stromal Cells from Rat Lungs

8.3K Views.  Ottawa Hospital Research Institute.  פרוטוקול זה מתאר טכניקת בידוד לקבלת תאי סטרומה mesenchymal תושב ריאה הראשית של חולדות, באמצעות עיכול אנזימטי, הפרדת שיפוע צפיפות, דבקות פלסטיק CD146 + מבחר חרוז מגנטי. 

Video: Isolation of CD146+ Resident Lung Mesenchymal Stromal Cells from Rat Lungs

Isolation of Mouse Lung Dendritic Cells

Lung dendritic cells (DC) play a fundamental role in sensing invading pathogens 1,2 as well as in the control of tolerogenic responses 3 in the respiratory tract. At least three main subsets of lung dendritic cells have been described in mice: conventional DC (cDC) 4, plasmacytoid DC (pDC) 5 and the IFN-producing killer DC (IKDC) 6,7. The cDC subset is the most prominent DC subset in the lung 8. 
The common marker known to identify DC subsets is CD11c, a type I transmembrane integrin (&beta;2) that is also expressed on monocytes, macrophages, neutrophils and some B cells 9. In some tissues, using CD11c as a marker to identify mouse DC is valid, as in spleen, where most CD11c+ cells represent the cDC subset which expresses high levels of the major histocompatibility complex class II (MHC-II). However, the lung is a more heterogeneous tissue where beside DC subsets, there is a high percentage of a distinct cell population that expresses high levels of CD11c bout low levels of MHC-II. Based on its characterization and mostly on its expression of F4&#47;80, an splenic macrophage marker, the CD11chiMHC-IIlo lung cell population has been identified as pulmonary macrophages 10 and more recently, as a potential DC precursor 11. 
In contrast to mouse pDC, the study of the specific role of cDC in the pulmonary immune response has been limited due to the lack of a specific marker that could help in the isolation of these cells. Therefore, in this work, we describe a procedure to isolate highly purified mouse lung cDC. The isolation of pulmonary DC subsets represents a very useful tool to gain insights into the function of these cells in response to respiratory pathogens as well as environmental factors that can trigger the host immune response in the lung.

A highly purified preparation of mouse lung dendritic cells is described. Specific emphasis is given to the isolation of conventional dendritic cell subset.

בידוד של ריאות תאים דנדריטים עכבר

Lung dendritic cells (DC) play a fundamental role in sensing invading pathogens 1,2 as well as in the control of tolerogenic responses 3 in the ...

Immunology and Infection

Isolation and Animal Serum Free Expansion of Human Umbilical Cord Derived Mesenchymal Stromal Cells (MSCs) and Endothelial Colony Forming Progenitor Cells (ECFCs)

The umbilical cord is a rich source for progenitor cells with high proliferative potential including mesenchymal stromal cells (also termed mesenchymal stem cells, MSCs) and endothelial colony forming progenitor cells (ECFCs). Both cell types are key players in maintaining the integrity of tissue and are probably also involved in regenerative processes and tumor formation.
To study their biology and function in a comparative manner it is important to have both cells types available from the same donor. It may also be beneficial for regenerative purposes to derive MSCs and ECFCs from the same tissue.
Because cellular therapeutics should eventually find their way from bench to bedside we established a new method to isolate and further expand progenitor cells without the use of animal protein. Pooled human platelet lysate (pHPL) replaced fetal bovine serum in all steps of our protocol to completely avoid contact of the cells to xenogeneic proteins.
This video demonstrates a methodology for the isolation and expansion of progenitor cells from one umbilical cord.
All materials and procedures will be described.

Isolation and Animal Serum Free Expansion of Human Umbilical Cord Derived Mesenchymal Stromal Cells MSCs and Endothelial Colony Forming Progenitor Cells ECFCs

This protocol describes the isolation and subsequent expansion of mesenchymal stromal cells and endothelial colony forming cells without the use of animal serum to generate autologous pairs for experimental transplantation purposes.

בידוד בעלי חיים הרחבת חינם סרום של טבורי האדם נגזר תאים סטרומה mesenchymal (MSCs) ו האנדותל יצירת המושבה ובתאים (ECFCs)

The umbilical cord is a rich source for progenitor cells with high proliferative potential including mesenchymal stromal cells (also termed mesenchymal ...

Isolation and Enrichment of Rat Mesenchymal Stem Cells (MSCs) and Separation of Single-colony Derived MSCs

MSCs are a population of adult stem cells that is a promising source for therapeutic applications. These cells can be isolated from the bone marrow and can be easily separated from the hematopoietic stem cells (HSCs) due to their plastic adherence. This protocol describes how to isolate MSCs from rat femurs and tibias. The isolated cells were further enriched against two MSCs surface markers CD54 and CD90 by magnetic cell sorting. Expression of surface markers CD54 and CD90 were then confirmed by flow cytometry analysis. HSC marker CD45 was also included to check if the sorted MSCs were depleted of HSCs. MSCs are naturally quite heterogeneous. There are subpopulations of cells that have different shapes, proliferation and differentiation abilities. These subpopulations all express the known MSCs markers and no unique marker has yet been identified for the different subpopulations. Therefore, an alternative approach to separate out the different subpopulations is using cloning cylinders to separate out single-colony derived cells. The cells derived from the single-colonies can then be cultured and evaluated separately.

Isolation and Enrichment of Rat Mesenchymal Stem Cells MSCs and Separation of Single-colony Derived MSCs

Rat MSCs were isolated from femurs and tibias and then enriched by magnetic cell sorting. Sorted cells were confirmed for the expression of surface markers by flow cytometry. These cells were also cultured at clonal density to form single colonies and then these colonies were separated by cloning cylinders.

בידוד והעשרה של תאים עכברוש mesenchymal גזע (MSCs) והפרדה של המושבה, סינגל נגזר MSCs

MSCs are a population of adult stem cells that is a promising source for therapeutic applications. These cells can be isolated from the bone marrow and ...

Isolation &#38; Characterization of Hoechstlow CD45negative Mouse Lung Mesenchymal Stem Cells

Tissue resident mesenchymal stem cells (MSC) are important regulators of tissue repair or regeneration, fibrosis, inflammation, angiogenesis and tumor formation. Taken together these studies suggest that resident lung MSC play a role during pulmonary tissue homeostasis, injury and repair during diseases such as pulmonary fibrosis (PF) and arterial hypertension (PAH). Here we describe a technology to define a population of resident lung MSC. The definition of this population in vivo pulmonary tissue using a define set of markers facilitates the repeated isolation of a well-characterized stem cell population by flow cytometry and the study of a specific cell type and function.

Isolation & Characterization of Hoechstlow CD45negative Mouse Lung Mesenchymal Stem Cells

In this article we demonstrate the isolation of murine resident lung mesenchymal stem cells (lung MSC), their expansion, characterization and analysis of immunomodulatory properties.

בידוד &amp; אפיון Hoechst נמוך CD45 שלילי עכבר mesenchymal ריאות בתאי גזע

Tissue resident mesenchymal stem cells (MSC) are important regulators of tissue repair or regeneration, fibrosis, inflammation, angiogenesis and tumor ...

Isolation and Primary Culture of Rat Hepatic Cells

Primary hepatocyte culture is a valuable tool that has been extensively used in basic research of liver function, disease, pathophysiology, pharmacology and other related subjects. The method based on two-step collagenase perfusion for isolation of intact hepatocytes was first introduced by Berry and Friend in 1969 1 and, since then, has undergone many modifications. The most commonly used technique was described by Seglenin 1976 2. Essentially, hepatocytes are dissociated from anesthetized adult rats by a non-recirculating collagenase perfusion through the portal vein. The isolated cells are then filtered through a 100 &mu;m pore size mesh nylon filter, and cultured onto plates. After 4-hour culture, the medium is replaced with serum-containing or serum-free medium, e.g. HepatoZYME-SFM, for additional time to culture. These procedures require surgical and sterile culture steps that can be better demonstrated by video than by text. Here, we document the detailed steps for these procedures by both video and written protocol, which allow consistently in the generation of viable hepatocytes in large numbers.

Primary hepatocytes provide a valuable tool to evaluate biochemical, molecular, and metabolic functions in a physiologically relevant experimental system. We describe a reliable protocol for rat in situ liver perfusion, which consistently generates viable hepatocytes up to 1.0 &times; 108 cells per preparation with cell viability between 88 ~ 96%.

בידוד תרבות ראשונית של תאים בכבד עכברוש

Primary hepatocyte culture is a valuable tool that has been extensively used in basic research of liver function, disease, pathophysiology, pharmacology ...

Isolation of Primary Mouse Lung Endothelial Cells

Endothelial cells play critical roles in the regulation of vascular tone, immunity, coagulation, and permeability. Endothelial dysfunction occurs in medical conditions including diabetes, atherosclerosis, sepsis, and acute lung injury. A reliable and reproducible method to isolate pure endothelial cells from mice is needed to investigate the role of endothelial cells in the pathogenesis of these and other conditions. In this protocol, lung microvascular endothelial cells were prepared from 5-7 day old neonatal mouse pups. Lungs are harvested, minced, and enzymatically digested with collagenase I, and released cells are cultured overnight. Endothelial cells are then selected using anti-PECAM1 (CD-31) IgG conjugated to magnetic beads, and cells again are cultured to confluence. A secondary cell selection then occurs with anti-ICAM2 (CD-102) IgG conjugated to magnetic beads to increase the purity of the endothelial cells, and the cells again are cultured to confluence. The entire process takes approximately 7-10 days before the cells can be used for experimentation. This simple protocol yields highly pure (purity &#62;92%) endothelial cells that can be immediately used for in vitro studies, including the studies focused on endothelial cytokine and chemokine production, leukocyte-endothelial interactions, endothelial coagulation pathways, and endothelial permeability. With many knockouts and transgenic mouse lines available, this procedure also lends itself to understanding the function of specific genes expressed by endothelial cells in healthy and pathologic responses to injury, infection, and inflammation.

In this article, primary lung endothelial cells were isolated and cultured from neonatal mice.

בידוד תאי אנדותל ריאה ראשוניים של עכבר

Endothelial cells play critical roles in the regulation of vascular tone, immunity, coagulation, and permeability. Endothelial dysfunction occurs in ...

<meta charset="utf8"></head><body>בידוד של תאים חיסוניים ולא חיסוניים מריאות עכברים עבור ציטומטריית זרימה

Isolation of Live Myeloid and Epithelial Cell Populations from the Mouse Lung

The lung is continuously exposed to pathogens and other noxious environmental stimuli, rendering it vulnerable to damage, dysfunction, and the development of disease. Studies utilizing mouse models of respiratory infection, allergy, fibrosis, and cancer have been critical to reveal mechanisms of disease progression and identify therapeutic targets. However, most studies focused on the mouse lung prioritize the isolation of either immune cells or epithelial cells, rather than both populations concurrently. Here, we describe a method for preparing a comprehensive single-cell suspension of both immune and non-immune populations suitable for flow cytometry and fluorescence-activated cell sorting. These populations include epithelial cells, endothelial cells, fibroblasts, and a variety of myeloid cell subsets. This protocol entails bronchoalveolar lavage and subsequent inflation of the lungs with dispase. Lungs are then digested in a liberase mixture. This method of processing liberates a variety of diverse cell types and results in a single-cell suspension that does not require manual dissociation against a filter, promoting cell survival and yielding high numbers of live cells for downstream analyses. In this protocol, we also define gating schemes for epithelial and myeloid cell subsets in both na&#239;ve and influenza-infected lungs. Simultaneous isolation of live immune and non-immune cells is key for interrogating intercellular crosstalk and gaining a deeper understanding of lung biology in health and disease.

<meta charset="utf8"></head><body>בידוד אוכלוסיות תאים מיאלואידיים ואפיתל חיים מריאת העכבר

This protocol details the isolation of live immune and non-immune populations from the mouse lung at a steady state and following influenza infection. It also provides gating strategies for identifying epithelial and myeloid cell subsets.

בידוד אוכלוסיות תאים מיאלואידיים ואפיתל חיים מריאת העכבר

The lung is continuously exposed to pathogens and other noxious environmental stimuli, rendering it vulnerable to damage, dysfunction, and the development ...

בידוד מבוסס נישה של תאי גזע מזנכימליים מעצם לסת חולדה

Technique for Isolation and Culture of Rat Jaw Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells

Bone marrow mesenchymal stem cells (BMMSCs) are a type of stem cell with multi-directional differentiation potential. Compared with BMMSCs derived from appendicular bones, BMMSCs derived from the jaw have greater proliferative and osteogenic differentiation ability, gradually becoming important seed cells for jaw defect repair. However, the mandible has a complex bony structure and less cancellous content than appendicular bones. It is difficult to acquire a large number of high-quality jaw-derived marrow mesenchymal stem cells using traditional methods. This study presents a &#39;niche-based approach on stemness&#39; for isolating and culturing rat jaw bone marrow mesenchymal stem cells (JBMMSCs). Primary rat JBMMSCs were isolated and cultured using the whole bone marrow adherent method combined with the bone slice digestion method. The isolated cells were identified as JBMMSCs through cell morphology observation, detection of cell surface markers, and multi-directional differentiation induction. The cells extracted by this method exhibit a &#39;fibroblast-like&#39; spindle shape. The cells are long, spindle-shaped and fibroblast-like. The flow cytometry analysis shows these cells are positive for CD29, CD44, and CD90 but negative for CD11b/c, CD34, and CD45, which is congruent with BMMSCs characteristics. The cells show strong proliferation capacity and can undergo osteogenic, adipogenic, and chondrogenic differentiation. This study provides an effective and stable method for obtaining enough high-quality JBMMSCs with strong differentiation ability in a short time, which could facilitate further studies of the exploration of biological function, regenerative medicine, and related clinical applications.

מחבר זרקור: יישום תאי גזע מזנכימליים של מח עצם לסת ברמת טוהר גבוהה בהנדסת רקמות

Mesenchymal stem cells from the jaw bone marrow have significant functions in diverse differentiation, self-renewal, and immune modulation. They have emerged as a crucial reservoir of precursor cells in gene therapy, tissue engineering, and regenerative medicine. Here, we present a unique method for isolating jaw bone marrow mesenchymal stem cells in rats.

טכניקה לבידוד ותרבית של תאי גזע מזנכימליים של מח עצם לסת חולדה

Bone marrow mesenchymal stem cells (BMMSCs) are a type of stem cell with multi-directional differentiation potential. Compared with BMMSCs derived from ...

בידוד של CD146

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video

בידוד של ריאות תאים דנדריטים עכבר

בידוד בעלי חיים הרחבת חינם סרום של טבורי האדם נגזר תאים סטרומה mesenchymal (MSCs) ו האנדותל יצירת המושבה ובתאים (ECFCs)

בידוד והעשרה של תאים עכברוש mesenchymal גזע (MSCs) והפרדה של המושבה, סינגל נגזר MSCs

בידוד & אפיון Hoechst^נמוך CD45^שלילי עכבר mesenchymal ריאות בתאי גזע

בידוד תרבות ראשונית של תאים בכבד עכברוש

בידוד תאי אנדותל ריאה ראשוניים של עכבר

בידוד אוכלוסיות תאים מיאלואידיים ואפיתל חיים מריאת העכבר

בידוד אוכלוסיות תאים מיאלואידיים ואפיתל חיים מריאת העכבר

בידוד אוכלוסיות תאים מיאלואידיים ואפיתל חיים מריאת העכבר

טכניקה לבידוד ותרבית של תאי גזע מזנכימליים של מח עצם לסת חולדה