עבודה זו נתמכה על ידי Ministerio ספרדית דה Educación y Ciencia (BIO 2006-11792) ואת Generalitat דה קטלוניה (2005-SGR00437). המחברים מבקשים להודות מארק Puigcerver ואת יונתן לוקאס לקבלת סיוע טכני שלהם בהכנת התקשורת. כל הצוות של ד &#39;Servei Estabulari הוא הודה לדיור בעלי חיים, ובעיקר חואן חוסה מרטין חבייר בניטו על תרומה נוספת על הקלטה של ​​וידאו חלק זה. NCB הוא עמית של Fundação פורטוגזית פסקה דואר Ciência Tecnologia ו SG הוא עמית של הספרדי Ministerio de Educación y Ciencia.

טיפול בבעלי חיים ונהלים נערכו על פי הנחיות ותקנות שאושרו על ידי ועדת האתיקה על בעלי חיים ומחקר האדם של אוניברסיטת האוטונומית של ברצלונה, ספרד. אני אוסף הביצית <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בדוק ובחר אוגרים הנקבה (Mesocricetus auratus; 8-12 בשבוע הישן) של זן הסורי הזהב עבור נוכחות של הפרשות הנרתיק עבה (פריקה postovulatory). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לגרום לנקבות שנבחרו superovulate בזריקה intraperitoneal של 40 IU של PMSG (בהריון Mare סרום גונדוטרופין) ואחריו 40 IU של hCG (גונדוטרופין כוריוני אנושי) 60 שעות לאחר מכן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרדים אוגרים הנקבה 16 שעות לאחר מתן hCG בתא פחמן דו חמצני. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בודד oviducts מן הנקבות כפי שמוצג בסרטון ולהעבירם ירידה של המדיום KSOM-H. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> איסוף הביצית-תלולית על ידי מתחמי קריעת ampulla oviduct תחת מיקרוסקופ סטריאוסקופית ירידה של hyaluronidase (156 U / ml) בשעה 37 ° C. ביציות יתפנה מן התאים קומולוס בתוך כ 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תרימי ביציות מן hyaluronidase ולשטוף אותם פעמיים בינוני KSOM-H. </li></ol> עבור אוסף של עוברי עכברים, נקבות עכברים (Mus שריר: 6-8 בשבוע הישן) הם המושרה על ידי הזרקה superovulate intraperitoneal של 5 IU של PMSG ואחריו 5 IU של hCG 48 שעות מאוחר יותר הזדווגו עם עכברים זכרים. נקבות מוקרבים על ידי נקע בצוואר הרחם ב 24-26, 44-46 או 54-56 שעות לאחר מתן של hCG עבור obtention של pronuclear, 2 תאים או 4 תאים עוברים שלב, בהתאמה. אוסף של עוברים pronuclear מתבצעת בדיוק כפי שתואר עבור ביציות אוגר. עוברים בשלבים 2 תאים ו 4 תאים נאספים על ידי שטיפה עם oviducts בינוני KSOM-H [6]. הערה: בעקבות פרוטוקול זה כ 20-30 ביציות / עוברים ניתן לאסוף מן הנקבה כל אחד. השנייה. הכנת מקפיא הפשרה פתרונות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן פתרון אני על ידי דילול 0.57 מ&quot;ל של propilenglycol ב 5 מ&quot;ל של KSOM-H (1.5 מ &#39;של propilenglycol). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן פתרון הפשרה על ידי הוספת 2 מ&quot;ל של KSOM-H לצינור עם סוכרוז 0.2052 גרם (0.3 מ &#39;של סוכרוז). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן פתרון הקפאת ידי הוספת 2 מ&quot;ל של תמיסת אני לצינור עם סוכרוז 0.0684 גרם (1.5 מ &#39;של propilenglycol ו 0.1 סוכרוז M). </li></ol> הערה: אני פתרון מקפיא הפשרה הפתרונות צריכים להיות מוכנים רק לפני השימוש בהם. עם זאת, הסכומים המפורטים של סוכרוז לשמש להכנת הקפאת פתרונות הפשרה עשוי להיות משוקלל מראש ומאוחסנים 3 מ&quot;ל שפופרות בטמפרטורת החדר במשך כמה חודשים. ג. הקפאת פרוטוקול <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת ביציות / עוברים ממדיום KSOM-H ירידה של פתרון ואני דגירה של 7-15 דקות בטמפרטורת החדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בינתיים, להכין צלחת פטרי 90 מ&quot;מ כדי לטעון את קשיות ידי הצבת 90 טיפות של μl מקפיא הפשרה פתרונות כמו זה המוצג בסרטון (1 טיפה של כל פתרון / קש). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעבירים את המספר הרצוי של ביציות / עוברים את טיפות פתרון מקפיא. הערה: אנו בדרך כלל העברה בין 5-30 ביציות או עוברים / ירידה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צרף קש למערכת שאיפה לשלוט בפה לטעון אותו הבאים בסדר הזה: הפתרון אני, אוויר, ירידה הקפאה עם ביציות, אוויר, ירידה הפשרה, אוויר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר קש נטען, לשמור aspirating עד הטיפה הראשונה הציג (פתרון אני) מגיע פולימר בקצה העליון של הקשית וחותמות הזה סוף. Thermo-חותם את הקצה השני של קש או חותם עם פקק פלסטיק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל את במקפיא לתכנות ובחר את תוכנית ההקפאה. תוכנית הקפאת בשימוש פרוטוקול זה מבוסס על שיעורי קירור פורסם במקור על ידי לאסאל et al. [7]: <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 2 ° C / min מ בטמפרטורת החדר ל -7 ° C 0 ° C / min 10 דקות, כדי לאפשר איזון הטמפרטורה של זריעת אינדוקציה (ראה להלן) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 0.3 ° C / min מ -7 ° C ל -30 ° C 0 ° C / min 2 דקות, כדי לאפשר איזון הטמפרטורה </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 35 ° C / min מ -30 ° C ל -130 ° C </li></ul></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טען את קשיות על החריצים של בעל במקפיא לתכנות, ולוודא כי החלק של קש עם ירידה של פתרון הפשרה פונה כלפי חוץ. הפעל את תוכנית ההקפאה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כאשר הטמפרטורה מגיעה ל -7 מדגם ° C וקירור בהמתנה, לבצע זריעה ידנית: לצלול מלקחיים לתוך חנקן נוזלי, למשוך את מחזיקי מעט מהמקפיא כדי לחשוף את החלק של קשיות המכיל את טיפות פתרון הפשרה, ומיד המגע החלק הזה של קשיות עם מלקחיים. חזור לבעל ולכל קש בעל ולאחר מכן אפשר להריץ את תוכנית ההקפאה עד הסוף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כאשר התוכנית תושלם, לצלול בעלי בחנקן נוזלי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את קשיות מןמחזיקי ולהעבירם gobelet שכותרתו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבסוף, בחנות gobelet בתוך טנק חנקן נוזלי. </li></ol> IV. הפשרה פרוטוקול <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את קש מהטנק חנקן נוזלי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שמור על קש בטמפרטורת החדר למשך 40 שניות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> משרים את קש באמבט מים ב 30 ° C במשך 40 שניות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את תקע מתוך קש או לחתוך את קצה תרמו אטום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רוקן את קש בצלחת פטרי בגודל 35 מ&quot;מ בעדינות מערבבים את שתי טיפות המכילות את המקפיא הפשרת פתרונות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השאירו ביציות / עוברים בתערובת במשך 15 דקות בטמפרטורת החדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת ביציות / עוברים לירידה טרי KSOM-H על 15 דקות נוספות ב 37 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ביציות / עוברים כעת מוכן מניפולציה נוספת. </li></ol> הערה: במהלך שלבים 6 ו -7 אתה צריך לראות כי ביציות מופשר / עוברים לאט להתנפח עקב התייבשות. V. תוצאות נציג השימוש בפרוטוקול cryopreservation דיווחו כאן התוצאה היא שיעור הישרדות של כ 95% עבור ביציות אוגר של 90%&gt;, 85% ו 80% עבור B6CBAF1 עוברי עכברים בבית pronuclear, 2 תאים בשלבים 4 תאים, בהתאמה. כאשר עוברי עכברים הם מתורבתים במבחנה ב KSOM לאחר ההפשרה, לפחות 70 עד 80% צריך להגיע לשלב הבלסטוציסט בתנאים אופטימליים תרבות. מומלץ לכלול קבוצת ביקורת (קש) של ביציות / עוברים כל ניסוי מקפיא שאתה להפשיר את הקבוצה הזאת לפני שאר ביציות / עוברים משמשים מניפולציות נוספות. אם שיעורי ההישרדות בקבוצת הביקורת נמוכים מהצפוי, להפשיר עוד קש ממגרש אותו. אם שיעורי ההישרדות של הקבוצה השנייה הם גם נמוכים, לבטל את קשיות הנותרים ממגרש זה מקפיא.

<ol>
	<li>Whittingham, D. G., Leibo, S. P., Mazur, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Survival+of+mouse+embryos+frozen+to+-196+and+-269+&#176;C.">Survival of mouse embryos frozen to -196 and -269 &#176;C.</a> Science. 178, 411-414 (1972).</li><li>Wilmut, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+cooling+rate,+warming+rate,+cryoprotective+agent+and+stage+of+development+on+survival+of+mouse+embryos+during+freezing+and+thawing.">The effect of cooling rate, warming rate, cryoprotective agent and stage of development on survival of mouse embryos during freezing and thawing.</a> Life Sci. 11, 1071-1079 (1972).</li><li>Parkening, T. A., Tsunoda, Y., Chang, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+various+low+temperatures,+cryoprotective+agents+and+cooling+rates+on+the+survival,+fertilizability+and+development+of+frozen-thawed+mouse+eggs.">Effects of various low temperatures, cryoprotective agents and cooling rates on the survival, fertilizability and development of frozen-thawed mouse eggs.</a> J. Exp. Zool. 197, 369-374 (1976).</li><li>Schneider, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryobiological+principles+of+embryo+freezing.">Cryobiological principles of embryo freezing.</a> J. In Vitro Fert. Embryo Transf. 3, 3-9 (1986).</li><li>Vajta, G., Kuwayama, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improving+cryopreservation+systems.">Improving cryopreservation systems.</a> Theriogenology. 65, 236-244 (2006).</li><li>Duselis, A. R., Vrana, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retrieval+of+mouse+oocytes.">Retrieval of mouse oocytes.</a> JoVE. 3, (2007).</li><li>Lassalle, B., Testart, J., Renard, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+embryo+features+that+influence+the+success+of+cryopreservation+with+the+use+of+1,2+propanediol.">Human embryo features that influence the success of cryopreservation with the use of 1,2 propanediol.</a> Fertil. Steril. 44, 645-651 (1985).</li><li>Ib&#225;&#241;ez, E., Grossmann, M., Vidal, F., Egozcue, J., Santal&#243;, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryopreservation+of+caprine+beta-lactoglobulin+transgenic+mouse+embryos.">Cryopreservation of caprine beta-lactoglobulin transgenic mouse embryos.</a> Cryobiology. 35, 290-298 (1997).</li><li>Dinnyes, A., Wallace, G. A., Rall, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+genotype+on+the+efficiency+of+mouse+embryo+cryopreservation+by+vitrification+or+slow+freezing.">Effect of genotype on the efficiency of mouse embryo cryopreservation by vitrification or slow freezing.</a> Mol. Reprod. Dev. 40, 429-435 (1995).</li><li>Tateno, H., Kamiguchi, Y., Mikamo, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+freezing+and+thawing+method+of+hamster+oocytes+designed+for+both+the+penetration+test+and+chromosome+assay+of+human+spermatozoa.">A freezing and thawing method of hamster oocytes designed for both the penetration test and chromosome assay of human spermatozoa.</a> Mol. Reprod. Dev. 33, 202-209 (1992).</li><li>Biggers, J., McGuinnis, L. K., Raffin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amino+acids+and+preimplantation+development+of+the+mouse+in+the+protein-free+KSOM.">Amino acids and preimplantation development of the mouse in the protein-free KSOM.</a> Biol. Reprod. 63, 281-293 (2000).</li></ol>

עם ביציות זה אוגר פרוטוקול עוברי עכבר ניתן cryopreserved בהצלחה. קפוא פעם, ביציות / עוברים ניתן לאחסן מכלי חנקן נוזלי ללא הגבלת זמן והחלים בכל זמן או מקום הרצוי. זו מציעה את היתרון שיש דגימות כמעט מוכנה להשתמש בכל פעם לפי הצורך. מצד שני, פרוטוקול זה יכול לשמש גם כדי לייצר cryobanks העובר מן הזנים העכבר ערך (כגון קווי מהונדס), כחלופה חסכוני ובטוח יותר לשמירה על מושבות חיים לחיות. חשוב לציין כי פרוטוקול מותאם cryopreserve ביציות אוגר היברידית עוברי עכבר B6CBAF1. הבדלים שלאחר ההפשרה שיעורי ההישרדות בקרב עוברי עכבר עם רקע גנטי שונה תוארו 8,9, ולכן יש להיזהר כדי להעריך את התנאים cryopreservation על כל זן של המין או ביציות / עוברים להקים את הפרוטוקול המתאים לפני הדור של הביצית או העובר cryobanks. ביציות אוגר ניתן להשתמש אנושי מרפאות רבייה סייעה לבדיקה חדירת זרע או לניתוח הזרע כרומוזום 10, או כמו לתרגל חומר למתחילים הזרקת זרע intracytoplasmic (ICSI). מצד שני, היברידית עכבר B6CBAF1 עוברים בשלבים pronuclear או 2 תאים ניתן להשתמש בסיוע אנושי מרכזי רבייה או במעבדות מחקר כדי לבדוק את האיכות של תרבות התקשורת העובר או את התפקוד התקין של החממות.

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>French type mini-straw 0.25 ml</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Mini-tub</td>
<td>13407/0010</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>hCG</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Farma-Lepori, Spain</td>
<td>749036.4</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Hyaluronidase</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>H-3884</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>KSOM-H medium</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Ref. [11]</td>
</tr>
<tr>
<td>Liquid Nitrogen </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Air Liquide</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Plastic plugs</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Mini-tub</td>
<td>19046</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>PMSG</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Intervet, Spain</td>
<td>1.614/8447</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Propilenglycol</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fluka</td>
<td>82280</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Sucrose</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Merck</td>
<td>107687</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Surgical Scissors</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Aesculap</td>
<td>BC-060R; BG-061R</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Thermo-sealer</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>SIZ</td>
<td>220</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>35 and 90 mm culture dishes</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Nunc</td>
<td>153066; 150350</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>10 ml tubes</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Greiner Bio-one</td>
<td>163160</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Nitrogen tank</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>MVE, Cryogenics</td>
<td>XC 43/28</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Programmable Freezer</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Planner Products Ltd.</td>
<td>Kryo-10 Series III</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Forceps</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Aesculap</td>
<td>BD-331R; BD-053R; OC-020R</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

collection and cryopreservation of hamster oocytes and mouse embryos

עוברים וביציות היו הראשונים cryopreserved בהצלחה יותר מ -30 שנים, כאשר Whittingham<i&gt; Et al.</i&gt;<sup&gt; 1</sup&gt; ו וילמוט<sup&gt; 2</sup&gt; תיאר בנפרד כי עוברי עכבר יכול להיות קפוא המאוחסן -196 מעלות צלזיוס, כמה שנים מאוחר יותר, Parkening<i&gt; ואח&#39;</i&gt;.<sup&gt; 3</sup&gt; דיווח על לידת צאצאים חיים הנובע הפריה חוץ גופית (IVF) של ביציות cryopreserved. מאז, השימוש בטכניקות cryopreservation התפשט במהירות להיות מרכיב חיוני בפועל של שעתוק בסיוע אדם ובעלי חיים ועל שימור משאבי גנטית של חיות. נכון לעכשיו, יש שתי שיטות עיקריות משמש cryopreserve ביציות ועוברים: הקפאת vitrification איטי. מגוון רחב של גישות שימשו כדי לנסות לשפר הן טכניקות של מיליוני בעלי חיים אלפי ילדים נולדו מעוברים cryopreserved. עם זאת, חסרונות חשובים הקשורים ל cryopreservation עדיין צריך להתגבר, מאז היווצרות קרח קריסטל, אפקטים פתרון הלם אוסמוטי נראה לגרום cryoinjuries מספר שלאחר להפשיר ביציות ועוברים. הקפאה איטית עם מקפיאים לתכנות יש את היתרון של שימוש בריכוזים נמוכים של cryoprotectants, אשר מזוהה בדרך כלל עם רעילות כימית הלם אוסמוטי, אבל היכולת שלהם למנוע היווצרות קרח קריסטל בריכוזים נמוכים היא מוגבלת. הקפאה איטית גם גורם תופעות קירור כי יש להימנע באמצעות זריעה ידנית או אוטומטית<sup&gt; 4</sup&gt;. בתהליך vitrification, ריכוזים גבוהים של cryoprotectants לדכא היווצרות של גבישי קרח ו להוביל להיווצרות של מדינה מזוגגת glasslike שבו המים הקרושה, אך לא הרחיב. עם זאת, בשל רעילות של cyroprotectants על ריכוזי בשימוש, ביציות / עוברים רק יכול להיחשף לפתרון cryoprotectant לתקופה קצרה מאוד של זמן בפתרון נפח המינימום, לפני השריית דגימות ישירות חנקן נוזלי<sup&gt; 5</sup&gt;. בעשור האחרון, vitrification הפך פופולרי יותר כי היא שיטה מהירה מאוד שבו לא ציוד יקר (במקפיא לתכנות) נדרשת. עם זאת, הקפאה איטית ממשיכה להיות השיטה הנפוצה ביותר עבור cryopreservation הביצית / העובר. במאמר וידאו זה אנו מראים, צעד אחר צעד, איך לאסוף לאט להקפיא ביציות אוגר עם שלאחר ההפשרה שיעור גבוה הישרדות. ההליך אותו יכול גם להיות מיושם בהצלחה להקפיא להפשיר עוברי עכבר בשלבים שונים של פיתוח preimplantation.

Watch this Scientific Journal Video about Collection and Cryopreservation of Hamster Oocytes and Mouse Embryos at JoVE.com

Collection and Cryopreservation of Hamster Oocytes and Mouse Embryos

במאמר וידאו זה אנו מציגים הפגנה צעד אחר צעד כיצד לאסוף ביציות cryopreserve אוגר עם שלאחר ההפשרה שיעור גבוה הישרדות. ההליך אותו יכול גם להיות מיושם בהצלחה להקפיא להפשיר עוברי עכבר בשלבים שונים של פיתוח preimplantation.

איסוף cryopreservation של ביציות ועוברים אוגר עכבר

Embryos and oocytes were first successfully cryopreserved more than 30 years ago, when Whittingham et al. 1 and Wilmut 2 separately described that mouse ...

collection-and-cryopreservation-of-hamster-oocytes-and-mouse-embryos

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

16.9K Views.  Universitat Autonoma de Barcelona. במאמר וידאו זה אנו מציגים הפגנה צעד אחר צעד כיצד לאסוף ביציות cryopreserve אוגר עם שלאחר ההפשרה שיעור גבוה הישרדות. ההליך אותו יכול גם להיות מיושם בהצלחה להקפיא להפשיר עוברי עכבר בשלבים שונים של פיתוח preimplantation.

Video: Collection and Cryopreservation of Hamster Oocytes and Mouse Embryos

Nuclear Transfer into Mouse Oocytes

Nuclear transfer into an unfertilized oocyte can restore developmental potential to a differentiated cell. This demonstrates that the processes underlying development, differentiation and aging are epigenetic rather than genetic processes. The reversibility of these processes opens exciting perspectives in basic research, and in the more distant future, in regenerative medicine. In the mouse, embryonic stem cells can be derived from cloned preimplantation stage embryos. Such embryonic stem cells have the ability to give rise to all cell types of the adult organism. Importantly, these cells are genetically identical to the donor. If applicable to human, this would allow the derivation of stem cells from a patient. These cells could then be differentiated into the affected cell type of the patient and studied in vitro, or used to replace the damaged or missing cells. The study of nuclear transfer in the mouse remains important as it can inform us about the principles of nuclear reprogramming. This movie and the accompanying protocol are intended to help learning nuclear transfer in the mouse, a method initially developed in the group of Prof. Yanagimachi (WAKAYAMA et al. 1998).

This movie and the protocol are intended to help learning nuclear transfer.

העברת גרעין לתוך ביציות עכבר

Nuclear transfer into an unfertilized oocyte can restore developmental potential to a differentiated cell. This demonstrates that the processes underlying ...

Dissection of 6.5 dpc Mouse Embryos

Analysis of gene expression patterns during early stages of mammalian embryonic development can provide important clues about gene function, cell-cell interaction and signaling mechanisms that guide embryonic patterning. However, dissection of the mouse embryo from the decidua shortly after implantation can be a challenging procedure, and detailed step-by-step documentation of this process is lacking.

Here we demonstrate how post-implantation (6.5 dpc) embryos are isolated by first dissecting the uterus of a pregnant mouse (detection of the vaginal plug was designated day 0.5 poist coitum) and subsequently dissecting the embryo from maternal decidua. The dissection of Reichert's membrane is described as well as the removal of the ectoplacental cone.

Isolation of postimplantation-stage embryos allows one to study gene patterning and analyze cell-lineage decision making processes during embryonic development, but proper dissection of the early embryo can be challenging. This protocol describes a method for isolating early primitive-streak-stage embryos (~6.5 days post coitum [dpc]).

Dissection של 6.5 עוברים DPC עכבר

Analysis of gene expression patterns during early stages of mammalian embryonic development can provide important clues about gene function, cell-cell ...

Retrieval of Mouse Oocytes

To date, only a few studies have reported successful manipulations of Peromyscus embryogenesis or reproductive biology.  Together with the Peromyscus Genetic Stock Center (http://stkctr.biol.sc.edu), we are characterizing the salient differences needed to develop this system.  A primary goal has been to optimize oocyte/early embryo retrieval.

This protocol illustrates the technique for extracting oocytes or early-stage fertilized embryos from the oviduct of mice. The ability to identify the infindibulum and insert a blunt end needle into it is essential to correctly performing the procedure.

איחזור של ביציות עכבר

To date, only a few studies have reported successful manipulations of Peromyscus embryogenesis or reproductive biology.  Together with the Peromyscus ...

Plastic Embedding and Sectioning of Xenopus laevis Embryos

Plastic sections maintain true tissue morphology in thin sections of tissue that can be immunostained with fluorescent secondary antibodies, making this method more useful than paraffin-embedded or frozen sections for many types of tissue. The method for staining, plastic embedding, and sectioning is demonstrated in this video.

פלסטיק הטבעת ואת חתך של עוברים Xenopus laevis

In Utero Intraventricular Injection and Electroporation of E15 Mouse Embryos

In-utero in-vivo injection and electroporation of the embryonic mouse neocortex provides a powerful tool for the manipulation of individual progenitors lining the walls of the lateral ventricle. This technique is now widely used to study the processes involved in corticogenesis by over-expressing or knocking down genes and observing the effects on cellular proliferation, migration, and differentiation. In comparison to traditional knockout strategies, in-utero electroporation provides a rapid means to manipulate a population of cells during a specific temporal window. In this video protocol we outline the experimental methodology for preparing mice for surgery, exposing the uterine horns through laporatomy, injecting DNA into the lateral ventricles of the developing embryo, electroporating DNA into the progenitors lining the lateral wall, and caring for animals post-surgery. Our laboratory uses this protocol for surgeries on E13-E16 mice, however, it is most commonly performed at E15, as shown in this video. 

בשנת הזרקה תוך חדרי ברחם ו electroporation E15 של עוברי עכברים

In-utero in-vivo injection and electroporation of the embryonic mouse neocortex provides a powerful tool for the manipulation of individual progenitors ...

Microinjection of Xenopus Laevis Oocytes

Microinjection of Xenopus laevis oocytes followed by thin-sectioning electron microscopy (EM) is an excellent system for studying nucleocytoplasmic transport. Because of its large nucleus and high density of nuclear pore complexes (NPCs), nuclear transport can be easily visualized in the Xenopus oocyte. Much insight into the mechanisms of nuclear import and export has been gained through use of this system (reviewed by Pant&eacute;, 2006). In addition, we have used microinjection of Xenopus oocytes to dissect the nuclear import pathways of several viruses that replicate in the host nucleus. 
Here we demonstrate the cytoplasmic microinjection of Xenopus oocytes with a nuclear import substrate. We also show preparation of the injected oocytes for visualization by thin-sectioning EM, including dissection, dehydration, and embedding of the oocytes into an epoxy embedding resin. Finally, we provide representative results for oocytes that have been microinjected with the capsid of the baculovirus Autographa californica nucleopolyhedrovirus (AcMNPV) or the parvovirus Minute Virus of Mice (MVM), and discuss potential applications of the technique.

Here we demonstrate cytoplasmic microinjection of Xenopus laevis oocytes with a nuclear import substrate, as well as preparation of the injected oocytes for visualization by thin-sectioning electron microscopy.

Microinjection של ביציות Xenopus Laevis

Microinjection of Xenopus laevis oocytes followed by thin-sectioning electron microscopy (EM) is an excellent system for studying nucleocytoplasmic ...

Seawater Sampling and Collection

This video documents methods for collecting coastal marine water samples and processing them for various downstream applications including biomass concentration, nucleic acid purification, cell abundance, nutrient and trace gas analyses. For today's demonstration samples were collected from the deck of the HMS John Strickland operating in Saanich Inlet. An A-frame derrick, with a multi-purpose winch and cable system, is used in combination with Niskin or Go-Flo water sampling bottles. Conductivity, Temperature, and Depth (CTD) sensors are also used to sample the underlying water mass. To minimize outgassing, trace gas samples are collected first.  Then, nutrients, water chemistry, and cell counts are determined. Finally, waters are collected for biomass filtration. The set-up and collection time for a single cast is ~1.5 hours at a maximum depth of 215 meters. Therefore, a total of 6 hours is generally needed to complete the collection series described here.

This video documents methods for collecting coastal marine water samples and processing them for various downstream applications including biomass concentration, nucleic acid purification, cell abundance, nutrient and trace gas analyses.

מי ים דגימה אוסף

This video documents methods for collecting coastal marine water samples and processing them for various downstream applications including biomass ...

In vivo Imaging and Therapeutic Treatments in an Orthotopic Mouse Model of Ovarian Cancer

Human cancer and response to therapy is better represented in orthotopic animal models. This paper describes the development of an orthotopic mouse model of ovarian cancer, treatment of cancer via oral delivery of drugs, and monitoring of tumor cell behavior in response to drug treatment in real time using in vivo imaging system. In this orthotopic model, ovarian tumor cells expressing luciferase are applied topically by injecting them directly into the mouse bursa where each ovary is enclosed. Upon injection of D-luciferin, a substrate of firefly luciferase, luciferase-expressing cells generate bioluminescence signals. This signal is detected by the in vivo imaging system and allows for a non-invasive means of monitoring tumor growth, distribution, and regression in individual animals. Drug administration via oral gavage allows for a maximum dosing volume of 10 mL/kg body weight to be delivered directly to the stomach and closely resembles delivery of drugs in clinical treatments. Therefore, techniques described here, development of an orthotopic mouse model of ovarian cancer, oral delivery of drugs, and in vivo imaging, are useful for better understanding of human ovarian cancer and treatment and will improve targeting this disease.

In vivo Imaging and Therapeutic Treatments in an Orthotopic Mouse Model of Ovarian Cancer

Orthotopic animal models of ovarian cancer replicate better human disease and therefore enhance our understanding of cancer progression and tumor response to therapy. A mouse model receives an intrabursal injection of luciferase-expressing ovarian tumor cells. Treatment is administered via oral gavage. Tumor growth is monitored by in vivo imaging system.

בשנת vivo ההדמיה לטיפולים במודל עכבר orthotopic של סרטן השחלות

Human cancer and response to therapy is better represented in orthotopic animal models.  This paper describes the development of an orthotopic mouse model ...

Cryopreservation of Preimplantation Embryos of Cattle, Sheep, and Goats

Preimplantation embryos from cattle, sheep, and goats may be cryopreserved for short- or long-term storage. Preimplantation embryos consist predominantly of water, and the avoidance of intracellular ice crystal formation during the cryopreservation process is of paramount importance to maintain embryo viability. Embryos are placed into a hypertonic solution (1.4 &#x2013; 1.5 M) of a cryoprotective agent (CPA) such as ethylene glycol (EG) or glycerol (GLYC) to create an osmotic gradient that facilitates cellular dehydration. After embryos reach osmotic equilibrium in the CPA solution, they are individually loaded in the hypertonic CPA solution into 0.25 ml plastic straws for freezing. Embryos are placed into a controlled rate freezer at a temperature of -6&deg;C. Ice crystal formation is induced in the CPA solution surrounding the embryo, and crystallization causes an increase in the concentration of CPA outside of the embryo, causing further cellular dehydration. Embryos are cooled at a rate of 0.5&deg;C/min, enabling further dehydration, to a temperature of -34&deg;C before being plunged into liquid nitrogen (-196&deg;C). Cryopreserved embryos must be thawed prior to transfer to a recipient (surrogate) female. Straws containing the embryos are removed from the liquid nitrogen dewar, held in room temperature air for 3 to 5 sec, and placed into a 37&deg;C water bath for 25 to 30 sec. Embryos cryopreserved in GLYC are placed into a 1 M solution of sucrose for 10 min for removal of the CPA before transfer to a recipient (surrogate) female. Embryos cryopreserved in EG, however, may be directly transferred to the uterus of a recipient.

Preimplantation embryos may be cryopreserved after placement into a hypertonic cryoprotective solution to cause cellular dehydration. After equilibration, ice crystal formation is induced in the solution surrounding the embryo. Further dehydration occurs as the embryo is slowly cooled to subzero temperatures before plunging into liquid nitrogen for storage.

Cryopreservation של עוברים Preimplantation של בקר, כבשים ועזים

Preimplantation embryos from cattle, sheep, and goats may be cryopreserved for short- or long-term storage.  Preimplantation embryos consist predominantly ...

Cryopreservation of Mouse Embryos by Ethylene Glycol-Based Vitrification

Cryopreservation of mouse embryos is a technological basis that supports biomedical sciences, because many strains of mice have been produced by genetic modifications and the number is consistently increasing year by year. Its technical development started with slow freezing methods in the 1970s1, then followed by vitrification methods developed in the late 1980s2. Generally, the latter technique is advantageous in its quickness, simplicity, and high survivability of recovered embryos. However, the cryoprotectants contained are highly toxic and may affect subsequent embryo development. Therefore, the technique was not applicable to certain strains of mice, even when the solutions are cooled to 4&deg;C to mitigate the toxic effect during embryo handling. At the RIKEN BioResource Center, more than 5000 mouse strains with different genetic backgrounds and phenotypes are maintained3, and therefore we have optimized a vitrification technique with which we can cryopreserve embryos from many different strains of mice, with the benefits of high embryo survival after vitrifying and thawing (or liquefying, more precisely) at the ambient temperature4.
Here, we present a vitrification method for mouse embryos that has been successfully used at our center. The cryopreservation solution contains ethylene glycol instead of DMSO to minimize the toxicity to embryos5. It also contains Ficoll and sucrose for prevention of devitrification and osmotic adjustment, respectively. Embryos can be handled at room temperature and transferred into liquid nitrogen within 5 min. Because the original method was optimized for plastic straws as containers, we have slightly modified the protocol for cryotubes, which are more easily accessible in laboratories and more resistant to physical damages. We also describe the procedure of thawing vitrified embryos in detail because it is a critical step for efficient recovery of live mice. These methodologies would be helpful to researchers and technicians who need preservation of mouse strains for later use in a safe and cost-effective manner.

An ethylene glycol-based vitrification method for mouse embryos is described. It is advantageous to other methods in its simplicity and low embryonic toxicity, and therefore can be broadly applicable to many strains of mice, including inbred and gene-modified mice.

Cryopreservation של עוברי עכברים ידי Vitrification אתילן גליקול מבוסס

Cryopreservation of mouse embryos is a technological basis that supports biomedical sciences, because many strains of mice have been produced by genetic ...