Diese Arbeit wurde von der spanischen Ministerio de Educación y Ciencia (BIO 2006-11792) und der Generalitat de Catalunya (2005-SGR00437) unterstützt. Autoren möchten Marc Puigcerver und Jonatan Lucas für ihre technische Unterstützung danken, bei der Vorbereitung der Medien. Alle Mitarbeiter aus dem Servei d&#39;Estabulari ist für Tierhaltung anerkannt, und vor allem Juan Jose Martin und Javier Benito für ihre zusätzlichen Beitrag zur Aufzeichnung Teil dieses Video. NZB ist ein Fellow des portugiesischen Fundação para a Ciência e Tecnologia und SG ist ein Fellow des spanischen Ministerio de Educación y Ciencia.

Tierpflege und-verfahren wurden nach den Richtlinien und Vorschriften durch die Ethikkommission für die Tier-und Human Research der Universitat Autónoma von Barcelona, ​​Spanien zugelassen durchgeführt. I. Eizellenentnahme <ol><li> Prüfen Sie, und wählen weiblichen Hamster (Mesocricetus auratus; 8-12 Wochen alte) der Golden Syrian Belastung für das Vorhandensein einer dicken Ausfluss (postovulatorische Entladung). </li><li> Induce ausgewählten Weibchen durch intraperitoneale Injektion von 40 IE PMSG (Pregnant Mare Serum Gonadotropin), gefolgt von 40 IE hCG (humanes Chorion Gonadotropin) 60 Stunden später superovulate. </li><li> Euthanize weiblichen Hamster 16 Stunden nach der Verabreichung von hCG in einer Kohlendioxid-Kammer. </li><li> Isolieren Eileiter von den Weibchen wie in dem Video gezeigt und sie auf einen Tropfen KSOM-H-Medium. </li><li> Sammeln Oozyten-Cumulus-Komplexe durch Reißen des Eileiters Ampulle unter einem Stereomikroskop in einem Tropfen Hyaluronidase (156 U / ml) bei 37 ° C. Eizellen werden von Cumulus-Zellen in ca. 5 Minuten befreit werden. </li><li> Pick up Oozyten von Hyaluronidase und waschen Sie sie zweimal in KSOM-H-Medium. </li></ol> Für die Sammlung von Maus-Embryonen, weibliche Mäuse (Mus musculus; 6-8 Wochen alten) induziert werden, um durch intraperitoneale Injektion von 5 IU PMSG von 5 IU hCG 48 Stunden später und folgte gepaart mit männlichen Mäusen superovulate. Die Weibchen sind durch Genickbruch bei 24-26 geopfert, 44-46 oder 54-56 Stunden nach der Gabe von hCG zur Gewinnung von pronukleären, 2-Zell-oder 4-Zellen-Stadium eines Embryos beziehungsweise. Sammlung pronukleären Embryonen ist genau so, wie für Hamster-Oozyten beschrieben durchgeführt. Embryonen im 2-Zell-und 4-Zellen-Stadium werden durch Spülung der Eileiter mit KSOM-H-Medium [6] gesammelt. Hinweis: Nach diesem Protokoll etwa 20 bis 30 Eizellen / Embryonen können von jedem weiblichen gesammelt werden. II. Vorbereitung von Einfrieren und Auftauen Lösungen <ol><li> Bereiten Lösung, die ich durch Verdünnung 0,57 ml propilenglycol in 5 ml KSOM-H (1,5 M von propilenglycol). </li><li> Bereiten Auftauen Lösung durch Zugabe von 2 ml KSOM-H zu einem Schlauch mit 0,2052 g Saccharose (0,3 M Saccharose). </li><li> Bereiten Sie das Einfrieren durch Zugabe von 2 ml Lösung, die ich zu einem Schlauch mit 0,0684 g Saccharose (1,5 M von propilenglycol und 0,1 M Saccharose). </li></ol> Hinweis: Lösung I und Einfrieren und Auftauen Lösungen müssen unmittelbar vor ihrer Verwendung hergestellt werden. Allerdings können die angegebenen Mengen an Saccharose, um die Herstellung des Einfrieren und Auftauen Lösungen eingesetzt werden im Vorfeld abgewogen werden und in 3 ml-Röhrchen bei Raumtemperatur für mehrere Monate. III. Freezing-Protokoll <ol><li> Transfer-Oozyten / Embryonen aus der KSOM-H-Medium zu einem Rückgang der Lösung I und Inkubation für 7-15 Minuten bei Raumtemperatur. </li><li> In der Zwischenzeit bereiten eine 90 mm Petrischale die Strohhalme, indem 90 ul Tropfen Einfrieren und Auftauen Lösungen, wie es in dem Video (1 Tropfen jeder Lösung / Stroh) gezeigt wird geladen. </li><li> Übertragen Sie die gewünschte Anzahl von Eizellen / Embryonen auf das Einfrieren Lösung sinkt. Hinweis: Wir in der Regel zwischen 5 bis 30 Eizellen oder Embryonen / Drop übertragen. </li><li> Bringen Sie einen Strohhalm, um einen Mund gesteuert Absaugsystem und laden Sie sie in dieser Reihenfolge: Lösung I-, Luft-, Gefrier-Drop mit der Eizellen-, Luft-, Auftau-drop, Luft. </li><li> Nachdem das Stroh eingelegt ist, halten Absaugen, bis der erste Tropfen eingeführt (Lösung I) erreicht das Polymer am oberen Ende des Strohs und dichtet diese zu beenden. Thermo-Dichtung das andere Ende des Strohs oder Siegel mit einem Kunststoff-Stopfen. </li><li> Schalten Sie die programmierbare Gefrierschrank und wählen Sie das Einfrieren Programm. Das Einfrieren Programm im Sinne dieses Protokolls ist auf der Kühlraten ursprünglich von Lassalle et al veröffentlicht wurde. [7]: <ul><li> 2 ° C / min von Raumtemperatur bis -7 ° C 0 ° C / min für 10 min bis zum Temperaturausgleich und Induktion der Aussaat zu ermöglichen (siehe unten) </li><li> 0,3 ° C / min von -7 ° C bis -30 ° C 0 ° C / min für 2 min zum Temperaturausgleich ermöglichen </li><li> 35 ° C / min von -30 ° C bis -130 ° C </li></ul></li><li> Laden Sie die Strohhalme auf die Schlitze des Inhabers der programmierbaren Gefrierfach, um sicherzustellen, dass der Teil des Strohs mit dem Tropfen Auftauen Lösung ist nach außen. Starten Sie das Einfrieren Programm. </li><li> Wenn Probentemperatur -7 ° C und die Kühlung auf Eis erreicht, eine manuelle Aussaat: Planschbecken der Zange in flüssigen Stickstoff, ziehen Sie den Halter etwas aus der Tiefkühltruhe auf den Teil der Halme mit den Tropfen Auftauen Lösung auszusetzen, und sofort Berühren dieser Teil der Halme mit der Zange. Wiederholen Sie für jeden Halter und jeden Strohhalm in die Halterung, und lassen Sie dann das Einfrieren Programm bis zum Ende laufen. </li><li> Wenn das Programm beendet ist, tauchen die Inhaber in flüssigem Stickstoff. </li><li> Entfernen Sie die Strohhalme aus demInhaber und sie auf ein markiertes gobelet. </li><li> Schließlich speichern Sie die gobelet in einem flüssigen Stickstoff-Tank. </li></ol> IV. Auftauen Protokoll <ol><li> Entfernen Sie das Stroh aus dem flüssigen Stickstoff-Tank. </li><li> Pflegen Sie die Stroh bei Raumtemperatur für 40 Sekunden. </li><li> Weichen Sie das Stroh in einem Wasserbad bei 30 ° C während 40 Sekunden. </li><li> Entfernen Sie den Stecker aus der Stroh oder schneiden Sie die thermo-versiegelte Spitze. </li><li> Leeren Sie den Strohhalm in einer 35-mm-Petrischale und vorsichtig mischen die beiden Tropfen mit dem Einfrieren und Auftauen Lösungen. </li><li> Lassen Eizellen / Embryonen in die Mischung für 15 Minuten bei Raumtemperatur. </li><li> Transfer-Oozyten / Embryonen zu einem frischen Tropfen KSOM-H für weitere 15 Minuten bei 37 ° C. </li><li> Eizellen / Embryonen sind jetzt bereit zur weiteren Bearbeitung. </li></ol> Hinweis: Während der Schritte 6 und 7 sollten Sie sehen, dass die aufgetauten Eizellen / Embryonen langsam durch Rehydratation anschwellen. V. repräsentative Ergebnisse Der Einsatz der Kryokonservierung Protokoll hier berichteten Ergebnisse in eine Überlebensrate von ca. 95% für Hamster-Oozyten und von&gt; 90%, 85% und 80% für Maus B6CBAF1 Embryonen im pronukleären, 2-Zell-und 4-Zellen-Stadium, beziehungsweise. Wenn Mäuse-Embryonen in vitro sind in KSOM nach dem Auftauen kultiviert, sollte mindestens 70 bis 80% der Blastozysten-Stadium in optimalen Kulturbedingungen zu erreichen. Es wird empfohlen, dass Sie mit einer Kontrollgruppe (Stroh) von Oozyten / Embryonen in jedem Einfrieren Experiment und dass auch Sie Tauwetter dieser Gruppe vor dem Rest der Eizellen / Embryonen für weitere Manipulationen genutzt werden. Wenn die Überlebensraten für die Kontrollgruppe niedriger als erwartet sind, Tauwetter ein anderes Stroh aus der gleichen Charge. Wenn die Überlebenschancen für diese zweite Gruppe ebenfalls niedrig sind, werfen Sie die verbleibenden Strohhalme aus diesem Einfrieren viel.

<ol>
	<li>Whittingham, D. G., Leibo, S. P., Mazur, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Survival+of+mouse+embryos+frozen+to+-196+and+-269+&#176;C.">Survival of mouse embryos frozen to -196 and -269 &#176;C.</a> Science. 178, 411-414 (1972).</li><li>Wilmut, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+cooling+rate,+warming+rate,+cryoprotective+agent+and+stage+of+development+on+survival+of+mouse+embryos+during+freezing+and+thawing.">The effect of cooling rate, warming rate, cryoprotective agent and stage of development on survival of mouse embryos during freezing and thawing.</a> Life Sci. 11, 1071-1079 (1972).</li><li>Parkening, T. A., Tsunoda, Y., Chang, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+various+low+temperatures,+cryoprotective+agents+and+cooling+rates+on+the+survival,+fertilizability+and+development+of+frozen-thawed+mouse+eggs.">Effects of various low temperatures, cryoprotective agents and cooling rates on the survival, fertilizability and development of frozen-thawed mouse eggs.</a> J. Exp. Zool. 197, 369-374 (1976).</li><li>Schneider, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryobiological+principles+of+embryo+freezing.">Cryobiological principles of embryo freezing.</a> J. In Vitro Fert. Embryo Transf. 3, 3-9 (1986).</li><li>Vajta, G., Kuwayama, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improving+cryopreservation+systems.">Improving cryopreservation systems.</a> Theriogenology. 65, 236-244 (2006).</li><li>Duselis, A. R., Vrana, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retrieval+of+mouse+oocytes.">Retrieval of mouse oocytes.</a> JoVE. 3, (2007).</li><li>Lassalle, B., Testart, J., Renard, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+embryo+features+that+influence+the+success+of+cryopreservation+with+the+use+of+1,2+propanediol.">Human embryo features that influence the success of cryopreservation with the use of 1,2 propanediol.</a> Fertil. Steril. 44, 645-651 (1985).</li><li>Ib&#225;&#241;ez, E., Grossmann, M., Vidal, F., Egozcue, J., Santal&#243;, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryopreservation+of+caprine+beta-lactoglobulin+transgenic+mouse+embryos.">Cryopreservation of caprine beta-lactoglobulin transgenic mouse embryos.</a> Cryobiology. 35, 290-298 (1997).</li><li>Dinnyes, A., Wallace, G. A., Rall, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+genotype+on+the+efficiency+of+mouse+embryo+cryopreservation+by+vitrification+or+slow+freezing.">Effect of genotype on the efficiency of mouse embryo cryopreservation by vitrification or slow freezing.</a> Mol. Reprod. Dev. 40, 429-435 (1995).</li><li>Tateno, H., Kamiguchi, Y., Mikamo, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+freezing+and+thawing+method+of+hamster+oocytes+designed+for+both+the+penetration+test+and+chromosome+assay+of+human+spermatozoa.">A freezing and thawing method of hamster oocytes designed for both the penetration test and chromosome assay of human spermatozoa.</a> Mol. Reprod. Dev. 33, 202-209 (1992).</li><li>Biggers, J., McGuinnis, L. K., Raffin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amino+acids+and+preimplantation+development+of+the+mouse+in+the+protein-free+KSOM.">Amino acids and preimplantation development of the mouse in the protein-free KSOM.</a> Biol. Reprod. 63, 281-293 (2000).</li></ol>

Mit diesem Protokoll Hamster-Oozyten-und Maus-Embryonen erfolgreich kryokonserviert werden. Einmal gefroren, können Eizellen / Embryonen in flüssigem Stickstoff Tanks auf unbestimmte Zeit gespeichert und wiederhergestellt werden an jedem Ort und Zeit gewünscht. Dies bietet den Vorteil, dass Proben fast einsatzbereit, wann immer erforderlich. Auf der anderen Seite kann dieses Protokoll auch verwendet, um Embryo Kryobanken aus wertvollen Mausstämme (wie transgenen Linien), wie eine kostengünstige und sichere Alternative für die Aufrechterhaltung des lebenden Tieres Kolonien zu erzeugen. Es ist wichtig zu beachten, dass dieses Protokoll ist optimiert, um Hamster-Oozyten-und Hybrid-B6CBAF1 Mausembryonen Kryokonservierung. Unterschiede in der post-Tau-Überlebensrate von Maus-Embryonen mit unterschiedlichen genetischen Hintergründen wurden 8,9 beschrieben, so muss darauf geachtet werden, um die Kryokonservierung Bedingungen auf jede Art und Stamm Eizellen / Embryonen zu bewerten und das entsprechende Protokoll vor der Erzeugung der Eizelle etablieren oder der Embryo Kryobanken. Hamster-Oozyten können in menschlichen assistierten Reproduktion Kliniken für die Spermien Penetrationstest oder Spermien Chromosomenanalyse 10, oder als Übungsmaterial für Anfänger in intrazytoplasmatische Spermieninjektion (ICSI) verwendet werden. Auf der anderen Seite, können Maus-Hybrid B6CBAF1 Embryonen pronukleären oder 2-Zell-Stadium in der menschlichen assistierten Reproduktion Zentren oder in Forschungslabors verwendet werden, um die Qualität des Embryos Kulturmedien oder das ordnungsgemäße Funktionieren der Inkubatoren zu überprüfen.

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		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>French type mini-straw 0.25 ml</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Mini-tub</td>
<td>13407/0010</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>hCG</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Farma-Lepori, Spain</td>
<td>749036.4</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Hyaluronidase</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>H-3884</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>KSOM-H medium</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Ref. [11]</td>
</tr>
<tr>
<td>Liquid Nitrogen </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Air Liquide</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Plastic plugs</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Mini-tub</td>
<td>19046</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>PMSG</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Intervet, Spain</td>
<td>1.614/8447</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Propilenglycol</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fluka</td>
<td>82280</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Sucrose</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Merck</td>
<td>107687</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Surgical Scissors</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Aesculap</td>
<td>BC-060R; BG-061R</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Thermo-sealer</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>SIZ</td>
<td>220</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>35 and 90 mm culture dishes</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Nunc</td>
<td>153066; 150350</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>10 ml tubes</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Greiner Bio-one</td>
<td>163160</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Nitrogen tank</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>MVE, Cryogenics</td>
<td>XC 43/28</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Programmable Freezer</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Planner Products Ltd.</td>
<td>Kryo-10 Series III</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Forceps</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Aesculap</td>
<td>BD-331R; BD-053R; OC-020R</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

collection and cryopreservation of hamster oocytes and mouse embryos

Embryonen und Eizellen wurden zunächst erfolgreich mehr als 30 Jahren, kryokonserviert, wenn Whittingham<i&gt; Et al.</i&gt;<sup&gt; 1</sup&gt; Und Wilmut<sup&gt; 2</sup&gt; Gesondert beschrieben, dass Maus-Embryonen eingefroren konnte und bei -196 ° C gelagert und, ein paar Jahre später, Parkening<i&gt; Et al</i&gt;.<sup&gt; 3</sup&gt; Berichtet die Geburt des lebenden Nachkommen, die aus in-vitro-Fertilisation (IVF) von kryokonservierten Eizellen. Seitdem hat sich die Verwendung von Kryokonservierungstechniken rasch ausbreiten, um eine wesentliche Komponente in der Praxis der menschlichen und tierischen assistierten Reproduktion und in der Erhaltung der tiergenetischen Ressourcen geworden. Derzeit gibt es zwei Methoden verwendet, um Eizellen und Embryonen Kryokonservierung: Langsames Gefrieren und Verglasung. Eine Vielzahl von Ansätzen verwendet wurden, um zu versuchen, beide Techniken und Millionen von Tieren und Tausende von Kindern zu verbessern wurden von kryokonservierten Embryonen geboren worden. Jedoch schwerwiegende Mängel zugeordneten Kryokonservierung noch zu überwinden, da Eis-Kristall-Bildung, Lösung Effekte und osmotischen Schock scheinen mehrere cryoinjuries in post-aufgetaut Eizellen und Embryonen führen. Langsames Gefrieren mit programmierbaren Gefriergeräte hat den Vorteil, mit geringen Konzentrationen von Frostschutzmitteln, die meist mit chemischen Toxizität und osmotischen Schock verbunden sind, aber ihre Fähigkeit, Eis-Kristall-Bildung bei niedrigen Konzentrationen zu vermeiden, ist begrenzt. Langsames Gefrieren induziert auch Unterkühlung Effekte, die vermieden werden durch manuelle oder automatische Aussaat muss<sup&gt; 4</sup&gt;. In die Verglasung Prozess hemmen hohe Konzentrationen von Frostschutzmitteln die Bildung von Eiskristallen und führen zu der Bildung einer glasartigen verglasten Zustand, in dem Wasser verfestigt, aber nicht erweitert. Aufgrund der Toxizität von cyroprotectants bei den verwendeten Konzentrationen können Eizellen / Embryonen nur für die Gefrierschutzmittel Lösung für eine sehr kurze Zeit und in einem minimalen Volumen-Lösung ausgesetzt werden, bevor das Eintauchen der Proben direkt in flüssigem Stickstoff<sup&gt; 5</sup&gt;. In den letzten zehn Jahren hat der Verglasung werden immer beliebter, weil es eine sehr schnelle Methode, in denen keine teure Ausrüstung (programmierbar Tiefkühler) erforderlich ist. Jedoch weiterhin langsamen Einfrieren der am weitesten verbreitete Methode zur Eizelle / Kryokonservierung von Embryonen werden. In diesem Video-Artikel zeigen wir, Schritt-für-Schritt, wie zu sammeln und zu langsam einfrieren Hamster-Oozyten mit hoher post-Tau-Überlebensraten. Das gleiche Verfahren kann auch angewendet werden, um erfolgreich einfrieren und auftauen Maus-Embryonen in verschiedenen Stadien der Präimplantationsdiagnostik Entwicklung sein.

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Collection and Cryopreservation of Hamster Oocytes and Mouse Embryos

In diesem Video-Artikel präsentieren wir Ihnen eine Schritt-für-Schritt-Demonstration von Möglichkeiten zur Sammlung und Kryokonservierung Hamster-Oozyten mit hoher post-Tau-Überlebensraten. Das gleiche Verfahren kann auch angewendet werden, um erfolgreich einfrieren und auftauen Maus-Embryonen in verschiedenen Stadien der Präimplantationsdiagnostik Entwicklung sein.

Sammlung und Kryokonservierung von Oozyten Hamster und Maus Embryonen

Embryos and oocytes were first successfully cryopreserved more than 30 years ago, when Whittingham et al. 1 and Wilmut 2 separately described that mouse ...

collection-and-cryopreservation-of-hamster-oocytes-and-mouse-embryos

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

16.9K Aufrufe.  Universitat Autonoma de Barcelona. In diesem Video-Artikel präsentieren wir Ihnen eine Schritt-für-Schritt-Demonstration von Möglichkeiten zur Sammlung und Kryokonservierung Hamster-Oozyten mit hoher post-Tau-Überlebensraten. Das gleiche Verfahren kann auch angewendet werden, um erfolgreich einfrieren und auftauen Maus-Embryonen in verschiedenen Stadien der Präimplantationsdiagnostik Entwicklung sein.

Serie: Collection and Cryopreservation of Hamster Oocytes and Mouse Embryos

Nuclear Transfer into Mouse Oocytes

Nuclear transfer into an unfertilized oocyte can restore developmental potential to a differentiated cell. This demonstrates that the processes underlying development, differentiation and aging are epigenetic rather than genetic processes. The reversibility of these processes opens exciting perspectives in basic research, and in the more distant future, in regenerative medicine. In the mouse, embryonic stem cells can be derived from cloned preimplantation stage embryos. Such embryonic stem cells have the ability to give rise to all cell types of the adult organism. Importantly, these cells are genetically identical to the donor. If applicable to human, this would allow the derivation of stem cells from a patient. These cells could then be differentiated into the affected cell type of the patient and studied in vitro, or used to replace the damaged or missing cells. The study of nuclear transfer in the mouse remains important as it can inform us about the principles of nuclear reprogramming. This movie and the accompanying protocol are intended to help learning nuclear transfer in the mouse, a method initially developed in the group of Prof. Yanagimachi (WAKAYAMA et al. 1998).

This movie and the protocol are intended to help learning nuclear transfer.

Nuclear Transfer in Maus-Oozyten

Nuclear transfer into an unfertilized oocyte can restore developmental potential to a differentiated cell. This demonstrates that the processes underlying ...

Forschung

Biologie

Dissection of 6.5 dpc Mouse Embryos

Analysis of gene expression patterns during early stages of mammalian embryonic development can provide important clues about gene function, cell-cell interaction and signaling mechanisms that guide embryonic patterning. However, dissection of the mouse embryo from the decidua shortly after implantation can be a challenging procedure, and detailed step-by-step documentation of this process is lacking.

Here we demonstrate how post-implantation (6.5 dpc) embryos are isolated by first dissecting the uterus of a pregnant mouse (detection of the vaginal plug was designated day 0.5 poist coitum) and subsequently dissecting the embryo from maternal decidua. The dissection of Reichert's membrane is described as well as the removal of the ectoplacental cone.

Isolation of postimplantation-stage embryos allows one to study gene patterning and analyze cell-lineage decision making processes during embryonic development, but proper dissection of the early embryo can be challenging. This protocol describes a method for isolating early primitive-streak-stage embryos (~6.5 days post coitum [dpc]).

Dissection von 6,5 dpc muriner Embryonen

Analysis of gene expression patterns during early stages of mammalian embryonic development can provide important clues about gene function, cell-cell ...

Retrieval of Mouse Oocytes

To date, only a few studies have reported successful manipulations of Peromyscus embryogenesis or reproductive biology.  Together with the Peromyscus Genetic Stock Center (http://stkctr.biol.sc.edu), we are characterizing the salient differences needed to develop this system.  A primary goal has been to optimize oocyte/early embryo retrieval.

This protocol illustrates the technique for extracting oocytes or early-stage fertilized embryos from the oviduct of mice. The ability to identify the infindibulum and insert a blunt end needle into it is essential to correctly performing the procedure.

Retrieval von Maus-Oozyten

To date, only a few studies have reported successful manipulations of Peromyscus embryogenesis or reproductive biology.  Together with the Peromyscus ...

Plastic Embedding and Sectioning of Xenopus laevis Embryos

Plastic sections maintain true tissue morphology in thin sections of tissue that can be immunostained with fluorescent secondary antibodies, making this method more useful than paraffin-embedded or frozen sections for many types of tissue. The method for staining, plastic embedding, and sectioning is demonstrated in this video.

Plastic Embedding und Schnitte von Xenopus laevis Embryonen

In Utero Intraventricular Injection and Electroporation of E15 Mouse Embryos

In-utero in-vivo injection and electroporation of the embryonic mouse neocortex provides a powerful tool for the manipulation of individual progenitors lining the walls of the lateral ventricle. This technique is now widely used to study the processes involved in corticogenesis by over-expressing or knocking down genes and observing the effects on cellular proliferation, migration, and differentiation. In comparison to traditional knockout strategies, in-utero electroporation provides a rapid means to manipulate a population of cells during a specific temporal window. In this video protocol we outline the experimental methodology for preparing mice for surgery, exposing the uterine horns through laporatomy, injecting DNA into the lateral ventricles of the developing embryo, electroporating DNA into the progenitors lining the lateral wall, and caring for animals post-surgery. Our laboratory uses this protocol for surgeries on E13-E16 mice, however, it is most commonly performed at E15, as shown in this video. 

In Utero intraventrikuläre Injektion und Elektroporation von E15 muriner Embryonen

In-utero in-vivo injection and electroporation of the embryonic mouse neocortex provides a powerful tool for the manipulation of individual progenitors ...

Microinjection of Xenopus Laevis Oocytes

Microinjection of Xenopus laevis oocytes followed by thin-sectioning electron microscopy (EM) is an excellent system for studying nucleocytoplasmic transport. Because of its large nucleus and high density of nuclear pore complexes (NPCs), nuclear transport can be easily visualized in the Xenopus oocyte. Much insight into the mechanisms of nuclear import and export has been gained through use of this system (reviewed by Pant&eacute;, 2006). In addition, we have used microinjection of Xenopus oocytes to dissect the nuclear import pathways of several viruses that replicate in the host nucleus. 
Here we demonstrate the cytoplasmic microinjection of Xenopus oocytes with a nuclear import substrate. We also show preparation of the injected oocytes for visualization by thin-sectioning EM, including dissection, dehydration, and embedding of the oocytes into an epoxy embedding resin. Finally, we provide representative results for oocytes that have been microinjected with the capsid of the baculovirus Autographa californica nucleopolyhedrovirus (AcMNPV) or the parvovirus Minute Virus of Mice (MVM), and discuss potential applications of the technique.

Here we demonstrate cytoplasmic microinjection of Xenopus laevis oocytes with a nuclear import substrate, as well as preparation of the injected oocytes for visualization by thin-sectioning electron microscopy.

Mikroinjektion von Xenopus laevis Oozyten

Microinjection of Xenopus laevis oocytes followed by thin-sectioning electron microscopy (EM) is an excellent system for studying nucleocytoplasmic ...

Seawater Sampling and Collection

This video documents methods for collecting coastal marine water samples and processing them for various downstream applications including biomass concentration, nucleic acid purification, cell abundance, nutrient and trace gas analyses. For today's demonstration samples were collected from the deck of the HMS John Strickland operating in Saanich Inlet. An A-frame derrick, with a multi-purpose winch and cable system, is used in combination with Niskin or Go-Flo water sampling bottles. Conductivity, Temperature, and Depth (CTD) sensors are also used to sample the underlying water mass. To minimize outgassing, trace gas samples are collected first.  Then, nutrients, water chemistry, and cell counts are determined. Finally, waters are collected for biomass filtration. The set-up and collection time for a single cast is ~1.5 hours at a maximum depth of 215 meters. Therefore, a total of 6 hours is generally needed to complete the collection series described here.

This video documents methods for collecting coastal marine water samples and processing them for various downstream applications including biomass concentration, nucleic acid purification, cell abundance, nutrient and trace gas analyses.

Meerwasser Probenahme und Sammlung

This video documents methods for collecting coastal marine water samples and processing them for various downstream applications including biomass ...

In vivo Imaging and Therapeutic Treatments in an Orthotopic Mouse Model of Ovarian Cancer

Human cancer and response to therapy is better represented in orthotopic animal models. This paper describes the development of an orthotopic mouse model of ovarian cancer, treatment of cancer via oral delivery of drugs, and monitoring of tumor cell behavior in response to drug treatment in real time using in vivo imaging system. In this orthotopic model, ovarian tumor cells expressing luciferase are applied topically by injecting them directly into the mouse bursa where each ovary is enclosed. Upon injection of D-luciferin, a substrate of firefly luciferase, luciferase-expressing cells generate bioluminescence signals. This signal is detected by the in vivo imaging system and allows for a non-invasive means of monitoring tumor growth, distribution, and regression in individual animals. Drug administration via oral gavage allows for a maximum dosing volume of 10 mL/kg body weight to be delivered directly to the stomach and closely resembles delivery of drugs in clinical treatments. Therefore, techniques described here, development of an orthotopic mouse model of ovarian cancer, oral delivery of drugs, and in vivo imaging, are useful for better understanding of human ovarian cancer and treatment and will improve targeting this disease.

In vivo Imaging and Therapeutic Treatments in an Orthotopic Mouse Model of Ovarian Cancer

Orthotopic animal models of ovarian cancer replicate better human disease and therefore enhance our understanding of cancer progression and tumor response to therapy. A mouse model receives an intrabursal injection of luciferase-expressing ovarian tumor cells. Treatment is administered via oral gavage. Tumor growth is monitored by in vivo imaging system.

In-vivo-Imaging und therapeutische Behandlungen in einem orthotopen Mausmodell des Eierstockkrebs

Human cancer and response to therapy is better represented in orthotopic animal models.  This paper describes the development of an orthotopic mouse model ...

Cryopreservation of Preimplantation Embryos of Cattle, Sheep, and Goats

Preimplantation embryos from cattle, sheep, and goats may be cryopreserved for short- or long-term storage. Preimplantation embryos consist predominantly of water, and the avoidance of intracellular ice crystal formation during the cryopreservation process is of paramount importance to maintain embryo viability. Embryos are placed into a hypertonic solution (1.4 &#x2013; 1.5 M) of a cryoprotective agent (CPA) such as ethylene glycol (EG) or glycerol (GLYC) to create an osmotic gradient that facilitates cellular dehydration. After embryos reach osmotic equilibrium in the CPA solution, they are individually loaded in the hypertonic CPA solution into 0.25 ml plastic straws for freezing. Embryos are placed into a controlled rate freezer at a temperature of -6&deg;C. Ice crystal formation is induced in the CPA solution surrounding the embryo, and crystallization causes an increase in the concentration of CPA outside of the embryo, causing further cellular dehydration. Embryos are cooled at a rate of 0.5&deg;C/min, enabling further dehydration, to a temperature of -34&deg;C before being plunged into liquid nitrogen (-196&deg;C). Cryopreserved embryos must be thawed prior to transfer to a recipient (surrogate) female. Straws containing the embryos are removed from the liquid nitrogen dewar, held in room temperature air for 3 to 5 sec, and placed into a 37&deg;C water bath for 25 to 30 sec. Embryos cryopreserved in GLYC are placed into a 1 M solution of sucrose for 10 min for removal of the CPA before transfer to a recipient (surrogate) female. Embryos cryopreserved in EG, however, may be directly transferred to the uterus of a recipient.

Preimplantation embryos may be cryopreserved after placement into a hypertonic cryoprotective solution to cause cellular dehydration. After equilibration, ice crystal formation is induced in the solution surrounding the embryo. Further dehydration occurs as the embryo is slowly cooled to subzero temperatures before plunging into liquid nitrogen for storage.

Kryokonservierung von Präimplantationsembryonen von Rindern, Schafen und Ziegen

Preimplantation embryos from cattle, sheep, and goats may be cryopreserved for short- or long-term storage.  Preimplantation embryos consist predominantly ...

Cryopreservation of Mouse Embryos by Ethylene Glycol-Based Vitrification

Cryopreservation of mouse embryos is a technological basis that supports biomedical sciences, because many strains of mice have been produced by genetic modifications and the number is consistently increasing year by year. Its technical development started with slow freezing methods in the 1970s1, then followed by vitrification methods developed in the late 1980s2. Generally, the latter technique is advantageous in its quickness, simplicity, and high survivability of recovered embryos. However, the cryoprotectants contained are highly toxic and may affect subsequent embryo development. Therefore, the technique was not applicable to certain strains of mice, even when the solutions are cooled to 4&deg;C to mitigate the toxic effect during embryo handling. At the RIKEN BioResource Center, more than 5000 mouse strains with different genetic backgrounds and phenotypes are maintained3, and therefore we have optimized a vitrification technique with which we can cryopreserve embryos from many different strains of mice, with the benefits of high embryo survival after vitrifying and thawing (or liquefying, more precisely) at the ambient temperature4.
Here, we present a vitrification method for mouse embryos that has been successfully used at our center. The cryopreservation solution contains ethylene glycol instead of DMSO to minimize the toxicity to embryos5. It also contains Ficoll and sucrose for prevention of devitrification and osmotic adjustment, respectively. Embryos can be handled at room temperature and transferred into liquid nitrogen within 5 min. Because the original method was optimized for plastic straws as containers, we have slightly modified the protocol for cryotubes, which are more easily accessible in laboratories and more resistant to physical damages. We also describe the procedure of thawing vitrified embryos in detail because it is a critical step for efficient recovery of live mice. These methodologies would be helpful to researchers and technicians who need preservation of mouse strains for later use in a safe and cost-effective manner.

An ethylene glycol-based vitrification method for mouse embryos is described. It is advantageous to other methods in its simplicity and low embryonic toxicity, and therefore can be broadly applicable to many strains of mice, including inbred and gene-modified mice.

Kryokonservierung von Maus Embryonen durch Ethylen-Glykol-Based Vitrification

Cryopreservation of mouse embryos is a technological basis that supports biomedical sciences, because many strains of mice have been produced by genetic ...