המחקר נערך בשיתוף פעולה עם פרויקט BioResource הלאומי, משרד החינוך, התרבות, הספורט, המדע והטכנולוגיה, יפן.

התוכנית הכוללת של הניסוי מוצג באיור. 1. 1. מגיב הכנה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפוך את המדיום הבסיס (כאן המכונה PB1) בתוך בקבוק זכוכית 100 מ&quot;ל לפי התרשים הבא להלן: <table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td></td><td> MW </td><td> mM </td><td> mg/100ml </td></tr><tr><td> NaCl </td><td> 58.4 </td><td> 136.98 </td><td> 800.0 </td></tr><tr><td> KCl </td><td> 74.6 </td><td> 2.68 </td><td> 20.0 </td></tr><tr><td> KH 2 PO 4 </td><td> 136.1 </td><td> 1.47 </td><td> 20.0 </td></tr><tr><td> Na 2 HPO 4 0.12 H 2 O </td><td> 358.14 </td><td> 8.04 </td><td> 288.1 </td></tr><tr><td> MgCl 2, 6 שעות 2 O </td><td> 203.3 </td><td> 0.49 </td><td> 10.0 </td></tr><tr><tד&gt; גלוקוז </td><td> 180.2 </td><td> 5.56 </td><td> 100.0 </td></tr><tr><td> Na pyruvate </td><td> 110 </td><td> 0.33 </td><td> 3.6 </td></tr><tr><td> CaCl 2, 2H 2 O </td><td> 147 </td><td> 0.9 </td><td> 13.2 </td></tr><tr><td> פניצילין G </td><td></td><td></td><td> 6.0 (בערך) </td></tr></tbody></table></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפוך את Ficoll-סוכרוז (FS) פתרון: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מוסיפים את כימיקלים הבא 14 מ&quot;ל של תמיסת PB1 בתוך שפופרת 50 מ&quot;ל. <table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> Ficoll 70 </td><td> 6.0 גרם </td></tr><tr><td> סוכרוז </td><td> 3.424 גרם </td></tr><tr><td> BSA </td><td> 42.0 מ&quot;ג </td></tr></tbody></table></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבבים Ficoll 70 ו סוכרוז בתמיסה PB1 ולנער היטב עד שהיא נמסה לחלוטין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר בדיקת פירוק מוחלט לעיל, להוסיף BSA על פני הפתרון ולשמור אותו4oC עד BSA הוא נמס לגמרי (&gt; 4 שעות או למשך הלילה). </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפוך את פתרון איזון (EFS20) והפתרון vitrification (EFS40) בתוך שפופרת 50 מ&quot;ל: <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> EFS20: 20% (v / v) אתילן גליקול, 24% (w / v) Ficoll, ו 0.4 mol / L סוכרוז ב PB1 עם BSA </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> EFS40: 40% (v / v) אתילן גליקול, 18% (w / v) Ficoll, ו 0.3 mol / L * סוכרוז ב PB1 עם BSA * לקבלת עוברים מהלחץ BALB / c או ICR, להגדיל את הריכוז של סוכרוז כדי סוכרוז mol / L 0.9 משום שהם רגישים יותר cryodamage 6. </li></ul><table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td></td><td> EFS20 פתרון </td><td> EFS40 פתרון </td></tr><tr><td> אתילן גליקול </td><td> 1 מ&quot;ל </td><td> 2 מ&quot;ל </td></tr><tr><td> FS פתרון </td><td> 4 מ&quot;ל </td><td> 3 מ&quot;ל </td></tr></tbody></table></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעקר את הפתרון על ידי סינון באמצעות filte 0.45 מיקרומטרr. הפוך את aliquots ב 5 צינורות פוליסטירן מ&quot;ל ולאחסן ב 4 ° C. הם יכולים לשמש במשך כ 6 חודשים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנת פתרון הפשרה העובר המכיל 0.75 סוכרוז M (TS1) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ממיסים 7.7 גרם סוכרוז ב PB1 (מוכן בשלב 1.1) ולהביא את הנפח הכולל עד 30 מ&quot;ל. מערבבים על ידי ניעור עדין עד סוכרוז הוא נמס לגמרי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 90 מ&quot;ג של ארגון ה-BSA על פני השטח את הפתרון ולהשאיר אותו לעמוד עד שהיא נמסה לחלוטין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעקר את הפתרון על ידי סינון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Aliquot ולאחסן ב 4 ° C. הם יכולים לשמש במשך כחודש 1. </li></ol> הערה: TS1 יכול גם להיות מוכנים מ M2 זמינים מסחרית. <ol start="6" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ממיסים 7.7 גרם סוכרוז ב M2 ולהביא את הנפח הכולל עד 30 מ&quot;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבבים על ידי ניעור עדין עד סוכרוז הוא נמס לגמרי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעקר את הפתרון על ידי סינון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Aliquot ולאחסן בבית 4oC. הם יכולים לשמש במשך כחודש 1. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> (TS2 הפשרה פתרוןהמכיל 0.25 סוכרוז M): <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מדולל 10 מ&quot;ל TS1 עם נפח של 20 מ&quot;ל PB1 או M2, לפי העניין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Aliquot ולאחסן ב 4 ° C. הם יכולים לשמש במשך כחודש 1. </li></ol></li></ol> 2. Vitrification של 2-תא עוברי עכברים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן 2 תאים עכבר עוברי על ידי הזדווגות טבעית או קונבנציונלית טכניקות הפריה חוץ גופית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Aliquot 50 EFS40 μl לתוך cryotube. להלן, לבצע את שאר ההליך vitrification בטמפרטורת החדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 50 Aliquot μl של EFS20 על החלק התחתון של 35 מ&quot;מ או 60 מ&quot;מ צלחת פטרי פלסטיק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת עד 30 עוברים אל EFS20 באמצעות זכוכית נימי עם כמות מינימלית בלבד של המדיום לתרבות. הפעלת טיימר 2 דקות. הערה: עוברים מקום בחלק התחתון של הירידה. זה גורם להתייבשות יעיל של עוברים. בדוק את המורפולוגיה של העוברים על ידי stereomicroscope. עוברים מיובש להראות מורפולוגיה מצומק, כפי שמוצג באיור. 2A.אם הם לא מספיק מיובש, לחכות עוד 1 או 2 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בשלב דקות על 1.5, להרים את העוברים מירידה EFS20 עם סכום מינימלי בלבד של הפתרון. העברת אותם EFS40 ב cryotube שהוכנו 2.1 צעד. הערה: לקבלת התוצאות הטובות ביותר, להתאים את התזמון של מרים עוברים כך שכל העוברים ניתן להעביר לתוך EFS40 ב 2 דקות בערך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חכו דקות 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שים את cryotube ישירות לתוך חנקן נוזלי (LN 2). </li></ol> 3. הפשרה מזוגגת 2 תא עוברי עכברים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפני הפשרה, להכין צלחת עם 10 טיפות של μl בינוני העובר תרבות עוברי התאושש (ראה שלב 3.13). מכסים את צלחת עם שמן ומניחים CO 2 באינקובטור עד לשימוש. הערה: למרות כל אמצעי התקשורת לתרבות העובר שגרתי ניתן להשתמש בניסוי זה, אנו ממליצים התקשורת עם osmolarity גבוה כגון בינוני M16. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חם TS1 ל 37 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשים מסכה על הפנים cryogloves. פתח את 2 LN tank ולאחזר cryotube המכילות עוברים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפתוח במהירות את החלק העליון של הצינור וזורקים LN 2. חכו 30 שניות כדי למנוע TS1 מן המקפיא בבית לשלב הבא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש פיפטה 1000ul להוסיף 850 μl של TS1 (37 ° C) לתוך הצינור ומערבבים את הפתרון על ידי pipettings עדין (כעשר פעמים ב 25 שניות) עד הפתרון הוא מומס שווה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעבירים את כל נפח של הצינור אל צלחת פטרי פלסטיק 60 מ&quot;מ (או זכוכית שעון) (איור 3A). הערה: עוברים יש לטפל בטמפרטורת החדר (22-25 ° C) עד שהן ממוקמות 2 CO 3.14 חממה בכל שלב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התחל טיימר 3 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ב 2 דקות בערך ב TS1, לנער בעדינות את המנה עד בינוני המכיל עוברים משתרע על פני השטח של צלחת (איור 3B). הערה: זה יעזור העוברים לרדת למטה משום שהם צפים קרוב לפני השטח, כאשר הועבר TS1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להציב שלושה 50 טיפות של μl TS2 על הדואר צלחת (איור 3 ג). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחרי 3 דקות בתוך TS1, לבדוק את המורפולוגיה של העוברים על ידי stereomicroscope, הם צריכים להיות מכווץ מעט. ראה את המורפולוגיה של העוברים קודם לכן (איור 2B) ומאוחר יותר (איור 2C) ב TS1. הערה: אם עוברים הם עדיין נפוחות, לשמור אותם במשך יותר TS1 1 עד 3 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הרם את העוברים ולהעבירם ירידה הראשון של TS2 (איור 3D). התחל טיימר 3 דקות </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר 3 דקות, העברת עוברים לירידה השני ולאחר מכן ירידה השלישי (איור 3E). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת עוברים למדיום תרבות מוכנים בשלב 3.1. עוברים הם בצורת באיור. 2D. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים צלחת בתוך CO 2 באינקובטור. כ -10 דקות מאוחר יותר, העברת עוברים לירידה הבא של המדיום תרבות לשטוף את סוכרוז כי בוצעה על מ TS2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המשך התרבות חממה CO2 עד החזרת העוברים. הערה: העברת embryos על oviducts של נקבות הנמען ביום הפשרה. תרבות לונג במבחנה עלולה להפחית את הכדאיות של עוברים בכמה זנים של עכברים. </li></ol> 4. נציג תוצאות: במבחנה - ובפיתוח-vivo של עוברים לאחר ההפשרה מוצג לוחות 1 ו -2. היתרונות של פרוטוקול זה הן שרידות גבוהה של עוברים לאחר ההפשרה ואת הישימות שלו רחב זנים שונים של עכברים. <table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> זן </td><td> מספר כולל של צינורות </td><td> מספר עוברי מזוגגת </td><td> ששוחזרו (מס &#39;(%)) </td><td> נורמלי מורפולוגית (מס &#39;(%)) </td><td> פיתוח ל blastocysts (מס &#39;(%)) </td></tr><tr><td> C57BL/6J </td><td> 20 </td><td> 400 </td><td> 397 (99) </td><td> 394 (99) </td><td> 342 (87) </td></tr><tr><td> BALB / CA </td><td> 15 </td><td> 300 </td><td> 296 (99) </td><td> 282 (95) </td><td> 238 (84) </td></tr><tr><td> ICR </td><td> 24 </td><td> 480 </td><td> 474 (99) </td><td> 443 (93) </td><td> 398 (90) </td></tr></tbody></table> טבלה 1. בפיתוח חוץ גופית של מזוגגת-מופשר עוברים זנים עכבר משותף <table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> מצב של עוברים </td><td> מספר הנמען נקבות </td><td> מספר עוברי העבירה </td><td> השרשה אתרים (מס &#39;(%)) </td><td> חיים צאצאים (מס &#39;(%)) </td></tr><tr><td> טרי </td><td> 12 </td><td> 180 </td><td> 141 (78.3) </td><td> 110 (61.1) </td></tr><tr><td> מזוגגת </td><td> 16 </td><td> 242 </td><td> 202 (83.5) </td><td> 125 (51.7) </td></tr></tbody></table> טבלה 2. בפיתוח-vivo של מזוגגת-מופשר עוברי עכברים C57BL/6J. <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/3155/3155fig1.jpg" /> איור 1. התכנית הכוללת של הניסוי כולל איזון, vitrification, ואת הפשרת עוברים. <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/3155/3155fig2.jpg" /> באיור 2. המורפולוגיה של העוברים בכל שלב ההפשרה. <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/3155/3155fig3.jpg" /> באיור 3. הפשרה בהליך של עוברים. כל ההליכים מתבצעים בטמפרטורת החדר. (א), הוסף 850 μl של TS1 (37 ° C) לתוך cryotube ולהעביר את כל נפח של הפתרון cryotube על צלחת פלסטיק. בשלב זה, עוברים את המראה הנפוח, כפי שמוצג באיור. 2B. (ב), מורחים את הפתרון על פני השטח של צלחת ידי ניעור עדין. (ג), מקום three 50 טיפות של μl TS2 על צלחת הפלסטיק. (ד), מעבירים את העוברים לירידה הראשון של TS2. לאחר 3 דקות, עוברים את המראה shurunken כפי שמוצג באיור. 2C. (ה), להעבירם סדרתיly לתוך TS2 הנותרים טיפות ואז המדיום לתרבות.

<ol>
	<li>Whittingham, D. G., Leibo, S. P., Mazur, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Survival+of+mouse+embryos+frozen+to+-196&#176;+and+-269&#176;C.">Survival of mouse embryos frozen to -196&#176; and -269&#176;C.</a> Science. 187, 411-414 (1972).</li><li>Rall, W. F., Fahy, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ice-free+cryopreservation+of+mouse+embryos+at+-196&#176;C+by+vitrification.">Ice-free cryopreservation of mouse embryos at -196&#176;C by vitrification.</a> Nature. 313, 573-575 (1985).</li><li>Yoshiki, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mouse+resources+at+the+RIKEN+BioResource+center.">The mouse resources at the RIKEN BioResource center.</a> Exp. Anim. 58, 85-96 (2009).</li><li>Mochida, K., Ogura, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryopreservation+of+embryos+in+laboratory+species.">Cryopreservation of embryos in laboratory species.</a> J. Mamm. Ova. Res. 27, 87-92 (2010).</li><li>Kasai, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+method+for+mouse+embryos+cryopreservation+in+a+low+toxicity+vitrification+solution,+without+appreciable+loss+of+viability.">A simple method for mouse embryos cryopreservation in a low toxicity vitrification solution, without appreciable loss of viability.</a> J. Reprod. Fert. 89, 91-97 (1990).</li><li>Dinnyes, A., Wallace, G. A., Rall, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+genotype+on+the+efficiency+of+mouse+embryo+cryopreservation+by+vitrification+or+slow+freezing+methods.">Effect of genotype on the efficiency of mouse embryo cryopreservation by vitrification or slow freezing methods.</a> Mol. Reprod. Dev. 40, 429-435 (1995).</li><li>Kasai, M., Mukaida, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryopreservation+of+animal+and+human+embryos+by+vitrification.">Cryopreservation of animal and human embryos by vitrification.</a> Reprod. Biomed. Online. 9, 164-170 (2004).</li><li>Miyake, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vitrification+of+mouse+oocytes+and+embryos+at+various+stages+of+development+in+an+ethylene+glycol-based+solution+by+a+simple+method.">Vitrification of mouse oocytes and embryos at various stages of development in an ethylene glycol-based solution by a simple method.</a> Theriogenology. 40, 121-134 (1993).</li><li>Han, M. S., Niwa, K., Kasai, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vitrification+of+rat+embryos+at+various+developmental+stages.">Vitrification of rat embryos at various developmental stages.</a> Theriogenology. 59, 1851-1863 (2003).</li><li>Jin, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Equilibrium+vitrification+of+mouse+embryos.">Equilibrium vitrification of mouse embryos.</a> Biol. Reprod. 82, 444-450 (2010).</li></ol>

אין לנו שום דבר לגלות.

מאז הדו&quot;ח הראשון של vitrification העובר עכבר ידי Rall ו פאהי ב -1985 2, שיפורים טכניים שונים נעשו כדי להגדיל את השרידות של עוברים לאחר ההפשרה. אחד השינויים המוצלחים ביותר הושג על ידי שימוש אתילן גליקול כמו cryoprotectant בגלל רעילות נמוכה שלה גבוהה קרום חדירות. יתרונות אלה מאפשרים לנו להתמודד עם העוברים הקפאה בטמפרטורת החדר 4; vitrification שיטות אחרות דורשות העובר מסירת בטמפרטורות קריר הם לא תמיד ישים כמה זנים של עכברים כולל BALB / c 6. אתילן גליקול first vitrification מבוססי פותחה על ידי קסאי et al. בשנת 1990 5,7. בגלל השיטה המקורית היתה אופטימיזציה עבור קשיות כמו מכולות, יש לנו את הפרוטוקול שונה מעט עבור cryotubes, אשר נגיש יותר בקלות במעבדות עמידים יותר בפני נזקים פיזיים. לכן, השיטה vitrification המתוארת כאן עשויה להיות האפליקציהlicable למעבדות רבות תוך שימוש בעכברים כמודל מחקר. השיטה זהה יכול לשמש גם עבור עוברי עכברים בבית morula ושלבי הבלסטוציסט 8 ו - 9 עוברים חולדה. עם זאת, מצאנו לאחרונה כי איכות cryotubes עשויים להשפיע על שיעורי ההישרדות של עוברים לאחר הקפאה, הפשרה. לכן, חשוב לבחון את פני השטח הפנימי של cryotubes עבור החלקות שלה לפני עוברי vitrifying (לדוגמא: לראות את לוח ריאגנטים ספציפיים וציוד). שיטות Vitrification יש יתרונות רבים על פני שיטות קונבנציונליות הקפאה איטית, אבל הם מטבעם יש חיסרון ביחס לצורך תחבורה. כאשר עוברים מזוגגת צריך להישמר ב -120 מעלות צלזיוס מתחת לשמור על יכולת הקיום שלהם, משלחים יבשים משמשים בדרך כלל עבור תחבורה בטוחה שלהם. משלוחים יבש הם מגושמת וכבדה, ואת שלהם הלוך ושוב הוא יקר, במיוחד עבור תחבורה בינלאומי. עכשיו אנחנו כרגע מפתחים שיטה vitrification חדשאשר עוברים מזוגגת ניתן לאחסן בטמפרטורת קרח יבש (כ -80 ° C) לפחות 7 ימים 10. שיטה זו צריכה להיות vitrification של הדור הבא.

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tr><td> שם מגיב </td><td> חברה </td><td> מספר קטלוגי </td><td> הערות (אופציונלי) </td></tr><tr><td> שור בסרום אלבומין </td><td> מרק Biosciences (Calbiochem) </td><td> 12657 </td><td></td></tr><tr><td> אתילן גליקול </td><td> Wako טהור תעשיות כימיות </td><td> 058-00986 </td><td></td></tr><tr><td> Ficoll 70 </td><td> GE Healthcare </td><td> 17-0310-10 </td><td></td></tr><tr><td> גלוקוז </td><td> Wako טהור תעשיות כימיות </td><td> 041-00595 </td><td></td></tr><tr><td> NaCl </td><td> Wako טהור תעשיות כימיות </td><td> 191-01665 </td><td></td></tr><tr><td> KCl </td><td> Wako טהור תעשיות כימיות </td><td> 163-03545 </td><td></td></tr><tr><td> KH 2 PO 4 </td><td> Wako טהור תעשיות כימיות </td><td> 169-04245 </td><td></td></tr><tr><td> Na 2 HPO 4 ° 12 שעות 2 </sUB&gt; O </td><td> Wako טהור תעשיות כימיות </td><td> 500-04195 </td><td></td></tr><tr><td> MgCl 2 · 6 שעות 2 O </td><td> Wako טהור תעשיות כימיות </td><td> 135-00165 </td><td></td></tr><tr><td> CaCl 2 · 2H2O </td><td> Wako טהור תעשיות כימיות </td><td> 031-00435 </td><td></td></tr><tr><td> פניצילין G </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P-4687 </td><td></td></tr><tr><td> נתרן pyruvate </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P-8574 </td><td></td></tr><tr><td> סוכרוז </td><td> Wako טהור תעשיות כימיות </td><td> 196-00015 </td><td></td></tr><tr><td> M16 בינוני </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> M7292 </td><td></td></tr><tr><td> M2 בינוני </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> M7167 </td><td></td></tr><tr><td> Cryotube </td><td> Sumitomo הבקליט </td><td> MS-4501 </td><td> &quot;קריוגני Vial&quot; </td></tr></table>

cryopreservation of mouse embryos by ethylene glycol-based vitrification

Cryopreservation של עוברי עכברים בסיס טכנולוגי התומך מדעים ביו, כי זנים רבים של עכברים הופקו על ידי שינויים גנטיים המספר גדל בעקביות שנה אחר שנה. הפיתוח הטכני שלה התחיל עם שיטות הקפאה איטית בשנות ה -1970 1, לאחר מכן על ידי שיטות vitrification שפותחה בסוף שנות ה 1980 2. באופן כללי, הטכניקה האחרונה היא יתרון זריזות שלו, הפשטות, ושרידות גבוהה של עוברים התאושש. עם זאת, cryoprotectants הכלול הם רעילים ועלולים להשפיע על התפתחות העובר הבאים. לכן, השיטה לא יושמה על זנים מסוימים של עכברים, גם כאשר הפתרונות הם מקורר 4 ° C כדי למתן את האפקט הרעיל במהלך הטיפול העובר. לכל BioResource RIKEN המרכז, יותר מ 5000 זנים עכבר עם רקע גנטי שונה פנוטיפים מתוחזקים 3, ולכן יש לנו אופטימיזציה te vitrificationchnique שבה אנחנו יכולים cryopreserve עוברים מן זנים שונים של עכברים, עם היתרונות של הישרדות גבוה העובר לאחר vitrifying ו מפשיר (או המסה, ליתר דיוק) בטמפרטורת הסביבה 4. כאן, אנו מציגים שיטה vitrification עבור עוברי עכבר אשר שימש בהצלחה במרכז שלנו. הפתרון cryopreservation מכיל אתילן גליקול במקום DMSO למזער את רעילות עוברים 5. הוא מכיל גם Ficoll ו סוכרוז למניעת devitrification והתאמה האוסמוטי, בהתאמה. עוברים ניתן לטפל בטמפרטורת החדר והועברו לתוך חנקן נוזלי תוך 5 דקות. בגלל השיטה המקורית היתה אופטימיזציה עבור קשיות כמו מכולות, יש לנו את הפרוטוקול שונה מעט עבור cryotubes, אשר נגיש יותר בקלות במעבדות עמידים יותר בפני נזקים פיזיים. כמו כן, אנו מתארים את הליך הפשרת עוברים מזוגגת בפירוט כי זה קריטי STEp עבור התאוששות יעיל של עכברים חיים. מתודולוגיות אלה יהיה מועיל חוקרים וטכנאים הזקוקים לשימור זנים העכבר לשימוש מאוחר יותר בצורה בטוחה וחסכונית.

Watch this Scientific Journal Video about Cryopreservation of Mouse Embryos by Ethylene Glycol-Based Vitrification at JoVE.com

Cryopreservation of Mouse Embryos by Ethylene Glycol-Based Vitrification

אתילן גליקול מבוססי שיטה vitrification עבור עוברי עכבר מתואר. זהו יתרון לשיטות אחרות בפשטותו ורעילות נמוכה עובריים, ולכן יכול להיות ישים באופן נרחב זנים רבים של עכברים, כולל עכברים טבועה ו גנים שונה.

Cryopreservation של עוברי עכברים ידי Vitrification אתילן גליקול מבוסס

Cryopreservation of mouse embryos is a technological basis that supports biomedical sciences, because many strains of mice have been produced by genetic ...

cryopreservation-mouse-embryos-ethylene-glycol-based

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

31.0K Views.  RIKEN BioResource Center. אתילן גליקול מבוססי שיטה vitrification עבור עוברי עכבר מתואר. זהו יתרון לשיטות אחרות בפשטותו ורעילות נמוכה עובריים, ולכן יכול להיות ישים באופן נרחב זנים רבים של עכברים, כולל עכברים טבועה ו גנים שונה.

Video: Cryopreservation of Mouse Embryos by Ethylene Glycol-Based Vitrification

Dissection of 6.5 dpc Mouse Embryos

Analysis of gene expression patterns during early stages of mammalian embryonic development can provide important clues about gene function, cell-cell interaction and signaling mechanisms that guide embryonic patterning. However, dissection of the mouse embryo from the decidua shortly after implantation can be a challenging procedure, and detailed step-by-step documentation of this process is lacking.

Here we demonstrate how post-implantation (6.5 dpc) embryos are isolated by first dissecting the uterus of a pregnant mouse (detection of the vaginal plug was designated day 0.5 poist coitum) and subsequently dissecting the embryo from maternal decidua. The dissection of Reichert's membrane is described as well as the removal of the ectoplacental cone.

Isolation of postimplantation-stage embryos allows one to study gene patterning and analyze cell-lineage decision making processes during embryonic development, but proper dissection of the early embryo can be challenging. This protocol describes a method for isolating early primitive-streak-stage embryos (~6.5 days post coitum [dpc]).

Dissection של 6.5 עוברים DPC עכבר

Analysis of gene expression patterns during early stages of mammalian embryonic development can provide important clues about gene function, cell-cell ...

In Utero Intraventricular Injection and Electroporation of E15 Mouse Embryos

In-utero in-vivo injection and electroporation of the embryonic mouse neocortex provides a powerful tool for the manipulation of individual progenitors lining the walls of the lateral ventricle. This technique is now widely used to study the processes involved in corticogenesis by over-expressing or knocking down genes and observing the effects on cellular proliferation, migration, and differentiation. In comparison to traditional knockout strategies, in-utero electroporation provides a rapid means to manipulate a population of cells during a specific temporal window. In this video protocol we outline the experimental methodology for preparing mice for surgery, exposing the uterine horns through laporatomy, injecting DNA into the lateral ventricles of the developing embryo, electroporating DNA into the progenitors lining the lateral wall, and caring for animals post-surgery. Our laboratory uses this protocol for surgeries on E13-E16 mice, however, it is most commonly performed at E15, as shown in this video. 

בשנת הזרקה תוך חדרי ברחם ו electroporation E15 של עוברי עכברים

In-utero in-vivo injection and electroporation of the embryonic mouse neocortex provides a powerful tool for the manipulation of individual progenitors ...

Collection and Cryopreservation of Hamster Oocytes and Mouse Embryos

Embryos and oocytes were first successfully cryopreserved more than 30 years ago, when Whittingham et al. 1 and Wilmut 2 separately described that mouse embryos could be frozen and stored at -196 &deg;C and, a few years later, Parkening et al. 3 reported the birth of live offspring resulting from in vitro fertilization (IVF) of cryopreserved oocytes. Since then, the use of cryopreservation techniques has rapidly spread to become an essential component in the practice of human and animal assisted reproduction and in the conservation of animal genetic resources. Currently, there are two main methods used to cryopreserve oocytes and embryos: slow freezing and vitrification. A wide variety of approaches have been used to try to improve both techniques and millions of animals and thousands of children have been born from cryopreserved embryos. However, important shortcomings associated to cryopreservation still have to be overcome, since ice-crystal formation, solution effects and osmotic shock seem to cause several cryoinjuries in post-thawed oocytes and embryos. Slow freezing with programmable freezers has the advantage of using low concentrations of cryoprotectants, which are usually associated with chemical toxicity and osmotic shock, but their ability to avoid ice-crystal formation at low concentrations is limited. Slow freezing also induces supercooling effects that must be avoided using manual or automatic seeding 4. In the vitrification process, high concentrations of cryoprotectants inhibit the formation of ice-crystals and lead to the formation of a glasslike vitrified state in which water is solidified, but not expanded. However, due to the toxicity of cyroprotectants at the concentrations used, oocytes/embryos can only be exposed to the cryoprotectant solution for a very short period of time and in a minimum volume solution, before submerging the samples directly in liquid nitrogen 5. In the last decade, vitrification has become more popular because it is a very quick method in which no expensive equipment (programmable freezer) is required. However, slow freezing continues to be the most widely used method for oocyte/embryo cryopreservation. In this video-article we show, step-by-step, how to collect and slowly freeze hamster oocytes with high post-thaw survival rates. The same procedure can also be applied to successfully freeze and thaw mouse embryos at different stages of preimplantation development.

In this video-article we present a step-by-step demonstration on how to collect and cryopreserve hamster oocytes with high post-thaw survival rates. The same procedure can also be applied to successfully freeze and thaw mouse embryos at different stages of preimplantation development.

איסוף cryopreservation של ביציות ועוברים אוגר עכבר

Embryos and oocytes were first successfully cryopreserved more than 30 years ago, when Whittingham et al. 1 and Wilmut 2 separately described that mouse ...

Generating Chimeric Zebrafish Embryos by Transplantation

One of the most powerful tools used to gain insight into complex developmental processes is the analysis of chimeric embryos. A chimera is defined as an organism that contains cells from more than one animal; mosaics are one type of chimera in which cells from more than one genotype are mixed, usually wild-type and mutant. In the zebrafish, chimeras can be readily made by transplantation of cells from a donor embryo into a host embryo at the appropriate embryonic stage. Labeled donor cells are generated by injection of a lineage marker, such as a fluorescent dye, into the one-cell stage embryo. Labeled donor cells are removed from donor embryos and introduced into unlabeled host embryos using an oil-controlled glass pipette mounted on either a compound or dissecting microscope. Donor cells can in some cases be targeted to a specific region or tissue of the developing blastula or gastrula stage host embryo by choosing a transplantation site in the host embryo based on well-established fate maps.

A step-by-step guide to generating targeted chimeric zebrafish embryos by transplantation at the blastula or gastrula stage.

יצירת עוברים דג הזברה chimeric על ידי השתלה

One of the most powerful tools used to gain insight into complex developmental processes is the analysis of chimeric embryos. A chimera is defined as an ...

In vivo Imaging and Therapeutic Treatments in an Orthotopic Mouse Model of Ovarian Cancer

Human cancer and response to therapy is better represented in orthotopic animal models. This paper describes the development of an orthotopic mouse model of ovarian cancer, treatment of cancer via oral delivery of drugs, and monitoring of tumor cell behavior in response to drug treatment in real time using in vivo imaging system. In this orthotopic model, ovarian tumor cells expressing luciferase are applied topically by injecting them directly into the mouse bursa where each ovary is enclosed. Upon injection of D-luciferin, a substrate of firefly luciferase, luciferase-expressing cells generate bioluminescence signals. This signal is detected by the in vivo imaging system and allows for a non-invasive means of monitoring tumor growth, distribution, and regression in individual animals. Drug administration via oral gavage allows for a maximum dosing volume of 10 mL/kg body weight to be delivered directly to the stomach and closely resembles delivery of drugs in clinical treatments. Therefore, techniques described here, development of an orthotopic mouse model of ovarian cancer, oral delivery of drugs, and in vivo imaging, are useful for better understanding of human ovarian cancer and treatment and will improve targeting this disease.

In vivo Imaging and Therapeutic Treatments in an Orthotopic Mouse Model of Ovarian Cancer

Orthotopic animal models of ovarian cancer replicate better human disease and therefore enhance our understanding of cancer progression and tumor response to therapy. A mouse model receives an intrabursal injection of luciferase-expressing ovarian tumor cells. Treatment is administered via oral gavage. Tumor growth is monitored by in vivo imaging system.

בשנת vivo ההדמיה לטיפולים במודל עכבר orthotopic של סרטן השחלות

Human cancer and response to therapy is better represented in orthotopic animal models.  This paper describes the development of an orthotopic mouse model ...

RNAi Interference by dsRNA Injection into Drosophila Embryos

Genetic screening is one of the most powerful methods available for gaining insights into complex biological process 1. Over the years many improvements and tools for genetic manipulation have become available in Drosophila 2. Soon after the initial discovery by Frie and Mello 3 that double stranded RNA can be used to knockdown the activity of individual genes in Caenorhabditis elegans, RNA interference (RNAi) was shown to provide a powerful reverse genetic approach to analyze gene functions in Drosophila organ development 4, 5.
Many organs, including lung, kidney, liver, and vascular system, are composed of branched tubular networks that transport vital fluids or gases 6, 7. The analysis of Drosophila tracheal formation provides an excellent model system to study the morphogenesis of other tubular organs 8. The Berkeley Drosophila genome project has revealed hundreds of genes that are expressed in the tracheal system. To study the molecular and cellular mechanism of tube formation, the challenge is to understand the roles of these genes in tracheal development. Here, we described a detailed method of dsRNA injection into Drosophila embryo to knockdown individual gene expression. We successfully knocked down endogenous dysfusion(dys) gene expression by dsRNA injection. Dys is a bHLH-PAS protein expressed in tracheal fusion cells, and it is required for tracheal branch fusion 9, 10. dys-RNAi completely eliminated dys expression and resulted in tracheal fusion defect. This relatively simple method provides a tool to identify genes requried for tissure and organ development in Drosophila.

RNAi Interference by dsRNA Injection into Drosophila Embryos

RNA interference has been proven very effective to analyze gene function in Drosophila tracheal development. A detailed protocol used by Jiang lab to inject dsRNA into fly embryos to knockdown gene expression is illustrated. This technique has the potential for screening genes required for tissue and organ development in Drosophila.

RNAi הפרעה על ידי הזרקה לתוך dsRNA תסיסנית עוברים

Genetic screening is one of the most powerful methods available for gaining insights into complex biological process 1. Over the years many improvements ...

Cryopreservation of Preimplantation Embryos of Cattle, Sheep, and Goats

Preimplantation embryos from cattle, sheep, and goats may be cryopreserved for short- or long-term storage. Preimplantation embryos consist predominantly of water, and the avoidance of intracellular ice crystal formation during the cryopreservation process is of paramount importance to maintain embryo viability. Embryos are placed into a hypertonic solution (1.4 &#x2013; 1.5 M) of a cryoprotective agent (CPA) such as ethylene glycol (EG) or glycerol (GLYC) to create an osmotic gradient that facilitates cellular dehydration. After embryos reach osmotic equilibrium in the CPA solution, they are individually loaded in the hypertonic CPA solution into 0.25 ml plastic straws for freezing. Embryos are placed into a controlled rate freezer at a temperature of -6&deg;C. Ice crystal formation is induced in the CPA solution surrounding the embryo, and crystallization causes an increase in the concentration of CPA outside of the embryo, causing further cellular dehydration. Embryos are cooled at a rate of 0.5&deg;C/min, enabling further dehydration, to a temperature of -34&deg;C before being plunged into liquid nitrogen (-196&deg;C). Cryopreserved embryos must be thawed prior to transfer to a recipient (surrogate) female. Straws containing the embryos are removed from the liquid nitrogen dewar, held in room temperature air for 3 to 5 sec, and placed into a 37&deg;C water bath for 25 to 30 sec. Embryos cryopreserved in GLYC are placed into a 1 M solution of sucrose for 10 min for removal of the CPA before transfer to a recipient (surrogate) female. Embryos cryopreserved in EG, however, may be directly transferred to the uterus of a recipient.

Preimplantation embryos may be cryopreserved after placement into a hypertonic cryoprotective solution to cause cellular dehydration. After equilibration, ice crystal formation is induced in the solution surrounding the embryo. Further dehydration occurs as the embryo is slowly cooled to subzero temperatures before plunging into liquid nitrogen for storage.

Cryopreservation של עוברים Preimplantation של בקר, כבשים ועזים

Preimplantation embryos from cattle, sheep, and goats may be cryopreserved for short- or long-term storage.  Preimplantation embryos consist predominantly ...

Whole Mount in Situ Hybridization of E8.5 to E11.5 Mouse Embryos

Whole mount in situ hybridization is a very informative approach for defining gene expression patterns in embryos. The in situ hybridization procedures are lengthy and technically demanding with multiple important steps that collectively contribute to the quality of the final result. This protocol describes in detail several key quality control steps for optimizing probe labeling and performance. Overall, our protocol provides a detailed description of the critical steps necessary to reproducibly obtain high quality results. First, we describe the generation of digoxygenin (DIG) labeled RNA probes via in vitro transcription of DNA templates generated by PCR. We describe three critical quality control assays to determine the amount, integrity and specific activity of the DIG-labeled probes. These steps are important for generating a probe of sufficient sensitivity to detect endogenous mRNAs in a whole mouse embryo. In addition, we describe methods for the fixation and storage of E8.5-E11.5 day old mouse embryos for in situ hybridization. Then, we describe detailed methods for limited proteinase K digestion of the rehydrated embryos followed by the details of the hybridization conditions, post-hybridization washes and RNase treatment to remove non-specific probe hybridization. An AP-conjugated antibody is used to visualize the labeled probe and reveal the expression pattern of the endogenous transcript. Representative results are shown from successful experiments and typical suboptimal experiments.

Whole Mount in Situ Hybridization of E8.5 to E11.5 Mouse Embryos

This whole mount in situ hybridization protocol discusses critical steps that ensure reproducible high quality results for gene expression studies in E8.5-E11.5 day old mouse embryos.

הר שלם<em&gt; באתר</em&gt; הכלאה של E8.5 לעוברי E11.5 עכבר

Whole mount in situ hybridization is a very informative approach for defining gene expression patterns in embryos. The in situ hybridization procedures ...

Mouse Sperm Cryopreservation and Recovery using the I&middot;Cryo Kit

Thousands of new genetically modified (GM) strains of mice have been created since the advent of transgenesis and knockout technologies. Many of these valuable animals exist only as live animals, with no backup plan in case of emergency. Cryopreservation of embryos can provide this backup, but is costly, can be a lengthy procedure, and generally requires a large number of animals for success. Since the discovery that mouse sperm can be successfully cryopreserved with a basic cryoprotective agent (CPA) consisting of 18&#37; raffinose and 3&#37; skim milk, sperm cryopreservation has become an acceptable and cost-effective procedure for archiving, distributing and recovery of these valuable strains.
 Here we demonstrate a newly developed I&bull;Cryo kit for mouse sperm cryopreservation. Sperm from five commonly-used strains of inbred mice were frozen using this kit and then recovered. Higher protection ratios of sperm motility (&gt; 60&#37;) and rapid progressive motility (&gt; 45&#37;) compared to the control (basic CPA) were seen for sperm frozen with this kit in 5 inbred mouse strains. Two cell stage embryo development after IVF with the recovered sperm was improved consistently in all 5 mouse strains examined. Over a 1.5 year period, 49 GM mouse lines were archived by sperm cryopreservation with the I&bull;Cryo kit and later recovered by IVF.

Here we demonstrate the newly developed I&#x2022;Cryo kit for mouse sperm cryopreservation. Two-cell stage embryo development with frozen-thawed sperm was improved consistently in 5 mouse strains with the use of this kit. Over a 1.5 year period, 49 genetically modified mouse lines were archived by sperm cryopreservation with the I&#x2022;Cryo kit and later successfully recovered by IVF.

הזרע עכבר cryopreservation ושחזור באמצעות · אני cryo Kit

Thousands of new genetically modified (GM) strains of mice have been created since the advent of transgenesis and knockout technologies.  Many of these ...

Gene Transfer into Older Chicken Embryos by ex ovo Electroporation

The chicken embryo provides an excellent model system for studying gene function and regulation during embryonic development. In ovo electroporation is a powerful method to over-express exogenous genes or down-regulate endogenous genes in vivo in chicken embryos1. Different structures such as DNA plasmids encoding genes2-4, small interfering RNA (siRNA) plasmids5, small synthetic RNA oligos6, and morpholino antisense oligonucleotides7 can be easily transfected into chicken embryos by electroporation. However, the application of in ovo electroporation is limited to embryos at early incubation stages (younger than stage HH20 - according to Hamburg and Hamilton)8 and there are some disadvantages for its application in embryos at later stages (older than stage HH22 - approximately 3.5 days of development). For example, the vitelline membrane at later stages is usually stuck to the shall membrane and opening a window in the shell causes rupture of the vessels, resulting in death of the embryos; older embryos are covered by vitelline and allantoic vessels, where it is difficult to access and manipulate the embryos; older embryos move vigorously and is difficult to control the orientation through a relatively small window in the shell.
In this protocol we demonstrate an ex ovo electroporation method for gene transfer into chicken embryos at late stages (older than stage HH22). For ex ovo electroporation, embryos are cultured in Petri dishes9 and the vitelline and allantoic vessels are widely spread. Under these conditions, the older chicken embryos are easily accessed and manipulated. Therefore, this method overcomes the disadvantages of in ovo electroporation applied to the older chicken embryos. Using this method, plasmids can be easily transfected into different parts of the older chicken embryos10-12.

Gene Transfer into Older Chicken Embryos by ex ovo Electroporation

A method of gene transfer into chicken embryos at later incubation stages (older than Hamburger and Hamilton stage (HH) 22) is described. This method overcomes disadvantages of in ovo electroporation applied to older chicken embryos and is a useful technique to study gene function and regulation at older developmental stages.

ין העברת לעוברי עוף מבוגרים יותר על ידי<em&gt; לג&#39;ימי לשעבר</em&gt; Electroporation

The chicken embryo provides an  excellent model system for studying gene function and regulation during  embryonic development. In ovo electroporation is ...