טרנסדוקציה של פאג': שיטה להעברת עמידות לאמפיצ'ילין מתורם לנמען E. coli

Overview

מקור: אלכסנדר ס. גולד¹, טוניה מ. קולפיטס¹
¹ המחלקה למיקרוביולוגיה, בית הספר לרפואה של אוניברסיטת בוסטון, המעבדות הלאומיות למחלות זיהומים מתעוררות, בוסטון, תואר שני

טרנסדוקציה היא צורה של החלפה גנטית בין חיידקים המשתמשים בבקטריופאג'ים, או פאג'ים, סוג של וירוס שמדביק אורגניזמים פרוקריוטים בלבד. צורה זו של העברת דנ"א, מחיידק אחד למשנהו באמצעות פאג', התגלתה בשנת 1951 על ידי נורטון זינדר ויהושע לדארג, שכינו את התהליך "טרנסדוקציה" (1). בקטריופאג'ים התגלו לראשונה בשנת 1915 על ידי הבקטריולוג הבריטי פרדריק טוורט, ואז התגלו שוב באופן עצמאי בשנת 1917 על ידי המיקרוביולוג הצרפתי-קנדי פליקס ד'הרל (2). מאז, המבנה והתפקוד של פאג'ים אלה התאפיינו באופן נרחב (3), וחלוקת פאג'ים אלה לשתי כיתות. הראשון מבין שיעורים אלה הם פאג'ים ליטיים אשר עם זיהום להתרבות בתוך החיידק המארח, לשבש את חילוף החומרים החיידקי, lysing התא, ושחרור פאג צאצאים (4). כתוצאה מפעילות אנטי-בקטריאלית זו והשכיחות הגוברת של חיידקים עמידים לאנטיביוטיקה, פאגים ליטיקיים אלה הוכיחו לאחרונה שימושי כטיפול חלופי לאנטיביוטיקה. השני של שיעורים אלה הם פאג'ים ליזוזניים שיכולים להתרבות בתוך הפונדקאי דרך מחזור הטיק או להיכנס למצב של קיפיון שבו הגנום שלהם משולב בזה של הפונדקאי (איור 1), תהליך המכונה ליסוגניה, עם היכולת לייצר פאג' להיות מושרה בעוד דורות רבים מאוחרים יותר (4).

איור 1: זיהום של תא מארח על ידי בקטריופאג'. ספיחה על ידי הפאג ' לקיר התא החיידקי באמצעות אינטראקציות בין סיבי הזנב לקולטן (סגול). ברגע על פני התא, הפאג' מחובר באופן בלתי הפיך לתא החיידקי באמצעות לוח הבסיס (שחור) המועבר לקיר התא על ידי נדן הציר (צהוב). גנום פאג' (אדום) נכנס לתא ומשתלב בגנום התא המארח.

בעוד טרנסדוקציה חיידקית היא תהליך טבעי, באמצעות טכנולוגיה מודרנית זה כבר מניפולציה להעברת גנים לחיידקים בסביבת המעבדה. על ידי החדרת גנים מעניינים לגנום של פאג' ליזוזני, כגון פאג ', ניתן להעביר גנים אלה לגנומים של חיידקים וכתוצאה מכך לבטא אותם בתוך תאים אלה. בעוד ששיטות אחרות להעברת גנים, כגון טרנספורמציה, משתמשות בפלסטיד להעברת גנים וביטוי, החדרת הגנום הפאג' לזה של חיידק הנמען לא רק שיש לה פוטנציאל להעניק תכונות חדשות לחיידק זה, אלא גם מאפשרת מוטציות טבעיות וגורמים אחרים של הסביבה התאית לשנות את תפקוד הגן המועבר.

בהשוואה לשיטות אחרות של העברת גנים אופקית, כגון הטיות, התמלה גמישה למדי בקריטריונים הנדרשים לתאי תורמים ונמענים. כל אלמנט גנטי שיכול להתאים בתוך הגנום של הפאג ' בשימוש יכול להיות מועבר מכל זן של חיידקים תורמים לכל זן של חיידקים נמענים כל עוד שניהם מתירניים הפאג ', הדורש ביטוי של קולטני פאג 'הדרושים על משטחי התא. ברגע שהגן הזה מועבר מהגנום התורם ונארז לתוך הפאג', ניתן להעביר אותו לנמען. לאחר התמסורת, יש צורך לבחור עבור חיידקים נמענים המכילים את הגן של עניין יש לבחור עבור. זה יכול להיעשות על ידי שימוש בסמן גנטי, כגון FLAG-tag או תג פוליהיסטידין, כדי לסמן את הגן של עניין, או את הפונקציה המהותית של הגן, במקרה של גנים המקודדים עמידות לאנטיביוטיקה. בנוסף, ניתן להשתמש ב- PCR כדי לאשר עוד יותר את התמרה מוצלחת. על ידי שימוש בפריימרים לאזור בתוך גן העניין והשוואת האות לשליטה חיובית, חיידקים בעלי גן עניין ושליטה שלילית, חיידקים עברו את אותם צעדים כמו תגובת התמרה ללא פאג '. בעוד טרנסדוקציה חיידקית היא כלי שימושי בביולוגיה מולקולרית, יש לה וממשיכה למלא תפקיד חשוב בהתפתחות החיידקים, במיוחד לגבי העלייה האחרונה של עמידות לאנטיביוטיקה.

בניסוי זה, טרנסדוקציה חיידקית שימשה להעברת קידוד הגן לעמידות באמפיצלין אנטיביוטי מזן W3110 של E.coli לזן J53 באמצעות בקטריופאג ' P1 (5). ניסוי זה כלל שני שלבים עיקריים. ראשית, הכנת P1 פאג ' המכיל את הגן עמידות אמפיצלין מן זן התורם. שנית, העברת הגן הזה לזן הנמען על ידי טרנסדוקציה עם P1 phage (איור 1). לאחר ביצועו, ההעברה המוצלחת של הגן עמידות אמפיצלין יכולה להיקבע על ידי qPCR (איור 2). אם התמרה הייתה מצליחה, זן J53 של E. coli יהיה עמיד בפני אמפיצ'ילין, והגן המעניק התנגדות זו ניתן לזיהוי על ידי qPCR. אם לא יצליח, לא יהיה זיהוי של הגן עמידות אמפצילין ואמפצילין עדיין יתפקד כאנטיביוטיקה יעילה נגד זן J53.

איור 2: אישור התמרה מוצלחת על ידי qPCR. על ידי השוואת ערכי C_q שזוהו עבור גן העניין מתגובת התמרה ותגובת השליטה השלילית, ונורמול ערכים אלה מול גן משק בית, ניתן היה לאשר כי טרנסדוקציה חיידקית הצליחה.

Procedure

1. הגדרת

לפני תחילת כל עבודה המערבת חיידקים, לעקר את סביבת העבודה באמצעות 70% אתנול. השתמש תמיד PPE הדרוש (חלוק מעבדה וכפפות).
ודא כי לוחות אגר LB עם אמפיצילין 1x, פתרון P1 phage ליסאט זמין מסחרית, כלורופורם, 1 M נתרן סיטראט, גליצלול, וקופסה של טיפים פיפטה פלסטיק מעוקר מראש ומפזרי תאים נמצאים בהישג יד.
הכן LB סטרילי על ידי autoclaving ולהשתמש בו כדי להפוך שלושה 1 mL aliquots של פתרון מלח LB.
1. mM MgCl₂ (952.11-2.3803 מיקרוגרם), 5 מ"מ CaCl₂ (11.098 מ"ג), 0.1-0.2% גלוקוז (100-200 מיקרוגרם)
2. מ"מ MgSO₄ (12.0366 מ"ג), 5 מ"מ CaCl₂ (11.098 מ"ג)
3. mM נתרן סיטראט (25.806 מ"ג)
לאחר סיום, לחטא את כל המשטחים, כמו גם כפפות עם 70% אתנול לשטוף ידיים.

2. פרוטוקול

תורם פאג' ליסאט הכנה
1. הכן תרבות 1 מ"ל של תורם W3110 זן E. coli ב LB עם אמפיצלין 1x גדל לילה ב 37 °C (77 °F) עם aeration ורעד ב 220 סל"ד.
2. לדלל את זה תרבות לילה 1:100 ב 1 מ"ל של LB טרי בתוספת 10-25 mM MgCl₂, 5 mM CaCl₂, ו 0.1-0.2% גלוקוז.
3. לגדל את זה דילול חיידקי ב 37 °C (50 °F) במשך 2 שעות עם aeration ורעד ב 220 סל"ד.
4. לאחר תאים אלה הגיעו לשלב הצמיחה הלוגריתמית המוקדמת (צמיחה ניכרת וערבולות קלות), להוסיף 40 μL של P1 phage זמין מסחרית ולהשאיר ב 37 °C עם aeration ורעד ב 220 סל"ד.
  1. לפני תוספת פאג', הצפיפות האופטית הנמדדת ב-600 ננומטר של תאים אלה צריכה להיות בערך 0.4 (6).
5. נטר את התאים במשך 1-3 שעות עד שתרבית התסיסה.
  1. תמיס תגרום לפסולת תאית מוגברת, כמו גם לירידה ניכרת בעכורה (כלומר תאים ייחשבו lysed ברגע אחד הוא מסוגל לראות דרך התרבות).
6. הוסף מספר טיפות (50-100 μL) של כלורופורם ליסאט ומערבבים על ידי מערבולת.
  1. כלורופורם מעקר את הפאג' ליסאט על ידי הריגת כל התאים התורמים הנותרים, משאיר רק פאג' ומגדיל את הצמיג של ליסאט זה.
7. צנטריפוגה lysate ב 14,000 סל"ד במשך 2 דקות כדי להסיר פסולת ולהעביר supernatant לצינור טרי.
8. מוסיפים כמה טיפות של כלורופורם ומאחסנים ב 4 °C (70 °F) לא יותר מיום אחד.
טרנסדוקציה
1. הכן תרבות 1 מ"ל של נמען זן J53 E. coli גדל לילה ב LB ב 37 °C עם aeration ורעד ב 220 סל"ד.
2. העבר 100 μL של תורם פאג ליסאט (2.1) לתוך צינור מיקרופוגה 1.5 מ"ל ודגרה עם כובע פתוח ב 37 °C (30 °F) במשך 30 דקות.
  1. דגירה זו מאפשרת לכל כלורופורם שנותר בתמיסת ה- P1 lysate להתאדות לפני הוספתו לתאי הנמען.
3. מסנן כדורים בעדינות מתאי צנטריפוגה ב-6,000 סל"ד למשך 5 דקות.
4. Resuspend תאים אלה ב 300 μL של LB טרי המכיל 100 mM MgSO₄ ו 5 mM CaCl₂. (P1 phage דורש סידן להיות זיהומיות).
5. הגדר שתי תגובות באמצעות תאי חיידקי הנמען והכנת פאג ' ליסאט תורם: 1) תגובת טרנסדוקציה המשלבת 100 נמען μL J53 זן E. coli ו 100 μL תורם פאג 'ליסאט, ו 2) שליטה שלילית המשלבת 100 נמען μL J53 זן E. coli ו 100 μL של LB המכיל 100 mM MgSO₄ ו 5 mM CaCl₂.
6. דגירה ב 37 °C (30 °F) במשך 30 דקות עם רועד ב 220 סל"ד.
7. הוסף 1 מ"ל LB ו 200 μL 1M נתרן סיטראט (pH = 5.5) ודגרה במשך שעה אחת ב 37 °C (57 °F) עם רועד ב 220 סל"ד.
  1. סיטראט משמש כדי להפחית את ההדבקה של P1 על ידי כלאט עם סידן, מניעת תמוגה של חיידקים המטופל.
  2. דגירה של פתרון זה מאפשרת את הביטוי של סמן התנגדות אמפיצלין.
8. כדורי תאים על ידי צנטריפוגה ב 6,000 סל"ד במשך 5 דקות.
9. כדורי תא resuspend ב 100 μL של LB עם 100 mM נתרן ציטוט (pH 5.5). מערבולת וצלחת פתרון שלם עבור שתי התגובות על שתי צלחות אגר LB.
  1. צלחת LB צריך להיות 1x Amp עבור מדגם transduced ולא מגבר עבור השליטה השלילית.
  2. P1 זיהום פאג ' על צלחת זו דורש פסים מחדש לפני מלאי המקפיא ניתן להכין.
  3. אם פאג' לא יוסר, תרבויות הגדלות ממושבות אלה לא יגדלו אלא אם כן בנוכחות כלטור סידן.
10. בחר כ 3-4 מושבות משתי הצלחות ופס שוב על שתי צלחות אגר LB להתפשט עם 100 μL של 1 M נתרן סיטראט (pH = 5.5).
  1. צלחת LB צריך להיות 1x Amp עבור מדגם transduced ולא מגבר עבור השליטה השלילית.
11. לדגור על הצלחות ב 37 °C (55 °F) לילה כדי לאפשר מושבות ללא פאג לגדול.
12. בחר מושבות משתי הצלחות והשתמש בהן כדי לגדל תרביות לילה ב 5 מ"ל של LB ב 37 °C עם aeration ורעד ב 220 סל"ד.
13. לבודד DNA מתרביות אלה על ידי DNA miniprep באמצעות 4.5 מ"ל של נפח התרבות הכולל.
  1. יש לפנות דנ"א באמצעות 35 מיקרו-אל של מים נטולי נוקלאז.
  2. למדוד את הריכוז המתקבל על ידי Nanodrop. DNA טהור ייצור יחס ספיגה (A_260/280) של כ 1.8.
14. השתמש 0.5 מ"ל הנותרים של כל תרבית כדי להכין 1 מ"ל מניות גליצרול על ידי ביצוע תערובת 1:1 של 100% גליצרול ותרבות חיידקים.
15. לאחסן מלאי גליסול חיידקי ב -80 °C (50 °F).

3. ניתוח נתונים ותוצאות

אישור התמרת על-ידי qPCR
1. הכן שני תערובות מאסטר qPCR עבור שש תגובות qPCR, שלושה באמצעות פריימרים qPCR עבור הגן התנגדות אמפיצלין, ושלושת האחרים באמצעות פריימרים qPCR עבור גן משק בית (14.5 μL לתגובה): 12.5 μL qPCR חיץ לערבב + 1 μL פריימר קדימה + 1 μL פריימר הפוך.
  1. בניסוי זה, השתמשנו בתערובת מאסטר ירוק SYBR.
  2. פריימרים של גנים של משק בית תוכננו להגביר מקטע דנ"א בתוך קידוד הגן החיידקי עבור gyrase DNA B (7).
2. עבור כל תגובת qPCR, שלב 100 מיקרוגרם של DNA מכל תגובה (10.5 μL) עם 14.5 μL של תערובת מאסטר qPCR.
3. באמצעות מכונת qPCR ופרוטוקול התרמו-אופניים המפורט בטבלה 1, נמדדה הגברה עבור עמידות האמפיצלין וגנים משק בית עבור כל שש התגובות.
4. ערכי Cq שנוצרו על ידי qPCR שימשו לחישוב יעילות התמסורת מנורמלת של הגן עמידות אמפיצלין (איור 3), המאשר את התמרה המוצלחת של הגן עמידות אמפיצלין.
  1. ערך Cq, או ערך כימות המחזור, של מדגם הוא מספר מחזור ה- PCR המוקדם ביותר שבו מזוהה אות חריגה מסף הרקע. ערכי Cq נמוכים תואמים לרצף יעדים נוסף, להיפך.
  2. יעילות טרנסדוקציה מנורמלת של גן בתוך מדגם ניתן לחשב באמצעות ערכי Cq אלה על ידי חיסור הערך של הגן משק הבית מזה של גן היעד, יצירת ערך ΔCq, אשר ניתן להשתמש בו כדי לחשב יעילות transduction מנורמל על ידי 2^(-ΔCq).

	טמפרטורה	זמן
דנטורציה	94 °C (77 °F)	2 דקות
40 מחזורים:
דנטורציה	94 °C (77 °F)	15 שניות
קריאה על חישול, הארכה ופלואורסצנטיות	60 °C (5 °F) או 5 °C (5 °F) מתחת לראש הממשלה הנמוך ביותר T_m	1 דק'

טבלה 1: פרוטוקול תרמורכיבה על אופניים qPCR

Application and Summary

העברת הגנים לחיידקים וממנה על ידי בקטריופאג', בעוד תהליך טבעי, הוכיחה את עצמה כיעילה ביותר להמון מטרות מחקריות. בעוד ששיטות אחרות להעברת גנים כגון טרנספורמציה והטיה אפשריות, התמרה משתמשת באופן ייחודי בבקטריופאג'ים; לא רק המאפשר שילוב גנים בגנום המארח, אלא גם להעברת גנים לחיידקים מרובים שאינם רגישים לשיטות אחרות. תהליך זה, בעוד שימושי במיוחד במעבדה, שימש גם בתחום המתפתח לאחרונה של ריפוי גנטי, ליתר דיוק בטיפול גנטי אלטרנטיבי, אסטרטגיה טיפולית המשתמשת בחיידקים כדי לספק טיפולים לרקמות היעד, שרבות מהן אינן רגישות לשיטות משלוח אחרות ויש להן רלוונטיות קלינית רבה (8,9).

References

Lederberg J, Lederberg E.M., Zinder, N.D., et al. Recombination analysis of bacterial heredity. Cold Spring Harbor symposia Quantitative Biol. 1951;16:413-43.
Duckworth DH. "Who Discovered Bacteriophage?". Bacteriology Reviews. 1976;40:793-802.
Yap ML, Rossman, M.G. Structure and Function of Bacteriophage T4. Future Microbiol. 2014;9:1319-27.
Sulakvelidze A, Alavidze, Z., Morris, J. G. Bacteriophage Therapy Antimicrobial Agents and Chemotherapy 2001;45(3):649-59.
Moore S. Sauer:P1vir phage transduction 2010 [Available from: https://openwetware.org/wiki/Sauer:P1vir_phage_transduction].
Kobayashi A, et al. Growth Phase-Dependent Expression of Drug Exporters in
Escherichia coli and Its Contribution to Drug Tolerance. Journal of Bacteriology. 2006;188(16):5693-703.
Rocha D, Santos, CS, Pacheco LG. Bacterial reference genes for gene expression studies by RT-qPCR: survey and analysis. Antonie Van Leeuwenhoek. 2015;108:685-93.
Pálffy R. et al. Bacteria in gene therapy: bactofection versus alternative gene therapy. Gene Ther. 2006 13:101-5.
O'Neill JM, et al. Intestinal delivery of non-viral gene therapeutics: physiological barriers and preclinical models. Drug Discovery Today. 2011;16:203-2018.

Tags

1. הגדרת

לפני תחילת כל עבודה המערבת חיידקים, לעקר את סביבת העבודה באמצעות 70% אתנול. השתמש תמיד PPE הדרוש (חלוק מעבדה וכפפות).
ודא כי לוחות אגר LB עם אמפיצילין 1x, פתרון P1 phage ליסאט זמין מסחרית, כלורופורם, 1 M נתרן סיטראט, גליצלול, וקופסה של טיפים פיפטה פלסטיק מעוקר מראש ומפזרי תאים נמצאים בהישג יד.
הכן LB סטרילי על ידי autoclaving ולהשתמש בו כדי להפוך שלושה 1 mL aliquots של פתרון מלח LB.
1. mM MgCl₂ (952.11-2.3803 מיקרוגרם), 5 מ"מ CaCl₂ (11.098 מ"ג), 0.1-0.2% גלוקוז (100-200 מיקרוגרם)
2. מ"מ MgSO₄ (12.0366 מ"ג), 5 מ"מ CaCl₂ (11.098 מ"ג)
3. mM נתרן סיטראט (25.806 מ"ג)
לאחר סיום, לחטא את כל המשטחים, כמו גם כפפות עם 70% אתנול לשטוף ידיים.

2. פרוטוקול

תורם פאג' ליסאט הכנה
1. הכן תרבות 1 מ"ל של תורם W3110 זן E. coli ב LB עם אמפיצלין 1x גדל לילה ב 37 °C (77 °F) עם aeration ורעד ב 220 סל"ד.
2. לדלל את זה תרבות לילה 1:100 ב 1 מ"ל של LB טרי בתוספת 10-25 mM MgCl₂, 5 mM CaCl₂, ו 0.1-0.2% גלוקוז.
3. לגדל את זה דילול חיידקי ב 37 °C (50 °F) במשך 2 שעות עם aeration ורעד ב 220 סל"ד.
4. לאחר תאים אלה הגיעו לשלב הצמיחה הלוגריתמית המוקדמת (צמיחה ניכרת וערבולות קלות), להוסיף 40 μL של P1 phage זמין מסחרית ולהשאיר ב 37 °C עם aeration ורעד ב 220 סל"ד.
  1. לפני תוספת פאג', הצפיפות האופטית הנמדדת ב-600 ננומטר של תאים אלה צריכה להיות בערך 0.4 (6).
5. נטר את התאים במשך 1-3 שעות עד שתרבית התסיסה.
  1. תמיס תגרום לפסולת תאית מוגברת, כמו גם לירידה ניכרת בעכורה (כלומר תאים ייחשבו lysed ברגע אחד הוא מסוגל לראות דרך התרבות).
6. הוסף מספר טיפות (50-100 μL) של כלורופורם ליסאט ומערבבים על ידי מערבולת.
  1. כלורופורם מעקר את הפאג' ליסאט על ידי הריגת כל התאים התורמים הנותרים, משאיר רק פאג' ומגדיל את הצמיג של ליסאט זה.
7. צנטריפוגה lysate ב 14,000 סל"ד במשך 2 דקות כדי להסיר פסולת ולהעביר supernatant לצינור טרי.
8. מוסיפים כמה טיפות של כלורופורם ומאחסנים ב 4 °C (70 °F) לא יותר מיום אחד.
טרנסדוקציה
1. הכן תרבות 1 מ"ל של נמען זן J53 E. coli גדל לילה ב LB ב 37 °C עם aeration ורעד ב 220 סל"ד.
2. העבר 100 μL של תורם פאג ליסאט (2.1) לתוך צינור מיקרופוגה 1.5 מ"ל ודגרה עם כובע פתוח ב 37 °C (30 °F) במשך 30 דקות.
  1. דגירה זו מאפשרת לכל כלורופורם שנותר בתמיסת ה- P1 lysate להתאדות לפני הוספתו לתאי הנמען.
3. מסנן כדורים בעדינות מתאי צנטריפוגה ב-6,000 סל"ד למשך 5 דקות.
4. Resuspend תאים אלה ב 300 μL של LB טרי המכיל 100 mM MgSO₄ ו 5 mM CaCl₂. (P1 phage דורש סידן להיות זיהומיות).
5. הגדר שתי תגובות באמצעות תאי חיידקי הנמען והכנת פאג ' ליסאט תורם: 1) תגובת טרנסדוקציה המשלבת 100 נמען μL J53 זן E. coli ו 100 μL תורם פאג 'ליסאט, ו 2) שליטה שלילית המשלבת 100 נמען μL J53 זן E. coli ו 100 μL של LB המכיל 100 mM MgSO₄ ו 5 mM CaCl₂.
6. דגירה ב 37 °C (30 °F) במשך 30 דקות עם רועד ב 220 סל"ד.
7. הוסף 1 מ"ל LB ו 200 μL 1M נתרן סיטראט (pH = 5.5) ודגרה במשך שעה אחת ב 37 °C (57 °F) עם רועד ב 220 סל"ד.
  1. סיטראט משמש כדי להפחית את ההדבקה של P1 על ידי כלאט עם סידן, מניעת תמוגה של חיידקים המטופל.
  2. דגירה של פתרון זה מאפשרת את הביטוי של סמן התנגדות אמפיצלין.
8. כדורי תאים על ידי צנטריפוגה ב 6,000 סל"ד במשך 5 דקות.
9. כדורי תא resuspend ב 100 μL של LB עם 100 mM נתרן ציטוט (pH 5.5). מערבולת וצלחת פתרון שלם עבור שתי התגובות על שתי צלחות אגר LB.
  1. צלחת LB צריך להיות 1x Amp עבור מדגם transduced ולא מגבר עבור השליטה השלילית.
  2. P1 זיהום פאג ' על צלחת זו דורש פסים מחדש לפני מלאי המקפיא ניתן להכין.
  3. אם פאג' לא יוסר, תרבויות הגדלות ממושבות אלה לא יגדלו אלא אם כן בנוכחות כלטור סידן.
10. בחר כ 3-4 מושבות משתי הצלחות ופס שוב על שתי צלחות אגר LB להתפשט עם 100 μL של 1 M נתרן סיטראט (pH = 5.5).
  1. צלחת LB צריך להיות 1x Amp עבור מדגם transduced ולא מגבר עבור השליטה השלילית.
11. לדגור על הצלחות ב 37 °C (55 °F) לילה כדי לאפשר מושבות ללא פאג לגדול.
12. בחר מושבות משתי הצלחות והשתמש בהן כדי לגדל תרביות לילה ב 5 מ"ל של LB ב 37 °C עם aeration ורעד ב 220 סל"ד.
13. לבודד DNA מתרביות אלה על ידי DNA miniprep באמצעות 4.5 מ"ל של נפח התרבות הכולל.
  1. יש לפנות דנ"א באמצעות 35 מיקרו-אל של מים נטולי נוקלאז.
  2. למדוד את הריכוז המתקבל על ידי Nanodrop. DNA טהור ייצור יחס ספיגה (A_260/280) של כ 1.8.
14. השתמש 0.5 מ"ל הנותרים של כל תרבית כדי להכין 1 מ"ל מניות גליצרול על ידי ביצוע תערובת 1:1 של 100% גליצרול ותרבות חיידקים.
15. לאחסן מלאי גליסול חיידקי ב -80 °C (50 °F).

3. ניתוח נתונים ותוצאות

אישור התמרת על-ידי qPCR
1. הכן שני תערובות מאסטר qPCR עבור שש תגובות qPCR, שלושה באמצעות פריימרים qPCR עבור הגן התנגדות אמפיצלין, ושלושת האחרים באמצעות פריימרים qPCR עבור גן משק בית (14.5 μL לתגובה): 12.5 μL qPCR חיץ לערבב + 1 μL פריימר קדימה + 1 μL פריימר הפוך.
  1. בניסוי זה, השתמשנו בתערובת מאסטר ירוק SYBR.
  2. פריימרים של גנים של משק בית תוכננו להגביר מקטע דנ"א בתוך קידוד הגן החיידקי עבור gyrase DNA B (7).
2. עבור כל תגובת qPCR, שלב 100 מיקרוגרם של DNA מכל תגובה (10.5 μL) עם 14.5 μL של תערובת מאסטר qPCR.
3. באמצעות מכונת qPCR ופרוטוקול התרמו-אופניים המפורט בטבלה 1, נמדדה הגברה עבור עמידות האמפיצלין וגנים משק בית עבור כל שש התגובות.
4. ערכי Cq שנוצרו על ידי qPCR שימשו לחישוב יעילות התמסורת מנורמלת של הגן עמידות אמפיצלין (איור 3), המאשר את התמרה המוצלחת של הגן עמידות אמפיצלין.
  1. ערך Cq, או ערך כימות המחזור, של מדגם הוא מספר מחזור ה- PCR המוקדם ביותר שבו מזוהה אות חריגה מסף הרקע. ערכי Cq נמוכים תואמים לרצף יעדים נוסף, להיפך.
  2. יעילות טרנסדוקציה מנורמלת של גן בתוך מדגם ניתן לחשב באמצעות ערכי Cq אלה על ידי חיסור הערך של הגן משק הבית מזה של גן היעד, יצירת ערך ΔCq, אשר ניתן להשתמש בו כדי לחשב יעילות transduction מנורמל על ידי 2^(-ΔCq).

	טמפרטורה	זמן
דנטורציה	94 °C (77 °F)	2 דקות
40 מחזורים:
דנטורציה	94 °C (77 °F)	15 שניות
קריאה על חישול, הארכה ופלואורסצנטיות	60 °C (5 °F) או 5 °C (5 °F) מתחת לראש הממשלה הנמוך ביותר T_m	1 דק'

טבלה 1: פרוטוקול תרמורכיבה על אופניים qPCR

Skip to...

0:02

Concepts

3:01

Preparation of Donor Phage Lysate

4:50

Transduction

8:39

Data Analysis by Quantitative Polymerase Chain Reaction

10:01

Results

Videos from this collection:

article

Now Playing

טרנסדוקציה של פאג': שיטה להעברת עמידות לאמפיצ'ילין מתורם לנמען E. coli

Microbiology

29.0K Views

article

יצירת טור וינוגרדסקי: שיטה להעשרת המינים המיקרוביאליים בדוגמת משקעים

Microbiology

128.7K Views

article

דילול סדרתי ו ציפוי: ספירה מיקרוביאלית

Microbiology

314.8K Views

article

תרביות העשרה: מיקרואורובים אירוביים ואנאירוביים פולחניים על מדיות סלקטיביות ודיפרנציאליות

Microbiology

131.9K Views

article

תרביות טהורות ו ציפוי פסים: בידוד מושבות חיידקיות בודדות מדגם מעורב

Microbiology

165.9K Views

article

ריצוף rRNA 16S: טכניקה מבוססת PCR לזיהוי מינים חיידקיים

Microbiology

188.2K Views

article

עקומות צמיחה: יצירת עקומות צמיחה באמצעות יחידות יוצרות מושבה ומדידות צפיפות אופטית

Microbiology

294.1K Views

article

בדיקת רגישות אנטיביוטית: בדיקות אפסילומטר לקביעת ערכי המיקרופון של שתי אנטיביוטיקות והערכה של סינרגיה אנטיביוטית

Microbiology

93.6K Views

article

מיקרוסקופיה וכתמים: גרם, כמוסה וכתמים אנדוספור

Microbiology

362.7K Views

article

פלאק אסאי: שיטה לקביעת טיטר ויראלי כיחידות יוצרות פלאק (PFU)

Microbiology

185.8K Views

article

טרנספורמציה של תאי E. coli באמצעות הליך סידן כלוריד מותאם

Microbiology

86.4K Views

article

הטיות: שיטה להעברת עמידות אמפיצ'ין מתורם לנמען E. coli

Microbiology

38.1K Views

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved