Phagen-Transduktion: Eine Methode zur Übertragung der Ampicillinresistenz von einem Spender auf den Empfänger E. coli

Quelle: Alexander S. Gold¹, Tonya M. Colpitts^1
1 Department of Microbiology, Boston University School of Medicine, National Emerging Infections Diseases Laboratories, Boston, MA

Transduktion ist eine Form des genetischen Austauschs zwischen Bakterien, die Bakteriophagen oder Phagen verwenden, eine Klasse von Viren, die ausschließlich prokaryotische Organismen infiziert. Diese Form der DNA-Übertragung, von einem Bakterium zum anderen durch einen Phagen, wurde 1951 von Norton Zinder und Joshua Ledererg entdeckt, die den Prozess als "Transduktion" bezeichneten (1). Bakteriophagen wurden erstmals 1915 vom britischen Bakteriologen Frederick Twort entdeckt, 1917 vom französisch-kanadischen Mikrobiologen Felix d'Herelle (2) selbstständig wieder entdeckt. Seitdem sind die Struktur und Funktion dieser Phagen weithin charakterisiert (3), wodurch diese Phagen in zwei Klassen unterteilt wurden. Die erste dieser Klassen sind die lytischen Phagen, die sich bei einer Infektion innerhalb des Wirtsbakteriums vermehren, den bakteriellen Stoffwechsel stören, die Zelle lysieren und Nachkommenphagen freisetzen (4). Als Ergebnis dieser antibakteriellen Aktivität und der zunehmenden Prävalenz antibiotikaresistenter Bakterien haben sich diese lytischen Phagen in letzter Zeit als Ersatzbehandlung für Antibiotika erwiesen. Die zweite dieser Klassen sind die lysogene Phagen, die sich entweder innerhalb des Wirts über den lytischen Zyklus vermehren können oder in einen ruhestillenden Zustand eintreten, in dem ihr Genom in das des Wirts integriert ist (Abbildung 1), ein Prozess, der als Lysogenie bekannt ist, mit der Fähigkeit für Phagen Produktion in mehreren späteren Generationen induziert werden (4).

Abbildung 1: Infektion der Wirtszelle durch Bakteriophagen. Adsorption durch den Phagen an die bakterielle Zellwand über Wechselwirkungen zwischen den Schwanzfasern und dem Rezeptor (lila). Einmal auf der Zelloberfläche angekommen, wird der Phagen irreversibel mit der Grundplatte (schwarz) an der Bakterienzelle befestigt, die durch den kontraktilen Mantel (gelb) zur Zellwand bewegt wird. Das Phage-Genom (rot) gelangt dann in die Zelle und integriert sich in das Genom der Wirtszelle.

Während bakterielle Transduktion ein natürlich vorkommender Prozess ist, wurde sie mit moderner Technologie für den Transfer von Genen in Bakterien im Labor verfahren. Durch das Einfügen von Genen von Interesse in das Genom eines lysogenen Phagens, wie Phagen, ist man in der Lage, diese Gene in die Genome von Bakterien zu übertragen und folglich innerhalb dieser Zellen auszudrücken. Während andere Methoden des Gentransfers, wie die Transformation, ein Plasmid für Gentransfer und Expression verwenden, hat die Einfügung des Phagengenoms in das des Empfängerbakteriums nicht nur das Potenzial, diesem Bakterium neue Merkmale zu verleihen, sondern ermöglicht auch natürlich vorkommende Mutationen und andere Faktoren der zellulären Umgebung, um die Funktion des übertragenen Gens zu verändern.

Im Vergleich zu anderen Methoden des horizontalen Gentransfers, wie z. B. Konjugation, ist die Transduktion in den Kriterien, die für Spender- und Empfängerzellen erforderlich sind, ziemlich flexibel. Jedes genetische Element, das in das Genom des verwendeten Phagens passen kann, kann von jedem Stamm von Spenderbakterien auf jeden Stamm von Empfängerbakterien übertragen werden, solange beide für den Phagen freisind, was die Expression der notwendigen Phagenrezeptoren auf der Zelloberflächen. Sobald dieses Gen aus dem Spendergenom herausgebracht und in den Phagen verpackt ist, kann es an den Empfänger übertragen werden. Nach der Transduktion ist es notwendig, für EmpfängerBakterien auszuwählen, die das Gen von Interesse enthalten, für die ausgewählt werden muss. Dies könnte durch die Verwendung eines genetischen Markers, wie z. B. eines FLAG-Tags oder Polyhistidin-Tags, erfolgen, um das Gen von Interesse oder die intrinsische Funktion des Gens im Falle von Genen zu kennzeichnen, die für Antibiotikaresistenzen kodieren. Darüber hinaus könnte PCR verwendet werden, um eine erfolgreiche Transduktion weiter zu bestätigen. Durch die Verwendung von Primern für eine Region innerhalb des Gens von Interesse und den Vergleich von Signal enden mit einer positiven Kontrolle, Bakterien, die das Gen von Interesse haben, und einer negativen Kontrolle, Bakterien, die die gleichen Schritte wie die Transduktionsreaktion ohne Phagen durchliefen. Während die bakterielle Transduktion ein nützliches Werkzeug in der Molekularbiologie ist, spielt sie eine wichtige Rolle bei der Evolution von Bakterien, insbesondere im Hinblick auf den jüngsten Anstieg der Antibiotikaresistenz.

In diesem Experiment wurde die bakterielle Transduktion verwendet, um die Genkodierung für die Resistenz gegen das Antibiotikum Ampicillin vom W3110-Stamm von E.coli auf den J53-Stamm über das P1-Bakteriophagen (5) zu übertragen. Dieses Experiment bestand aus zwei Hauptschritten. Erstens die Herstellung von P1-Phagen, das das Ampicillin-Resistenzgen aus dem Spenderstamm enthält. Zweitens die Übertragung dieses Gens auf den Empfängerstamm durch Transduktion mit dem P1-Phagen (Abbildung 1). Nach der Durchführung konnte die erfolgreiche Übertragung des Ampicillinresistenzgens durch qPCR bestimmt werden (Abbildung 2). Wenn die Transduktion erfolgreich wäre, wäre der J53-Stamm von E. coli resistent gegen Ampicillin und das Gen, das diese Resistenz durch qPCR nachweisbar macht. Bei einem Erfolglosen würde es keinen Nachweis des Ampicillinresistenzgens geben und Ampicillin würde immer noch als wirksames Antibiotikum gegen den J53-Stamm wirken.

Abbildung 2: Bestätigung einer erfolgreichen Transduktion durch qPCR. Durch den Vergleich der C q-Werte, die für das Gen von Interesse aus der Transduktionsreaktion und der Negativkontrollreaktion nachgewiesen wurden, und die Normalisierung dieser Werte mit einem Housekeeping-Gen konnte man bestätigen, dass die bakterielle Transduktion erfolgreich war.

1. Einrichtung

1. Bevor Sie mit einer Arbeit mit Mikroben zu tun haben, sterilisieren Sie den Arbeitsbereich mit 70% Ethanol. Verwenden Sie immer die notwendige PSA (Labormantel und Handschuhe).
2. Stellen Sie sicher, dass LB-Agarplatten mit 1x Ampicillin, handelsübliche P1-Phagenlysatlösung, Chloroform, 1 M Natriumcitrat, Glycerin und eine Schachtel vorsterilisierter Kunststoffpipettenspitzen und Zellstreuer in der Nähe sind.
3. Bereiten Sie sterile LB durch Autoklavieren vor und verwenden Sie es, um drei 1 ml Aliquots von LB-Salzlösung herzustellen.
   1. mM MgCl₂ (952.11-2.3803 'g), 5 mM CaCl₂ (11.098 mg), 0.1-0.2% Glukose (100-200 g)
   2. mM MgSO₄ (12.0366 mg), 5 mM CaCl₂ (11.098 mg)
   3. mM Natriumcitrat (25.806 mg)
4. Nach der Fertigstellung alle Oberflächen sowie Handschuhe mit 70% Ethanol sterilisieren und die Hände waschen.

2. Protokoll

1. Spender Phage Lysate Vorbereitung
   1. Bereiten Sie eine 1 ml Kultur des Spenders W3110 Stamm E. coli in LB mit 1x Ampicillin über Nacht bei 37 °C mit Belüftung und Schütteln bei 220 U/min.
   2. Verdünnen Sie diese Nachtkultur 1:100 in 1 ml frischelb ergänzt mit 10-25 mM MgCl₂, 5 mM CaCl₂, und 0.1-0.2% Glukose.
   3. Wachsen Sie diese bakterielle Verdünnung bei 37 °C für 2 Stunden mit Belüftung und Schütteln bei 220 Rpm.
   4. Sobald diese Zellen eine frühe logarithmische Wachstumsphase erreicht haben (spürbares Wachstum und leichte Trübung), 40 l kommerziell erhältlichen P1-Phagen hinzufügen und bei 37 °C mit Belüftung und Schütteln bei 220 Umdrehungen pro Minute ablassen.
      1. Vor der Phagenzugabe sollte die gemessene optische Dichte bei 600 nm dieser Zellen etwa 0,4 (6) betragen.
   5. Überwachen Sie Zellen 1-3 Stunden lang, bis die Kultur lysiert ist.
      1. Lyse führt zu erhöhtem zellulären Schmutz sowie zu einer spürbaren Abnahme der Trübung (d.h. Zellen werden als lysiert betrachtet, sobald man in der Lage ist, durch die Kultur zu sehen).
   6. Fügen Sie dem Lysat mehrere Tropfen (50-100 l) Chloroform hinzu und mischen Sie sie durch Wirbel.
      1. Chloroform sterilisiert das Phagenlysat, indem es alle verbleibenden Spenderzellen tötet, nur noch Phagen hinterlässt und den Titer dieses Lysats erhöht.
   7. Zentrifuge lysiert bei 14.000 U/min für 2 Minuten, um Schmutz zu entfernen und Überstand in ein frisches Rohr zu übertragen.
   8. Ein paar Tropfen Chloroform dazugeben und bei 4 °C für nicht mehr als einen Tag lagern.
2. Transduktion
   1. Bereiten Sie eine 1 ml Kultur des Empfängers J53-Stamm E. coli über Nacht in LB bei 37 °C mit Belüftung und Schütteln bei 220 U/min.
   2. Übertragen Sie 100 l Spenderphagenlysat (2,1) in ein 1,5 ml Mikrofugenrohr und inkubieren Sie mit einer Kappe, die bei 37 °C für 30 Minuten geöffnet ist.
      1. Diese Inkubation ermöglicht es, dass alle verbleibenden Chloroformen in der P1-Lysatlösung verdampfen, bevor sie den Empfängerzellen zugesetzt werden.
   3. Sanft Pellet-Empfänger-Stammzellen durch Zentrifugation bei 6.000 U/min für 5 Minuten.
   4. Setzen Sie diese Zellen in 300 l frischem LB mit 100 mM MgSO₄ und 5 mM CaCl₂wieder aus. (P1-Phagen erfordert Kalzium, um infektiös zu sein).
   5. Richten Sie zwei Reaktionen mit den Empfängerbakterienzellen und vorbereiteten Spenderphagenlysat ein: 1) Transduktionsreaktion, die 100-L-Empfänger-J53-Stamm E. coli und 100 L Spenderphagenlysat kombiniert, und 2) Negativkontrolle, die 100-L-Empfänger-J53-Stamm kombiniert E. coli und 100 l LB mit 100 mM MgSO₄ und 5 mM CaCl₂.
   6. Bei 37 °C 30 Minuten mit Schütteln bei 220 Rpm inkubieren.
   7. 1 ml LB und 200 l 1M Natriumcitrat (pH=5,5) hinzufügen und 1 Stunde bei 37 °C mit Schütteln bei 220 Rpm inkubieren.
      1. Citrat wird verwendet, um die Infektiosität von P1 durch Chelatmitat mit Kalzium zu reduzieren, die Lyse von Empfängerbakterien zu verhindern.
      2. Die Inkubation dieser Lösung ermöglicht die Expression des Ampicillin-Resistenzmarkers.
   8. Pelletzellen durch Zentrifugation bei 6.000 U/min für 5 Minuten.
   9. Zellpellets in 100 l LB mit 100 mM Natriumcitrat (pH 5,5) wieder aufsetzen. Vortex und Platte Gesamtlösung für beide Reaktionen auf zwei LB Agarplatten.
      1. LB-Platte sollte 1x Amp für die transduced Probe und keine Amp für die negative Kontrolle haben.
      2. P1-Phagenkontamination auf dieser Platte muss erneut gestreift werden, bevor Gefriervorräte vorbereitet werden können.
      3. Wenn phagen nicht entfernt wird, werden Kulturen, die aus diesen Kolonien wachsen, nur in Gegenwart eines Kalziumchelators wachsen.
   10. Wählen Sie etwa 3-4 Kolonien von beiden Platten und streifen Sie wieder auf zwei LB Agarplatten verteilt mit 100 l von 1 M Natriumcitrat (pH =5,5).
       1. LB-Platte sollte 1x Amp für die transduced Probe und keine Amp für die negative Kontrolle haben.
   11. Inkubieren Sie die Platten bei 37 °C über Nacht, damit Kolonien ohne Phagen wachsen können.
   12. Pflücken Sie Kolonien von beiden Platten und verwenden Sie sie, um Übernachtkulturen in 5 ml LB bei 37 °C mit Belüftung und Schütteln bei 220 Rpm anzubauen.
   13. Isolieren Sie DNA aus diesen Kulturen durch DNA Miniprep mit 4,5 ml des gesamten Kulturvolumens.
       1. Elute DNA mit 35 l nukleasefreiem Wasser.
       2. Messen Sie die resultierende Konzentration durch Nanodrop. Reine DNA erzeugt ein Absorptionsverhältnis (A_260/280) von etwa 1,8.
   14. Verwenden Sie die restlichen 0,5 ml jeder Kultur, um 1 ml Glycerinvorräte zuzubereiten, indem Sie eine 1:1-Mischung aus 100% Glycerin und Bakterienkultur herstellen.
   15. Bakterielle Glycerinbestände bei -80 °C lagern.

3. Datenanalyse und Ergebnisse

1. Bestätigung der Transduktion durch qPCR
   1. Bereiten Sie zwei qPCR-Master-Mischungen für sechs qPCR-Reaktionen vor, drei mit qPCR-Primern für das Ampicillin-Resistenzgen und die anderen drei qPCR-Primer für ein Housekeeping-Gen (14,5 l pro Reaktion): 12,5 l qPCR-Puffermischung + 1 L Vorwärtsprimer + 1 L-Reverse-Primer.
      1. In diesem Experiment haben wir SYBR Green Master Mix verwendet.
      2. Housekeeping-Genprimer wurden entwickelt, um ein DNA-Segment innerhalb des bakteriellen Gens zu verstärken, das für DNA-Gyrase B (7) kodiert.
   2. Kombinieren Sie für jede qPCR-Reaktion 100 g DNA aus jeder Reaktion (10,5 l) mit 14,5 l qPCR-Master-Mix.
   3. Mit Hilfe einer qPCR-Maschine und des in Tabelle 1 aufgeführten Thermocycling-Protokolls wurde die Amplifikation für die Ampicillinresistenz- und Haushaltsgene für alle sechs Reaktionen gemessen.
   4. Cq-Werte, die von qPCR generiert wurden, wurden verwendet, um die normalisierte Transduktionseffizienz des Ampicillinresistenzgens zu berechnen (Abbildung 3), was die erfolgreiche Transduktion des Ampicillinresistenzgens bestätigt.
      1. Der Cq-Wert oder Zyklusquantifizierungswert einer Stichprobe ist die früheste PCR-Zyklusnummer, bei der ein Signal, das den Hintergrundschwellenwert überschritten hat, erkannt wird. Niedrige Cq-Werte entsprechen mehr Zielsequenz, umgekehrt.
      2. Die normalisierte Transduktionseffizienz eines Gens innerhalb einer Probe kann anhand dieser Cq-Werte berechnet werden, indem der Wert des Housekeeping-Gens von dem des Zielgens subtrahiert wird, wodurch ein Cq-Wert generiert wird, der zur Berechnung normalisierter Transduktion verwendet werden kann. Effizienz um 2^(-Cq).

Tabelle 1: qPCR Thermocycling Protocol

Die Übertragung von Genen zu und von Bakterien durch Bakteriophagen, während ein natürlicher Prozess, hat sich als äußerst nützlich für eine Vielzahl von Forschungszwecken. Während andere Methoden des Gentransfers wie Transformation und Konjugation möglich sind, verwendet transduktionsweise ausschließlich Bakteriophagen; nicht nur die Genintegration in das Wirtsgenom, sondern auch die Genabgabe an mehrere Bakterien, die nicht anfällig für andere Methoden sind. Dieser Prozess ist zwar besonders im Labor nützlich, wurde aber auch im neu entstehenden Bereich der Gentherapie eingesetzt, genauer gesagt in der alternativen Gentherapie, einer therapeutischen Strategie, die Bakterien nutzt, um Therapeutika für das Zielgewebe zu liefern. viele davon sind nicht anfällig für andere Verabreichungsmethoden und haben viel klinische Relevanz (8,9).

1. Lederberg J, Lederberg E.M., Zinder, N.D., et al. Recombination analysis of bacterial heredity. Cold Spring Harbor symposia Quantitative Biol. 1951;16:413-43.
2. Duckworth DH. "Who Discovered Bacteriophage?". Bacteriology Reviews. 1976;40:793-802.
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5. Moore S. Sauer:P1vir phage transduction 2010 [Available from: https://openwetware.org/wiki/Sauer:P1vir_phage_transduction].
6. Kobayashi A, et al. Growth Phase-Dependent Expression of Drug Exporters in
7. Escherichia coli and Its Contribution to Drug Tolerance. Journal of Bacteriology. 2006;188(16):5693-703.
8. Rocha D, Santos, CS, Pacheco LG. Bacterial reference genes for gene expression studies by RT-qPCR: survey and analysis. Antonie Van Leeuwenhoek. 2015;108:685-93.
9. Pálffy R. et al. Bacteria in gene therapy: bactofection versus alternative gene therapy. Gene Ther. 2006 13:101-5.
10. O'Neill JM, et al. Intestinal delivery of non-viral gene therapeutics: physiological barriers and preclinical models. Drug Discovery Today. 2011;16:203-2018.