מודל מורין של היפרטרופיה של חדר ימין הנגרמת על ידי עומס יתר וכישלון על ידי רצועות גזע ריאתי

אנו מתארים מודל מוריני של עומס יתר על לחץ החדר הימני המושרה על ידי רצועות גזע ריאתי. פרוטוקולים מפורטים לאינטובציה, ניתוח ופנוטיפ על ידי אקוקרדיוגרפיה כלולים במאמר. מכשירים בהתאמה אישית משמשים לאינטובציה וניתוח, המאפשרים שכפול מהיר וזול של הדגם.

כשל בחדר ימין (RV) הנגרם כתוצאה מעומס יתר קשור קשר הדוק לתחלואה ותמותה במספר מחלות לב וכלי דם וריאות. הפתוגנזה של כשל RV היא מורכבת ואינה מובנת כראוי. כדי לזהות אסטרטגיות טיפוליות חדשות לטיפול בכשל קרוואנים, מודלים חזקים וניתנים לשחזור של בעלי חיים הם חיוניים. מודלים של רצועת גזע ריאתי (PTB) צברו פופולריות, שכן ניתן להעריך את תפקוד RV ללא תלות בשינויים בכלי הדם הריאתיים.

במאמר זה, אנו מציגים מודל מורין של עומס יתר בלחץ RV המושרה על ידי PTB בעכברים בני 5 שבועות. ניתן להשתמש במודל כדי לגרום לדרגות שונות של פתולוגיה של RV, החל מהיפרטרופיה קלה של RV ועד לכישלון RV מפוצל. פרוטוקולים מפורטים עבור אינטובציה, ניתוח PTB ופנוטיפ על ידי אקוקרדיוגרפיה כלולים במאמר. כמו כן, ניתנות הוראות להתאמה אישית של מכשירים לאינטובציה ולניתוחי PTB, המאפשרים שכפול מהיר וזול של מודל ה-PTB.

אטבי קשירת טיטניום שימשו כדי לכווץ את תא המטען הריאתי, מה שהבטיח רמה מאוד ניתנת לשחזור ובלתי תלויה במפעיל של התכווצות גזע ריאתי. חומרת ה-PTB דורגה על ידי שימוש בקטרים שונים של קליפס קשירה פנימי (קל: 450 מיקרומטר וחמור: 250 מיקרומטר). זה הביא לפתולוגיה של RV החל מהיפרטרופיה עם תפקוד RV שמור ועד כשל RV מפוצל עם תפוקת לב מופחתת וביטויים חוץ-לבביים. תפקוד RV הוערך על ידי אקוקרדיוגרפיה שבוע ושלושה שבועות לאחר הניתוח. דוגמאות לתמונות ותוצאות אקוקרדיוגרפיות מוצגות כאן. כמו כן, מוצגות תוצאות של צנתור לב ימין וניתוחים היסטולוגיים של רקמת הלב.

אי ספיקת חדר ימין (RV) היא תסמונת קלינית עם תסמינים של אי ספיקת לב וסימנים של גודש מערכתי כתוצאה מתפקוד לקוי של RV¹. תפקוד לקוי של RV קשור קשר הדוק לתחלואה ותמותה במספר מחלות לב וכלי דם וריאות². האטיולוגיה של תפקוד לקוי של RV היא מורכבת, ומסלולי האיתות והוויסות הבסיסיים שלה עדיין לא הובהרו כראוי.

תצפיות מהטיפולים הנוכחיים מראות כי תפקוד RV משופר נמצא בקורלציה קרובה להפחתת עומס לאחר מכן, מה שמרמז על כלי דם ריאתיים כיעד הטיפול העיקרי³. זה מצביע על כך שלטיפולים הנוכחיים יש רק השפעה ישירה מינימלית על תפקוד RV, אשר יכול להידרדר גם לאחר שיפור בהתנגדות כלי הדם הריאתיים³. לפיכך, יש צורך רב במחקר נוסף לשיפור תפקוד הקרוואנים ללא תלות בהפחתת עומס לאחר מכן.

מודלים חזקים וניתנים לשחזור של בעלי חיים חיוניים בחיפוש אחר סוכנים טיפוליים חדשים. ברוב המודלים של אי ספיקת RV כרונית, הסיבה הבסיסית היא יתר לחץ דם ריאתי המושרה על ידי שינוי מבני של כלי הדם הריאתיים ^4,5,6. מודלים מאופיינים היטב כוללים את מודל ההיפוקסיה הכרונית ^7,8, מודל Sugen-hypoxia ^9,10,11, ואת מודל monocrotaline ^12,13. מכיוון שכשל RV הוא משני ליתר לחץ דם ריאתי במודלים אלה, לא ניתן להבדיל בין ההשפעות של התערבויות על כלי הדם הריאתיים לבין ההשפעות הישירות על RV⁶.

כדי לחקור את ה-RV באופן עצמאי מכלי הדם הריאתיים, מודל פס תא המטען הריאתי (PTB) צבר פופולריות ותואר במספר מיני בעלי חיים, כולל עכברים, חולדות, ארנבות, כלבים, כבשים וחזירים ^{6,14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,} 24,25,26,27. במודלים של PTB, התכווצות של תא המטען הריאתי מושגת בניתוח, מה שגורם לעלייה בלחץ RV⁶. קיימות גישות שונות ליישום PTB, כולל כיווץ של הכלי עם ליגטורה או עם קליפס קשירת מתכת^18,28. במודלים המשתמשים בליגטורות, תא המטען הריאתי קשור למחט, והמחט נסוגה, ומשאירה את הרצועה במקומה. התוצאה היא התכווצות של כלי הדם התלויה בגודל המחט ובמתח הקשר^18,29. בדגמים המשתמשים בתפסי קשירת מתכת, מידת התכווצות תא המטען הריאתי עשויה להיות ניתנת לשחזור יותר. תוספות קשירה שהשתנו משמשות לסגירת תפסי הקשירה לקוטר מוגדר מראש וקבוע. זה הופך את השיטה לבלתי תלויה במפעיל ומפחית את השונות הקשורה ל- PTB בפנוטיפ המחלה 15,27,28.

דגמי Murine PTB הוכחו כגורמים להיפרטרופיה של RV וכישלון^18,28. אחד האתגרים העיקריים בעת שימוש במודל PTB הוא בחירת קוטר PTB המתאים כדי להשיג את הדרגה הרצויה של פתולוגיית RV. זה מאתגר במיוחד כאשר מנסים למדל כשל RV מפוצל. לשם כך, ההתכווצות צריכה להיות הדוקה מספיק כדי לגרום לכשל RV כרוני מבלי להוביל לכשל RV חריף ומוות זמן קצר לאחר ניתוח⁶. גישה אחת לפתרון אתגר זה היא להשתמש בגמילה או בבעלי חיים צעירים ^6,15. מודל PTB שימש בהצלחה לחקר שלבים שונים של כשל RV באמצעות גמילה^{מחולדות} Wistar ^15,30. כדי להשיג זאת, חולדות צעירות עם פוטנציאל גדילה שנותר עברו ניתוח PTB עם יישום של קליפסים קשירת טיטניום. כאשר החולדות גדלו, היצרות הריאות החמירה בהדרגה וגרמה להיפרטרופיה של RV או לאי ספיקת RV כרונית, בהתאם לחומרת PTB^15,30. בהשראת מודל זה, שיערנו כי שלבים שונים של פתולוגיית RV יכולים להיווצר במודל PTB מורין באמצעות עכברים צעירים. חקר ספקטרום רחב של פתולוגיה של RV ממחלה קלה למחלה קשה עשוי לעזור להבהיר את הבנתנו את התקדמות המחלה ואת המעבר מהיפרטרופיה של RV לכשל RV.

כאן, אנו מציגים מודל מורין של עומס יתר בלחץ RV המושרה על ידי PTB בעכברים צעירים. עם מודל זה, דרגות שונות של פתולוגיה RV ניתן לייצר, החל היפרטרופיה RV כדי כישלון RV מפוצל. מחקר זה כולל פרוטוקולים מפורטים לאינטובציה, ניתוחי PTB ופנוטיפ באמצעות אקוקרדיוגרפיה.

המחקר אושר על ידי המפקח הדני על ניסויים בבעלי חיים (מספר הרשאה: 2021-15-0201-00928) ובוצע בהתאם לחקיקה הלאומית בנושא חיות מעבדה. במחקר זה נעשה שימוש בעכברי C57BL/6N זכרים בני 5 שבועות.

1. התאמה אישית של מכשירים לאינטובציה ולניתוח (איור 1)

הערה: סעיף זה מפרט את השלבים החשובים ביותר בהכנת מכשירים בהתאמה אישית לאינטובציה וניתוחי PTB מחומרים זולים וזמינים.

1. הכינו את הצינור האנדוטרכאלי (איור 1A).
   ניתן להשתמש בצנתרים תוך-ורידיים נפוצים (IV) לאינטובציה ואוורור של עכברים.
   1. בחר את הגודל המתאים של קטטר תוך כלי המתאים לגודל העכברים. צנתר 22G מומלץ לעכברים בני 5 שבועות (17-20 גרם) וצנתר 23G לעכברים גדולים יותר (>20 גרם).
   2. משוך את המחט ונתק את מנגנון הנעילה. מחזירים את המחט לצנתר וחותכים את קצה המחט בזווית של 45°, כ-2 מ"מ מקצה הצנתר.
   3. השתמשו בנייר זכוכית כדי להקהות את הקצה כדי למנוע פגיעה במיתרי הקול של העכברים.
   4. חתכו כנף אחת של הצנתר לראייה טובה יותר במהלך האינטובציה.
2. הכינו את מסיר בית החזה (איור 1B).
   1. השתמש במחזיק מחט כדי לכופף חתיכת חוט מתכת גמיש באורך של כ-10 ס"מ באמצע בזווית של 30°.
   2. השתמש במחזיק המחט כדי ליצור בזהירות ווים א-טראומטיים ברוחב 5 מ"מ בשני קצוות החוט.
3. הכינו את מעמד האינטובציה (איור 1C).
   הערה: השימוש בעמדת אינטובציה מאפשר אספקה רציפה של הרדמה דרך צינור האף במהלך אינטובציה. זה מאפשר אינטובציה מבוקרת ובטוחה תחת הנחיה חזותית, אשר מפחיתה את הסיכון לפגיעה במיתרי הקול וקנה הנשימה, כמו גם את הסיכון של מיקום שגוי של הצינור בוושט. כל מסגרת מתכת או פלסטיק יכולה לשמש כמסגרת למעמד האינטובציה. במחקר זה נעשה שימוש במחזיק תפקידים מעט כפוף במטבח.
   1. חותכים חתיכת צינור גומי בקוטר 3 ס"מ המתאים לחוטם של עכבר ומחברים אותו לשסתום צנתר IV. ניתן לחבר הרדמה ממסים נדיפים דרך המסתם לפני אינטובציה.
   2. בצע לולאה באמצעות תפר קלוע 1-0 כ 5 מ"מ מפתח הצינור. זה ישמש כדי לאבטח את חוטם murine בצינור.
   3. חותכים חור ליד החלק העליון של יריעת פלסטיק גמישה ומניחים את הצינור בתוך החור. הסדין משמש לתמיכה בעכבר במעמד האינטובציה.
   4. השתמשו בסרט הדבקה כדי להחזיק את החלקים הבודדים יחד כפי שמוצג באיור 1C.
4. הכינו את צינורית ההנחיה (איור 1D, E).
   1. משוך תפר מונופילמנט 6-0 דרך צינורית 27G קהה וקשר קשר על התפר. השתמש בקשר זה מאוחר יותר כדי לתפוס את התפר במהלך ניתוח PTB.
   2. השתמש במחזיק מחט כדי לכופף את קצה הצינורית לזווית של 80 מעלות.
5. הכינו את יישום תפס הקשירה.
   הערה: יישום תפס קשירה עם לסתות זוויות משתנה באמצעות מנגנון עצירה מתכוונן (איור 1F), אשר עוצר את דחיסת תפס הקשירה כאשר הלסתות נמצאות במרחק מדויק שנקבע מראש זו מזו. יישום קליפ הקשירה שונה משמש ליישום קליפסים קשירת טיטניום על תא המטען הריאתי.
   1. קבע חתיכת פליז חתוכה בהתאמה אישית לידיות של יישום תפס הקשירה באמצעות שני ברגים. הרכיבו בורג מתכוונן במרכז (איור 1F, חץ לבן) שקובע את המרחק המדויק בין הידיות הדחוסות של יישום תפס הקשירה, המתאים למרחק מדויק בין הלסתות.

איור 1: מכשירים לאינטובציה ולניתוחי PTB. (A) צינור אנדוטרכאלי העשוי מצנתר בעירוי. (B) מסיר בית החזה. (ג) מעמד אינטובציה ועכבר שהונחו בעמדת אינטובציה וקיבלו הרדמה על צינור אף. (D) כלי ניתוח ותפס קשירה מותאם המשמש לניתוח PTB. (ה) צינורית הנחיה. (F) מנגנון עצירה מתכוונן בהתאמה אישית. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

2. התאמת יישום תפס הקשירה

1. בחר את הקוטר הפנימי של תפס הקשירה בהתבסס על חומרת הכשל הרצויה של RV. עבור עכברים זכרים בני 5 שבועות C57BL/6N (17-20 גרם), השתמש בקוטר קליפס של 250 מיקרומטר עבור חמור ו 450 מיקרומטר עבור עומס לחץ RV קל. השתמש בקטרים של קליפס ביניים כדי לגרום לעומס יתר בלחץ מתון.
2. השתמש בחוט מתכת או במחטים כדי לכוונן את יישום תפס הקשירה. ודא שקוטר החוט תואם לקוטר הקליפ הרצוי.
3. טען את יישום התפס עם תפס קשירה והנח את חוט ההתאמה במרכז תפס הקשירה. בעת דחיסת יישום התפס, סובב את הבורג עד שהלסתות של האטב ייכנסו בחוזקה סביב החוט. ודא שהתפס נשאר במקומו על חוט הכוונון לאחר שחרור יישום התפס.
4. כאשר יישום התפס מותאם, הנח תפס קשירה נוסף על חוט ההתאמה כדי לאמת את הקוטר שנקבע.

3. הכנות לניתוח

1. יש להשרות הרדמה בתא זירוז באמצעות 7% סבופלורן ב-0.6 ליטר/דקה 100% חמצן. יש לוודא הרדמה מספקת על ידי צביטת בוהן לפני האינטובציה.
   הערה: ניתן להשתמש גם באיזופלורן. שימו לב שיש להשתמש בריכוזים שונים.
2. הכנס את העכבר עם צנתר IV 22G. בצעו אינטובציה בהנחיה חזותית, באמצעות מיקרוסקופ כירורגי ומעמד אינטובציה, המאפשרים יישור נכון להדמיית מיתרי הקול ואספקה רציפה של חומרי הרדמה ממסים נדיפים על צינור האף (איור 1C).
3. אוורר את העכבר במהירות של 175 פעימות לדקה ונפח גאות של 300 μL/stroke.
   הערה: מומלץ גם נפחי גאות ושפל של 8-10 מיקרוליטר/גרם, ונפח הגאות האידיאלי תלוי בדליפה אפשרית ובחלל מת במערכת האוורור.
4. הניחו את העכבר המובנה על כרית חימום מכוסה (37°C) ומרחו משחת לחות על עיני העכבר.
5. יש לשמור על הרדמה (3.5% סבופלורן ב-0.6 ליטר/דקה, 100% חמצן) ולתת 0.1 מ"ג/ק"ג בופרנורפין ו-5 מ"ג/ק"ג קרפרופן תת עורית לשיכוך כאבים פריאופרטיבי. יש להסיר את כל השיער מהחזה באמצעות קרם אפילציה ולחטא את העור במגבוני חיטוי.

4. ניתוח PTB

1. בצע חתך של 10 מ"מ בעור מעל החלל הבין-קוסטלי השני מזווית עצם החזה לקו בית השחי הקדמי השמאלי. פיצול שרירי החזה הגדולים והקטנים על ידי דיסקציה קהה.
2. חתכו את השרירים הבין-קוסטליים בחלל הבין-קוסטלי השני ונתחו בבוטות את בלוטת התימוס כדי לחשוף את הלב, תא המטען הריאתי ואבי העורקים. מקם מסיר חזה בחלל הבין-קוסטלי כדי לשמור על שדה הניתוח נגיש.
   הערה: יש לנקוט בזהירות רבה בעת חיתוך השרירים הבין-קוסטליים, שכן עורק החלב הפנימי השמאלי פועל רק 1-2 מ"מ לרוחב עצם החזה. פגיעה בעורק זה עלולה לגרום לאיבוד דם משמעותי.
3. הפרידו את גזע הריאה מאבי העורקים העולה על ידי הסרה בוטה של רקמת החיבור בין כלי הדם באמצעות מלקחיים מיקרוסקופיים. שפר את החשיפה של תא המטען הריאתי עוד יותר על ידי סיבוב פלג הגוף התחתון של העכבר (רגל שמאל על רגל ימין).
4. מעבירים את צינורית ההנחיה דרך הסינוס הרוחבי של קרום הלב האחורי של תא המטען הריאתי. השתמש במלקחיים כדי לתפוס את הקשר בקצה צינורית ההנחיה ומשוך את התפר דרך צינורית ההנחיה. הסר בזהירות את צינורית ההנחיה בזמן שהתפר נשאר במקומו סביב תא המטען הריאתי.
5. טען את יישום תפס הקשירה והשתמש בתפר כדי להנחות את גזע הריאה לתוך הלסתות של תפס הקשירה ולדחוס את האטב. שחררו את התפר מיד לאחר מיקום הקליפ והתבוננו במילוי תא המטען הריאתי.
   הערה: ניתן להבחין בברדיקרדיה בשניות הראשונות לאחר מריחת קליפ הקשירה.
6. מניחים תפר נספג מונופילמנט 6-0 סביב הקוסטאה השנייה והשלישית וסוגרים את החלל הבין-קוסטלי. לפנות כמה שיותר אוויר מחלל בית החזה על ידי הפעלת לחץ עדין על החזה תוך הידוק התפר.
7. לבסוף, תפרו את העור בתפר 6-0 מונופילמנט נספג.
8. בצע את אותו ההליך, למעט הנחת תפס הקשירה (שלב 4.5), במהלך ניתוח דמה.

5. אקוקרדיוגרפיה

1. לאחר השראת הרדמה בתא זירוז (1-2 דקות, 6% סבופלורן ב-100% חמצן), יש להמשיך בהרדמה באמצעות צינור אף (3.5% סבופלורן ב-100% חמצן). הסר את כל השיער מהחזה והבטן באמצעות קרם depilatory והנח את העכבר על כרית חימום. יש למרוח משחת לחות על העיניים וג'ל אולטרסאונד על חזהו של העכבר.
   הערה: התאם רווח דו-ממדי, עומק מיקוד ועומק תמונה כדי לשפר את איכות התמונה בכל מדידות האקו לב.
2. התאימו את הגשושית העל-קולית כדי למצוא את תצוגת הציר הארוך (PLAX) (איור 2). ב- PLAX, למדוד את הקוטר הפנימי של תא המטען הריאתי ואת אינטגרל זמן המהירות (VTI) בתא המטען הריאתי.
   1. בחר במצב B והזז בזהירות את כרית החימום בציר x, y ו- z כדי לזהות את תא המטען הריאתי במרכז התמונה. השתמש בצבע כדי לזהות את קוטר תא המטען הריאתי הגדול ביותר. השתמש בחנות cine כדי ללכוד רצף למדידת קוטר תא המטען הריאתי.
   2. בחר דופלר צבע וגל דופק (PW) והצב את הסמן במרכז תא המטען הריאתי. התאם את זווית PW עד שהקווים המקווקוים מקבילים לזרימת הדם בכלי השיט.
   3. לחץ על cine store כדי למדוד VTI. מקם את הסמן ליד שני קירות תא המטען הריאתי ולחץ שוב על חנות cine כדי לרכוש זרימה ליד קיר כלי השיט.
      הערה: ניתן להעריך גם את הקוטר הפנימי של החדר הימני (RV) ואת עובי הדופן ללא RV בתצוגת PLAX.
3. מצא את תצוגת הציר הקצר הפרסטרנלי (PSAX) (איור 3) כדי למדוד את הקטרים הפנימיים של החדר השמאלי (LV), אשר יכולים לשמש להערכת בליטת מחיצה (תצורת D).
   1. בחר במצב B וסובב את הגשושית 90° נגד כיוון השעון. זווית הבדיקה 20-30 מעלות לרוחב כדי למנוע הצללה של RV על ידי עצם החזה, והטה את הבדיקה 20-30 מעלות גולגולת עד החדר השמאלי הוא עגול ככל האפשר. לאחר מכן, החלק את הבדיקה בכיוון הגולגולתי כדי לזהות את רמת השרירים הפפילריים עם קוטר החדר הגדול ביותר ולחץ על חנות cine.
      הערה: PSAX ברמה המידפפילרית עשוי לשמש גם להערכת שינוי שטח חלקי RV. PSAX ברמה של שסתום אבי העורקים עשוי לשמש למדידת קיצור חלקי RV או עובי דופן ללא RV.
4. השתמשו בתצוגה אפיקלית בת 4 תאים (A4CH) (איור 4) כדי למדוד את הטיול הסיסטולי של המישור הטבעתי הטריקוספיד (TAPSE) ולהעריך רגורגיטציה טריקוספידית.
   1. מקם את הגשושית כפי שמוצג באיור 4. לאחר זיהוי הלב, בצע התאמות קטנות לבדיקה באמצעות פרק כף היד והאצבעות בלבד כדי לזהות את כל ארבעת חדרי הלב והמסתם הטריקוספיד.
      1. זיהוי ושמירה על תצוגת A4CH טובה היא מאתגרת. הניחו את היד המפעילה את הגשושית על כרית החימום ליציבות. החלק מעט, הטה וסובב מעט את הבדיקה עד למציאת התמונה המתאימה.
      2. הזיזו את הגשושית רק בממד אחד בכל פעם: למשל, החליקו גולגולת כדי למצוא את הלב, ואז הטו את הגשושית כדי לזהות את כל ארבעת החדרים ולבסוף סובבו את הגשושית עד שכל ארבעת החדרים והשסתום הטריקוספיד נמצאים במסגרת. במידת הצורך, חזור על כל שלושת השלבים מספר פעמים לפני קבלת התמונה האידיאלית.
   2. לאחר זיהוי המסתם הטריקוספיד, בחר במצב M ומקם את הקו המקווקו בטבעת הטריקוספידית של הקיר החופשי. לחץ על cine store כדי לשמור את המידות.
   3. בחר צבע כדי להעריך את המסתם tricuspid עבור regurgitation. אם קיימת רגורגיטציה, סילון של זרימה נסוגה מה-RV לאטריום הימני (RA) ייראה בסיסטולה (איור 5).
      הערה: בתצוגת A4CH, ניתן למדוד גם דופלר רקמות בדופן החופשית של RV ומהירות זרימת RV.

איור 2: מבט על ציר ארוך פאראסטרנלי (PLAX). (A-D) מיקום של הבדיקה העל-קולית. (ה, F) הלב המורין הרגיל ב- PLAX. (ז, ח) התרחבות RV והיפרטרופיה לאחר PTB. קיצורים: LV: חדר שמאל, RV: חדר ימני, PV: מסתם ריאתי, PT: גזע ריאתי, Ao: אבי העורקים. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 3: מבט על ציר קצר פרסטרנלי (PSAX). (A-D) מיקום הבדיקה העל-קולית. (ה, ו) הלב המורין הרגיל ב- PSAX. (ז, ח) PSAX לאחר PTB. קיצורים: LV: חדר שמאל, RV: חדר ימני, PM: שריר פפילרי. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 4: מבט אפי בן 4 תאים (A4CH). (A-D) מיקום של הבדיקה העל-קולית. (ה, F) הלב המורין הרגיל בתצוגת A4CH. (ז, ח) הרחבת RV ו- RA לאחר PTB. קיצורים: LV: חדר שמאלי, RV: חדר ימני, RA: אטריום ימני, LA: אטריום שמאלי. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 5: רגורגיטציה טריקוספידית המומחשת על-ידי דופלר צבע בתצוגת A4CH. (A) בדיאסטולה, נצפתה זרימה מה-RA ל-RV (חץ). (B) במהלך סיסטולה, סילון דק של זרימה מה-RV ל-RA נראה לעין (חץ). קיצורים: LV: חדר שמאלי, RV: חדר ימני, RA: אטריום ימני, LA: אטריום שמאלי. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

6. ניתוח נתונים

1. מדוד את קוטר תא המטען הריאתי בשלושה מחזורי לב ב- PLAX והשתמש בקוטר תא המטען הריאתי הממוצע לניתוח נתונים נוספים. יש למדוד VTI בשלושה מחזורי לב ב-PLAX עבור כל אחת משלוש לולאות ה-cine המאוחסנות (במרכז תא המטען הריאתי וליד דפנות כלי השיט). השתמש בממוצע VTI של כל מדידות VTI לניתוח נוסף. השתמש בנוסחה הבאה כדי לחשב CO:
   
   רדיוס תא המטען הריאתי, HR: קצב הלב:
2. למדוד LVEI ב PSAX ברמה midpapillary. השתמש בכלי מדידה כדי למדוד את הקוטר הפנימי הגדול ביותר של LV (LVid₁) מאמצע המחיצה ועד לקיר החופשי. לאחר מכן, מדדו את הקוטר הפנימי של LV אורתוגונלי למדידה הראשונה (_{LVid 2}). חזור על מדידות אלה בשלושה מחזורי לב וחשב LVEI באמצעות הקטרים הפנימיים הממוצעים של LV והנוסחה הבאה:
   
3. מדוד TAPSE בשלושה מחזורי לב בתצוגת A4CH והשתמש ב- TAPSE ממוצע לניתוחי נתונים נוספים.

7. צנתור לב ימין

1. למדוד את הלחץ והנפח של החדר הימני (RV) על ידי צנתור לב ימין עם צנתר מיקרו-קצה 1.4F 3 שבועות לאחר ניתוח PTB.
2. להרדים ולבצע אינטובציה לעכבר כמתואר בשלבים 3.1-3.4. הניחו את העכבר על כרית חימום מכוסה (37°C) ושמרו על הרדמה (3.5% sevoflurane ב-0.6 ליטר/דקה 100% חמצן).
3. מתן 2000 IU של הפרין (תוך שרירי [i.m.]) ו 0.5 מ"ל של NaCl (תת עורית [s.c.]).
4. באמצעות מספריים כירורגיים, לחתוך את דופן הבטן רק caudally לתהליך xiphoid ולקבל גישה לחלל החזה על ידי חיתוך בזהירות את הסרעפת לאורך החתך שלה בקיר החזה. חותכים את הסרעפת ואת costae עד גישה מספקת ללב.
5. מניחים רצועה סביב הווריד הנבוב התחתון. השתמש באפשרות זו לחסימת כלי השיט כדי להפחית עומס מראש להקלטת מדידות נפח לחץ בהמשך הפרוטוקול.
6. השתמש במחט 26G כדי לדקור בזהירות חור קטן בקרוואנים. יש לוודא שהמחט קרובה ככל האפשר לקודקוד והמחט אינה חודרת את החדר לחלוטין אלא רק משמשת כמדריך להחדרת צנתר ההולכה. אם מתרחש דימום, יש להפעיל לחץ עדין עם צמר גפן קטן כדי למזער את איבוד הדם.
7. זהה את החור הקטן בדופן החדר והכנס את הצנתר על ידי חדירה לרקמה.
   הערה: בעת החדרת הצנתר, יש להיזהר שלא לפגוע בדופן החדר הפנימי.
8. שינויים בלחץ החדר הימני (RVP) נצפים לעתים קרובות במשך מספר דקות לאחר החדרת הצנתר. המתן עד ש- RVP יתייצב כדי לקבל מדידות מייצגות של מצב יציב.
9. כדי להשיג לולאות נפח לחץ, השתמש ברצועה שמוקמה בעבר סביב הווריד הנבוב התחתון. בזהירות למשוך את ligature כדי להסתיר את כלי השיט, ובכך בהדרגה להפחית preload.
10. לאחר רישום לולאות נפח לחץ מייצגות, לחלץ את הצנתר, ולהרדים את העכבר על ידי כריתה של הלב. בשלב זה, לאסוף דגימות דם ורקמות לניתוח נוסף.

עכברי C57BL/6N (זכר, בני 5 שבועות, 17-20 גרם) חולקו באקראי ל-PTB חמור (sPTB, 250 מיקרומטר, n = 12), PTB קל (mPTB, 450 מיקרומטר, n = 9), או ניתוח דמה (דמה, n = 15). הערכת תפקוד הלב בוצעה על ידי אקוקרדיוגרפיה שבוע ושלושה שבועות לאחר הניתוח. צנתור לב ימין עם המתת חסד לאחר מכן בוצע 3 שבועות לאחר הניתוח. איברים נשקלו, ורקמת לב הוכנה לניתוחים היסטולוגיים.

אקוקרדיוגרפיה שבוע לאחר הניתוח גילתה סימנים של לחץ RV מוגבר ותפקוד לקוי של RV ב- sPTB בהשוואה לקבוצות mPTB ודמה. תפקוד לקוי של RV התבטא בירידה בתפוקת הלב (CO) וב-TAPSE (איור 6A,B). ירידה במדד האקסצנטריות של החדר השמאלי (LVEI) הצביעה על עלייה בלחץ RV (איור 6C). לכן, התערבויות היפוך עשויות להיחקר כבר לאחר שבוע אחד במודלים חמורים של PTB. קבוצת mPTB הראתה סימנים אקוקרדיוגרפיים של לחץ RV מוגבר בהשוואה לדמה (ירידה ב-LVEI) לאחר שבוע אחד, אך לא היו סימנים לתפקוד לקוי של RV כפי שהוערך על-ידי אקוקרדיוגרפיה (איור 6).

איור 6: מדידות אקו לב שבוע לאחר הניתוח. (A) תפוקת הלב (CO). (B) טיול סיסטולי מישורי טבעתי טריקוספיד (TAPSE). (C) אינדקס אקסצנטריות של החדר השמאלי (LVEI). קיצורים: mPTB: פס תא מטען ריאתי קל (PTB); sPTB: PTB חמור. הנתונים מוצגים על ידי scatterplots עם אמצעים ± SD. *p < 0.05, **p < 0.001. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

לאחר 3 שבועות, ההשפעות של ניתוח PTB הודגשו ב- sPTB עם ירידה נוספת בתפוקת הלב וירידה עקבית ב- TAPSE בהשוואה לדמה (איור 7A,B). לא נצפה הבדל בפרמטרים אקוקרדיוגרפיים בין קבוצות mPTB וקבוצות דמה לאחר 3 שבועות (איור 7A,B).

צנתור לב ימין גילה לחץ סיסטולי RV מוגבר (RVSP) בשתי קבוצות ה-PTB בהשוואה לדמה 3 שבועות לאחר הניתוח (איור 7C). תפקוד דיאסטולי של RV הושפע בקבוצת sPTB, כפי שצוין על-ידי עלייה באלסטיות הדיאסטוליות הסופיות של RV (Eed), מדד שאינו תלוי בעומס של קשיחות RV (איור 7D). התכווצות RV, כפי שהוערכה על-ידי אלסטיות סיסטוליות סופיות (Ees), עלתה גם היא בקבוצת sPTB בהשוואה לדמה, בעוד שבקבוצת mPTB נראתה עלייה לא מובהקת (איור 7E).

מדידות אנטומיות גילו היפרטרופיה מוגברת של RV עם חומרה מוגברת של PTB המתבטאת בעלייה הדרגתית ביחס משקל RV למשקל גוף (RV/BW) (איור 7F). RVSP היה פרופורציונלי באופן ליניארי למידת היפרטרופיית RV (איור 7G). אזור חתך קרדיומיוציטים RV (CSA) אישר עלייה של 40% בהיפרטרופיה של RV ב- sPTB בהשוואה לדמה, בעוד שהייתה עלייה לא משמעותית ב- mPTB בהשוואה לדמה (איור 8A-D). דרגת הפיברוזיס בקרוואן ובאטריום הימני (RA) הייתה גבוהה פי שבעה ב-sPTB בהשוואה לדמה. לא נצפתה עלייה בפיברוזיס RV ב-mPTB (איור 8E-H).

Tricuspid regurgitation (TR) נצפתה ב-64% בקבוצת sPTB לאחר שבוע אחד וב-91% לאחר 3 שבועות, בעוד שלא נמצא TR בקבוצות sham ו-mPTB (הנתונים לא מוצגים). דרגות שונות של שינוי צבע הכבד, סימן לפירוק חוץ-לבבי, נצפו בקבוצת sPTB (איור 9). לא נצפתה שינוי צבע בקבוצות mPTB ודמה.

לסיכום, אנו מראים מתאם בין קוטר הפסים לחומרת המחלה. קבוצת mPTB מחקה שלב מחלה מוקדם עם היפרטרופיה קלה של RV ללא תפקוד לקוי של RV, בעוד שקבוצת sPTB מראה סימנים של תפקוד לקוי וכישלון של RV.

איור 7: אקו לב, נפח לחץ פולשני ומדידות אנטומיות 3 שבועות לאחר הניתוח. (A) תפוקת הלב (CO). (B) טיול סיסטולי מישורי טבעתי טריקוספיד (TAPSE). (C) לחץ סיסטולי בחדר ימין (RVSP). (D) אלסטיות דיאסטוליות סופיות (Eed). (E) אלסטיות סיסטוליות סופיות (Ees). (F) יחס משקל החדר הימני ומשקל הגוף (RV/BW). (G) מתאם בין לחץ סיסטולי בחדר ימין (RVSP) לבין משקל RV/BW 3 שבועות לאחר הניתוח. ניתוח רגרסיה ליניארית בוצע ומוצג בעלילה. מותאם R² = 0.75, p < 0.001. קיצורים: mPTB: פס תא מטען ריאתי קל (PTB); sPTB: PTB חמור. נתונים מבוזרים בדרך כלל מוצגים על ידי חלקות פיזור עם אמצעים ± SD. נתונים שאינם מופצים בדרך כלל מוצגים על ידי קופסאות עם חציון עם IQR ועם שפם המייצג ערכים בתוך 1.5 x IQR מהרבעון הראשון והרבעון השלישי, בהתאמה *p < 0.05, **p < 0.001. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 8: ניתוחים היסטולוגיים של רקמת RV. (A) שטח חתך קרוואנים. (ב-ד) הוא הכתים רקמת RV מ-(B) sham, (C) mPTB ו-(D) sPTB. (E) אחוז פיברוזיס אינטרסטיציאלי ביחס לרקמה בריאה ב-RV. (F-H) רקמת RV מוכתמת בפירוסיריוס מ-(F) sham, (G) mPTB ו-(H) sPTB. קשקשים: (B-D) = 50 מיקרומטר, (F-H) = 250 מיקרומטר. הנתונים מוצגים על ידי קופסאות עם חציונים, IQR ושפם המייצגים ערכים בטווח של פי 1.5 IQR מהרבעון הראשון והרבעון השלישי, בהתאמה. *p < 0.05, **p < 0.001. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 9: דרגות שונות של שינוי צבע הכבד. שינוי הצבע דורג 0-3. הדירוג התבסס על מידת המראה המנוקד והצבע של רקמת הכבד. התמונות צולמו דרך מיקרוסקופ, מה שגרם לרקמה להיראות בהירה יותר מאשר בתאורת הסביבה. (A) 0: כבד תקין. (B) 1: כתמים בהירים ללא שינוי צבע. (C) 2: כתמים בינוניים ושינוי צבע קל. (D) 3: כתמים חמורים ושינוי צבע (כבד אגוז מוסקט). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

במאמר זה, אנו מציגים מודל מורין של היפרטרופיה וכישלון של RV הנגרמים על ידי עומס יתר. אנו מראים כי: (i) PTB בעכברים צעירים יכול לגרום לדרגות שונות של פתולוגיה של RV, החל מהיפרטרופיה קלה של RV ועד כשל RV עם סימנים חוץ-לבביים של פירוק ופיברוזיס RV מאושר היסטולוגית. (ii) סימנים של תפקוד לקוי של RV ניתן לראות ולכמת על ידי אקוקרדיוגרפיה 1 ו 3 שבועות לאחר ניתוח PTB. (iii) מידת ההיפרטרופיה של RV פרופורציונלית לחומרת ה-PTB ולעלייה בלחץ ה-RV כתוצאה מכך. מודל זה עשוי לעזור להבהיר את הפתוגנזה של כשל RV משני לעומס יתר של לחץ RV, שכן אנו מראים כי מודל PTB מתאים לחקר שלבים שונים של פתולוגיה של RV.

כדי להבטיח הצלחה ושחזור של מודל PTB murine, יש להקדיש תשומת לב רבה לצעדים הבאים. (i) בחירת קוטר תפס הקשירה המתאים. קוטר הקליפ הנכון תלוי במספר גורמים, כגון הדרגה הרצויה של עומס יתר של לחץ RV וזמן מעקב. גיל ומשקל הגוף של העכברים הם גם גורמים חשובים שיש לקחת בחשבון. בהתאם לכך, ניתן להתאים את הפרוטוקול בהתאם לשאלה המדעית הנוכחית. מסיבה זו, אנו ממליצים לבצע ניתוחי פיילוט ואקוקרדיוגרפיה בנקודות הזמן הרלוונטיות לאחר הניתוח כדי להעריך את התאמת קוטר הקליפ שנבחר. (ii) התאמה מדויקת של יישום הקליפ חיונית כדי להבטיח פתולוגיה הניתנת לשחזור. אנו ממליצים להשתמש בחוט מתכת או צינוריות בקוטר חיצוני מוגדר היטב כקו מנחה להתאמת יישום תפס הקשירה. (iii) איבוד דם היה הסיבוך החמור השכיח ביותר במהלך ניתוח PTB והגורם השכיח ביותר לתמותה לפני ואחרי הניתוח. כדי להגביל את איבוד הדם, השתמש במכשירים מיקרוכירורגיים קהים ובדיסקציה קהה במידת האפשר. השתמש במספריים כירורגיים רק כאשר מצוין בפרוטוקול. (iv) גורם נוסף לתמותה פרי-ניתוחית הוא אריתמיה לבבית. פרקים קצרים של ברדיקרדיה יכולים להתרחש במהלך דיסקציה של תא המטען הריאתי ויישום של קליפ קשירה. כדי להפחית את הסיכון לדום לב, זמן המניפולציה של תא המטען הריאתי צריך להיות מוגבל. כאשר ברדיקרדיה הוא ציין, להשהות מניפולציה של תא המטען הריאתי עד קצב הלב מנורמל. (v) הערכה אקוקרדיוגרפית ניתנת לשחזור יכולה להיות מאתגרת ודורשת הכשרה לפני השגת תוצאות הניתנות לשחזור. בשל גודלו הקטן של ה-RV, מאתגר במיוחד להשיג הדמיה טובה של ה-RV בעכברים המופעלים באמצעות דמה בתצוגת PLAX ו-A4CH. (vi) קצב הלב עשוי להשתנות באופן משמעותי במהלך הערכת אקו לב. כדי להפחית את השונות, עקוב אחר קצב הלב מקרוב והשתמש במינונים נמוכים של הרדמה תוך הבטחת הרדמה מספקת.

מגבלה של מודל PTB מורין היא הצורך בציוד כירורגי והכשרה. יש לבצע תמיד ניתוחי פיילוט לצורך אימונים, ולהתאים את השיטות לציוד זמין מקומי. השתמשנו בקליפסים לקשירת טיטניום, אשר נמצאו כשיטה הניתנת לשחזור ביותר להשראת עומס לחץ RV¹⁵. בנוסף, השימוש בקליפסים לקשירה הוכח כגורם לתמותה נמוכה יותר מחוץ לניתוח ולהתאוששות טובה יותר לאחר הניתוח בהשוואה לליגטורות כירורגיות³¹.

לאקוקרדיוגרפיה להערכת תפקוד RV יש כמה מגבלות, שכן היא תלויה במפעיל, ושונות בין ותוך אופרטורים עשויה להשפיע על תוצאות אקוקרדיוגרפיה. במחקר הנוכחי, אקוקרדיוגרפיה בוצעה על ידי שני מפעילים. כדי למנוע הטיה כתוצאה משונות בין הצופים, שני המפעילים ביצעו אקוקרדיוגרפיה על מספר שווה של עכברים מכל הקבוצות. יתר על כן, אקוקרדיוגרפיה בעכברים יש אתגרים שלה. זה נכון במיוחד בעכברים קטנים ובריאים יחסית, כפי שמעידה השונות הגדולה יותר במדידות CO ו-TAPSE לאחר שבוע אחד (איור 5) בהשוואה ל-3 שבועות (איור 6). כדי להשיג מדידה מדויקת יותר של CO, VTI בתא המטען הריאתי נמדד בשלושה מחזורי לב בשלושה מקומות שונים (במרכז תא המטען הריאתי וליד דפנות כלי השיט). יתר על כן, אקוקרדיוגרפיה הוכחה כהערכת יתר של CO בהשוואה ל- MRI בחולדות שנחשפו ל- PTB³². MRI הוא תקן הזהב למדידת CO בעכברים ולכן ניתן לשקול אותו בעת שימוש במודל³² הנוכחי. אתגר נוסף בעכברים עם עלייה מועטה או ללא עלייה בלחץ ה-RV, הוא גודלו הקטן של ה-RV, מה שמסבך את תצוגת A4CH טובה למדידה, למשל TAPSE. זה עלול לגרום להערכת חסר של TAPSE אצל עכברים מסוימים בקבוצות דמה ו- mPTB. למרות אתגרים אלה, הושגו תוצאות מובהקות סטטיסטית עבור CO ו- TAPSE ב- sPTB בהשוואה ל- sham ו- mPTB. זה מראה כי CO ו- TAPSE הם סמנים שימושיים של תפקוד RV במודל הנוכחי, אך גם מדגיש את הצורך בהכשרה מקיפה של חוקרים לפני הערכה אקוקרדיוגרפית של עכברים.

מגבלה מובנית לכל המודלים של בעלי חיים היא שלא ניתן להסיק תוצאות ישירות לבני אדם בשל הבדלים גנטיים ופיזיולוגיים.

למיטב ידיעתנו, זהו מודל ה-PTB היחיד בעכברים צעירים. גישה זו שימשה בחולדות, שם מתפתחת עלייה הדרגתית ואיטית בעומס הלוואי ככל שהחולדות גדלות. השראת מחלה איטית זו מחקה טוב יותר את התפתחותו של כשל RV כרוני¹⁵.

הפרוטוקול הנוכחי כולל שתי קבוצות נפרדות של עכברים עם דרגות שונות של תפקוד לקוי של RV. למיטב ידיעתנו, לא פורסמו מודלים אחרים של PTB הכוללים קבוצה עם היפרטרופיה קלה בלבד של RV ללא סימנים של תפקוד לקוי של RV, ליקוי המודינמי או פיברוזיס. לכן מתעלמים במידה רבה מהשלב המוקדם הזה של המחלה. חקר שלב מוקדם זה של התפתחות המחלה עשוי להגביר את הבנתנו את ההתקדמות ההדרגתית מהיפרטרופיה של RV לכשל RV הנראית בחולים עם PAH¹⁷ כרוני.

במודל זה, הפתולוגיה של אי ספיקת RV כרונית מתפתחת תוך 3 שבועות לאחר הניתוח, מה שהופך אותו לאחד המודלים היעילים ביותר בזמן של כישלון RV כרוני⁶. מודלים אחרים של PTB מדווחים על משך מחקר של 1 עד 8 שבועות 17,18,33,34,35. ראינו סימנים של תפקוד לקוי של RV כבר שבוע לאחר הניתוח ב- sPTB. גישה חסכונית בזמן זו עם מעקב של 3 שבועות, עם זאת, מגיעה עם מגבלות. עכברים אינם גדלים במלואם בגיל 8 שבועות ומעקב ארוך יותר עלול לגרום להיצרות חמורה יותר ויותר של גזע הריאה ולאי ספיקת RV חמורה עוד יותר.

עכברים מהונדסים גנטית זמינים, וזנים מהונדסים גנטית חדשים יכולים להיווצר בעכברים במהירות יחסית וביעילות בזמן³⁶. זה מהווה יתרון גדול של מודלים PTB מורין בניגוד מודלים באמצעות חולדות או יונקים גדולים יותר.

לסיכום, אנו מציגים מודל מורין ניתן לשחזור של היפרטרופיה של RV כתוצאה מעומס יתר וכישלון בעכברים צעירים. פרוטוקולים מפורטים לאינטובציה, ניתוח ופנוטיפ על ידי אקוקרדיוגרפיה כלולים במאמר. מכשירים בהתאמה אישית משמשים לאינטובציה וניתוח, המאפשרים שכפול מהיר וזול של הדגם. המודל עשוי לשמש לזיהוי מנגנונים השולטים בהסתגלות הקרוואנים לעומס יתר של לחץ, כמו גם תהליכים העומדים בבסיס פתולוגיית הקרוואנים שבסופו של דבר מובילים לכשל RV. לבסוף, ניתן להשתמש במודל כדי לבחון מטרות טיפוליות חדשות לטיפול בכשל RV.

למחברים אין מה לחשוף.

עבודה זו נתמכה על ידי Snedkermester Sophus Jacobsen og Hustru Astrid Jacobsens Fond, Helge Peetz og Verner Peetz og hustru Vilma Peetz Legat, Grosserer A.V. Lykfeldt og Hustrus Legat. יתר על כן, המחברים מבקשים להודות לצוות מתקני בעלי החיים במחלקה לרפואה קלינית, אוניברסיטת ארהוס, על תמיכתם במהלך ביצוע העבודה הניסויית.