Un modèle murin d’hypertrophie ventriculaire droite induite par une surcharge de pression et d’échec par bande du tronc pulmonaire

Nous décrivons un modèle murin de surcharge de pression ventriculaire droite induite par l’anneau du tronc pulmonaire. Des protocoles détaillés pour l’intubation, la chirurgie et le phénotypage par échocardiographie sont inclus dans l’article. Des instruments sur mesure sont utilisés pour l’intubation et la chirurgie, ce qui permet une reproduction rapide et peu coûteuse du modèle.

L’insuffisance ventriculaire droite (VD) causée par une surcharge de pression est fortement associée à la morbidité et à la mortalité dans un certain nombre de maladies cardiovasculaires et pulmonaires. La pathogenèse de l’échec du rotavirus est complexe et reste mal comprise. Pour identifier de nouvelles stratégies thérapeutiques pour le traitement de l’échec du rotavirus, des modèles animaux robustes et reproductibles sont essentiels. Les modèles de cerclage du tronc pulmonaire (PTB) ont gagné en popularité, car la fonction du VD peut être évaluée indépendamment des changements dans le système vasculaire pulmonaire.

Dans cet article, nous présentons un modèle murin de surcharge de pression du VD induite par la PTB chez des souris âgées de 5 semaines. Le modèle peut être utilisé pour induire différents degrés de pathologie du rotavirus, allant d’une légère hypertrophie du rotavirus à une défaillance décompensée du rotavirus. Des protocoles détaillés pour l’intubation, la chirurgie PTB et le phénotypage par échocardiographie sont inclus dans l’article. De plus, des instructions pour personnaliser les instruments d’intubation et de chirurgie PTB sont données, ce qui permet une reproduction rapide et peu coûteuse du modèle PTB.

Des clips de ligature en titane ont été utilisés pour resserrer le tronc pulmonaire, assurant un degré de constriction du tronc pulmonaire hautement reproductible et indépendant de l’opérateur. La gravité de la PTB a été évaluée à l’aide de différents diamètres de clips de ligature intérieurs (légère : 450 μm et sévère : 250 μm). Cela a entraîné une pathologie du rotavirus allant de l’hypertrophie avec fonction du rotavirus préservée à l’échec décompensé du rotavirus avec réduction du débit cardiaque et manifestations extracardiaques. La fonction du rotavirus a été évaluée par échocardiographie à 1 semaine et 3 semaines après la chirurgie. Des exemples d’images et de résultats échocardiographiques sont présentés ici. De plus, les résultats du cathétérisme cardiaque droit et des analyses histologiques du tissu cardiaque sont présentés.

L’insuffisance ventriculaire droite (VD) est un syndrome clinique avec des symptômes d’insuffisance cardiaque et des signes de congestion systémique résultant d’un dysfonctionnement du VD¹. Le dysfonctionnement du rotavirus est fortement associé à la morbidité et à la mortalité dans un certain nombre de maladies cardiovasculaires et pulmonaires². L’étiologie du dysfonctionnement du rotavirus est complexe, et ses voies de signalisation et sa régulation sous-jacentes restent insuffisamment élucidées.

Les observations des thérapies actuelles montrent que l’amélioration de la fonction VD est étroitement corrélée à la réduction de la postcharge, suggérant que le système vasculaire pulmonaire est la cible principale du traitement³. Cela indique que les thérapies actuelles n’ont qu’un effet direct minime sur la fonction du rotavirus, qui peut se détériorer même après l’amélioration de la résistance vasculaire pulmonaire³. Des recherches supplémentaires sur l’amélioration de la fonction du VR indépendamment de la réduction de la postcharge sont donc hautement nécessaires.

Des modèles animaux robustes et reproductibles sont essentiels dans la recherche de nouveaux agents thérapeutiques. Dans la plupart des modèles d’échec chronique du rotavirus, la cause sous-jacente est l’hypertension pulmonaire induite par une altération structurelle du système vasculaire pulmonaire ^4,5,6. Les modèles bien caractérisés comprennent le modèle d’hypoxie chronique ^7,8, le modèle d’hypoxie de Sugen ^9,10,11 et le modèle monocrotaline^12,13. Étant donné que l’échec du VD est secondaire à l’hypertension pulmonaire dans ces modèles, il est impossible de différencier les effets des interventions sur le système vasculaire pulmonaire des effets directs sur le VD⁶.

Pour étudier le VD indépendamment du système vasculaire pulmonaire, le modèle de bande du tronc pulmonaire (PTB) a gagné en popularité et a été décrit chez plusieurs espèces animales, notamment les souris, les rats, les lapins, les chiens, les moutons et les porcs ^{6,14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,} 24,25,26,27. Dans les modèles PTB, la constriction du tronc pulmonaire est réalisée chirurgicalement, provoquant une augmentation de la pression RV⁶. Il existe différentes approches de l’application du PTB, y compris la constriction du vaisseau avec une ligature ou avec une pince de ligature métallique^18,28. Dans les modèles utilisant des ligatures, le tronc pulmonaire est attaché à une aiguille et l’aiguille est rétractée, laissant la ligature en place. Il en résulte une constriction du vaisseau qui dépend de la taille de l’aiguille et de la tension du nœud ^18,29. Dans les modèles utilisant des clips de ligature métalliques, le degré de constriction du tronc pulmonaire peut être plus reproductible. Des applicateurs de clips de ligature modifiés sont utilisés pour fermer les clips de ligature à un diamètre prédéfini et constant. Cela rend la méthode indépendante de l’opérateur et réduit la variabilité liée à la PTB dans le phénotype 15,27,28 de la maladie.

Il a été démontré que les modèles murins de PTB induisent une hypertrophie et une défaillance du rotavirus^18,28. L’un des principaux défis de l’utilisation du modèle PTB est de choisir le diamètre PTB approprié pour atteindre le degré souhaité de pathologie du rotavirus. Ceci est particulièrement difficile lorsque l’on tente de modéliser une défaillance décompensée du VR. Pour cela, la constriction doit être suffisamment serrée pour induire une insuffisance chronique du rotavirus sans entraîner une défaillance aiguë du rotavirus et la mort peu de temps après la chirurgie⁶. Une approche pour résoudre ce problème consiste à utiliser des animaux sevrés ou juvéniles ^6,15. Un modèle PTB a été utilisé avec succès pour étudier différents stades de défaillance du VD en utilisant des rats sevrés Wistar^15,30. Pour y parvenir, des rats juvéniles ayant un potentiel de croissance restant ont subi une chirurgie PTB avec l’application de clips de ligature en titane. Lorsque les rats ont grandi, la sténose pulmonaire s’est progressivement aggravée et a entraîné une hypertrophie du rotavirus ou une insuffisance chronique du rotavirus, en fonction de la gravité de la PTB^15,30. Inspirés par ce modèle, nous avons émis l’hypothèse que différents stades de la pathologie du rotavirus pourraient être produits dans un modèle murin de PTB utilisant des souris juvéniles. L’étude d’un large éventail de pathologies du rotavirus, allant d’une maladie légère à une maladie grave, pourrait aider à mieux comprendre la progression de la maladie et la transition de l’hypertrophie du rotavirus à l’échec du rotavirus.

Ici, nous présentons un modèle murin de surcharge de pression VD induite par la PTB chez des souris juvéniles. Avec ce modèle, différents degrés de pathologie du rotavirus peuvent être produits, allant de l’hypertrophie du rotavirus à l’échec décompensé du rotavirus. Cette étude comprend des protocoles détaillés pour l’intubation, la chirurgie PTB et le phénotypage par échocardiographie.

L’étude a été approuvée par l’Inspection danoise de l’expérimentation animale (numéro d’autorisation : 2021-15-0201-00928) et a été réalisée conformément à la législation nationale sur les animaux de laboratoire. Cette étude a utilisé des souris C57BL/6N mâles âgées de 5 semaines.

1. Personnalisation des instruments pour l’intubation et la chirurgie (Figure 1)

REMARQUE : Cette section détaille les étapes les plus importantes dans la préparation d’instruments sur mesure pour l’intubation et la chirurgie PTB à partir de matériaux peu coûteux et facilement disponibles.

1. Préparez la sonde endotrachéale (Figure 1A).
   Les cathéters intraveineux (IV) courants peuvent être utilisés pour l’intubation et la ventilation des souris.
   1. Choisissez la taille appropriée du cathéter intravasculaire correspondant à la taille des souris. Un cathéter 22G est recommandé pour les souris de 5 semaines (17-20 g) et un cathéter 23G pour les souris plus grosses (>20 g).
   2. Retirez l’aiguille et détachez le mécanisme de verrouillage. Réinsérez l’aiguille dans le cathéter et coupez la pointe de l’aiguille à un angle de 45°, à environ 2 mm de la pointe du cathéter.
   3. Utilisez du papier de verre pour émousser la pointe afin d’éviter de blesser les cordes vocales des souris.
   4. Coupez une aile du cathéter pour une meilleure vue pendant l’intubation.
2. Préparez l’écarteur thoracique (Figure 1B).
   1. À l’aide d’un porte-aiguille, pliez un morceau de fil métallique flexible d’environ 10 cm au milieu à un angle de 30°.
   2. Utilisez le porte-aiguille pour créer avec soin des crochets atraumatiques de 5 mm de large aux deux extrémités du fil.
3. Préparez le support d’intubation (Figure 1C).
   REMARQUE : L’utilisation d’un support d’intubation permet une administration continue de l’anesthésie via un tube nasal pendant l’intubation. Cela permet une intubation contrôlée et sûre sous guidage visuel, ce qui réduit le risque de blessure aux cordes vocales et à la trachée ainsi que le risque de mauvais positionnement du tube dans l’œsophage. N’importe quel cadre en métal ou en plastique peut être utilisé comme cadre pour le support d’intubation. Un porte-rôle de cuisine légèrement courbé a été utilisé dans cette étude.
   1. Découpez un morceau de tube en caoutchouc de 3 cm qui s’adapte au museau d’une souris et connectez-le à une valve de cathéter IV. L’anesthésie par inhalation peut être connectée via la valve avant l’intubation.
   2. Faites une boucle à l’aide d’une suture tressée 1-0 à environ 5 mm de l’ouverture du tube. Cela sera utilisé pour fixer le museau de la souris dans le tube.
   3. Découpez un trou près du haut d’une feuille de plastique flexible et placez le tube dans le trou. La feuille sert à soutenir la souris dans le support d’intubation.
   4. Utilisez du ruban adhésif pour maintenir les différentes pièces ensemble, comme illustré à la Figure 1C.
4. Préparez la canule de guidage (Figure 1D, E).
   1. Tirez une suture monofilament 6-0 à travers une canule émoussée de 27G et faites un nœud sur la suture. Utilisez ce nœud plus tard pour saisir la suture lors de la chirurgie PTB.
   2. À l’aide d’un porte-aiguille, pliez l’extrémité de la canule à un angle de 80°.
5. Préparez l’applicateur de clip de ligature.
   REMARQUE : Un applicateur de clip de ligature avec des mâchoires inclinées est modifié à l’aide d’un mécanisme d’arrêt réglable (Figure 1F), qui arrête la compression du clip de ligature lorsque les mâchoires se trouvent à une distance prédéterminée avec précision les unes des autres. L’applicateur de clip de ligature modifié est utilisé pour l’application de clips de ligature en titane sur le tronc pulmonaire.
   1. Fixez un morceau de laiton coupé sur mesure aux poignées de l’applicateur de clip de ligature à l’aide de deux vis. Montez une vis réglable au centre (Figure 1F, flèche blanche) qui détermine la distance exacte entre les poignées compressées de l’applicateur de clip de ligature, qui correspond à une distance précise entre les mâchoires.

Figure 1 : Instruments pour l’intubation et la chirurgie de la TBP. (A) Sonde endotrachéale fabriquée à partir d’un cathéter IV. (B) Écarteur thoracique. (C) Support d’intubation et souris placée dans le support d’intubation recevant une anesthésie sur un tube nasal. (D) Instruments chirurgicaux et applicateur de clip de ligature modifié utilisés pour la chirurgie PTB. (E) Canule de guidage. (F) Mécanisme d’arrêt réglable sur mesure. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

2. Réglage de l’applicateur de clip de ligature

1. Choisissez le diamètre interne du clip de ligature en fonction de la gravité souhaitée de la défaillance du VD. Pour les souris mâles C57BL/6N de 5 semaines (17-20 g), utilisez un diamètre de clip de 250 μm pour les surcharges sévères et de 450 μm pour les surcharges de pression RV légères. Utilisez des diamètres de clip intermédiaires pour induire une surcharge de pression modérée.
2. Utilisez du fil métallique ou des aiguilles pour ajuster l’applicateur de clip de ligature. Assurez-vous que le diamètre du fil correspond au diamètre de clip souhaité.
3. Chargez l’applicateur de clip avec un clip de ligature et placez le fil de réglage au centre du clip de ligature. Tout en comprimant l’applicateur de clip, tournez la vis jusqu’à ce que les mâchoires du clip s’emboîtent fermement autour du fil. Assurez-vous que le clip reste en place sur le fil de réglage une fois que l’applicateur de clip est relâché.
4. Avec l’applicateur de clip ajusté, placez un autre clip de ligature sur le fil de réglage pour valider le diamètre réglé.

3. Préparations à la chirurgie

1. Induire l’anesthésie dans une chambre d’induction en utilisant du sévoflurane à 7 % dans 0,6 L/min 100 % d’oxygène. Confirmez une anesthésie suffisante par pincement des orteils avant l’intubation.
   REMARQUE : L’isoflurane peut également être utilisé. Sachez que des concentrations différentes doivent être utilisées.
2. Intubez la souris avec un cathéter IV 22G. Effectuer l’intubation sous guidage visuel, à l’aide d’un microscope chirurgical et d’un support d’intubation, permettant un alignement correct pour la visualisation des cordes vocales et l’administration continue d’anesthésiques inhalés sur un tube nasal (figure 1C).
3. Aérer la souris à 175 coups/min et un volume courant de 300 μL/coup.
   REMARQUE : Des volumes courants de 8 à 10 μL/g sont également recommandés, et le volume courant idéal dépend des fuites possibles et de l’espace mort dans le système de ventilation.
4. Placez la souris intubée sur un coussin chauffant couvert (37 °C) et appliquez une pommade hydratante sur les yeux de la souris.
5. Maintenir l’anesthésie (3,5 % de sévoflurane dans 0,6 L/min, 100 % d’oxygène) et administrer 0,1 mg/kg de buprénorphine et 5 mg/kg de carprofène par voie sous-cutanée pour l’analgésie périopératoire. Retirez tous les poils de la poitrine à l’aide d’une crème dépilatoire et désinfectez la peau avec des lingettes désinfectantes.

4. Chirurgie PTB

1. Faites une incision de 10 mm dans la peau au-dessus du deuxième espace intercostal entre l’angle sternal et la ligne axillaire antérieure gauche. Fendre les muscles pectoraux majeurs et mineurs par dissection contondante.
2. Coupez les muscles intercostaux dans le deuxième espace intercostal et disséquez carrément le thymus pour exposer le cœur, le tronc pulmonaire et l’aorte. Placez un écarteur thoracique dans l’espace intercostal pour garder le champ opératoire accessible.
   REMARQUE : Une grande prudence doit être utilisée lors de la coupe des muscles intercostaux, car l’artère mammaire interne gauche ne passe que de 1 à 2 mm latéralement du sternum. Une blessure à cette artère peut entraîner une perte de sang importante.
3. Séparez le tronc pulmonaire de l’aorte ascendante en retirant brutalement le tissu conjonctif entre les vaisseaux à l’aide d’une pince microscopique. Améliorez davantage l’exposition du tronc pulmonaire en faisant pivoter le bas du corps de la souris (jambe gauche sur jambe droite).
4. Passez la canule de guidage à travers le sinus péricardique transversal postérieurement au tronc pulmonaire. À l’aide d’une pince, saisissez le nœud à l’extrémité de la canule de guidage et tirez la suture à travers la canule de guidage. Retirez soigneusement la canule de guidage pendant que la suture reste en place autour du tronc pulmonaire.
5. Chargez l’applicateur de clip de ligature et utilisez la suture pour guider le tronc pulmonaire dans les mâchoires du clip de ligature et comprimez le clip. Relâchez la suture immédiatement après la mise en place du clip et observez le remplissage du tronc pulmonaire.
   REMARQUE : Une bradycardie peut être observée dans les premières secondes après l’application du clip de ligature.
6. Placez une suture résorbable monofilament 6-0 autour des deuxième et troisième costae et fermez l’espace intercostal. Évacuez le plus d’air possible de la cavité thoracique en appliquant une légère pression sur la poitrine tout en resserrant la suture.
7. Enfin, suturez la peau avec une suture résorbable en monofilament 6-0.
8. Effectuez la même procédure, à l’exception de la mise en place du clip de ligature (étape 4.5), lors d’une chirurgie simulée.

5. Échocardiographie

1. Après l’induction de l’anesthésie dans une chambre d’induction (1 à 2 min, 6 % de sévoflurane dans 100 % d’oxygène), maintenez l’anesthésie à l’aide d’un tube nasal (3,5 % de sévoflurane dans 100 % d’oxygène). Retirez tous les poils de la poitrine et de l’abdomen à l’aide d’une crème dépilatoire et placez la souris sur un coussin chauffant. Appliquez une pommade hydratante sur les yeux et un gel à ultrasons sur la poitrine de la souris.
   REMARQUE : Ajustez le gain 2D, la profondeur de mise au point et la profondeur d’image pour améliorer la qualité de l’image dans toutes les mesures échocardiographiques.
2. Ajustez la sonde à ultrasons pour trouver la vue du grand axe parasternal (PLAX) (Figure 2). Dans PLAX, mesurez le diamètre intérieur du tronc pulmonaire et l’intégrale de vitesse dans le tronc pulmonaire.
   1. Sélectionnez le mode B et déplacez avec précaution le coussin chauffant sur les axes x, y et z pour identifier le tronc pulmonaire au centre de l’image. Utilisez la couleur pour identifier le plus grand diamètre du tronc pulmonaire. Utilisez cine store pour capturer une séquence de mesure du diamètre du tronc pulmonaire.
   2. Sélectionnez le Doppler de couleur et d’onde de pouls (PW) et placez le curseur au centre du tronc pulmonaire. Ajustez l’angle PW jusqu’à ce que les lignes pointillées soient parallèles au flux sanguin dans le vaisseau.
   3. Appuyez sur cine store pour mesurer le VTI. Placez le curseur près des deux parois du tronc pulmonaire et appuyez à nouveau sur cine store pour obtenir un écoulement près de la paroi du vaisseau.
      REMARQUE : Le diamètre intérieur du ventricule droit (RV) et l’épaisseur de la paroi libre RV peuvent également être évalués dans la vue PLAX.
3. Trouvez la vue parasternale sur l’axe court (PSAX) (Figure 3) pour mesurer les diamètres internes du ventricule gauche (VG), ce qui peut être utilisé pour évaluer le renflement septal (configuration D).
   1. Sélectionnez le mode B et tournez la sonde de 90° dans le sens inverse des aiguilles d’une montre. Inclinez la sonde de 20 à 30 degrés latéralement pour éviter l’ombre du RV par le sternum, et inclinez la sonde de 20 à 30 degrés vers le niveau crânien jusqu’à ce que le ventricule gauche soit aussi rond que possible. Ensuite, faites glisser la sonde dans la direction craniocaudale pour identifier le niveau des muscles papillaires avec les plus grands diamètres ventriculaires et appuyez sur cine store.
      REMARQUE : Le PSAX au niveau papillaire moyen peut également être utilisé pour évaluer la variation de la surface fractionnée du VD. Le PSAX au niveau de la valve aortique peut être utilisé pour mesurer le raccourcissement fractionné du RV ou l’épaisseur de la paroi libre du VD.
4. Utilisez la vue apicale à 4 chambres (A4CH) (Figure 4) pour mesurer l’excursion systolique du plan annulaire tricuspide (TAPSE) et évaluer la régurgitation tricuspide.
   1. Positionnez la sonde comme illustré à la Figure 4. Une fois le cœur identifié, faites de petits ajustements à la sonde en utilisant uniquement le poignet et les doigts pour identifier les quatre cavités du cœur et la valve tricuspide.
      1. Identifier et maintenir une bonne vue A4CH est un défi. Laissez la main qui actionne la sonde reposer sur le coussin chauffant pour plus de stabilité. Faites glisser, inclinez et tournez légèrement la sonde jusqu’à ce que l’image appropriée soit trouvée.
      2. Ne déplacez la sonde que d’une dimension à la fois : par exemple, faites glisser la sonde craniocaudale pour trouver le cœur, puis inclinez la sonde pour identifier les quatre cavités et enfin tournez la sonde jusqu’à ce que les quatre cavités et la valve tricuspide soient dans le cadre. Si nécessaire, répétez les trois étapes plusieurs fois avant d’obtenir l’image idéale.
   2. Une fois la valve tricuspide identifiée, sélectionnez le mode M et placez la ligne pointillée dans l’anneau tricuspide de la paroi libre. Appuyez sur cine store pour enregistrer les mesures.
   3. Sélectionnez la couleur pour évaluer la régurgitation de la valve tricuspide. En cas de régurgitation, un jet de flux rétrograde du VD vers l’oreillette droite (AR) sera observé dans la systole (Figure 5).
      REMARQUE : Dans la vue A4CH, le Doppler tissulaire dans la paroi libre du RV et la vitesse d’entrée du RV peuvent également être mesurés.

Figure 2 : Vue parasternale grand axe (PLAX). (A-D) Positionnement de la sonde à ultrasons. (E, F) Le cœur murin normal dans PLAX. (G, H) Dilatation et hypertrophie du VD après PTB. Abréviations : LV : ventricule gauche, RV : ventricule droit, PV : valve pulmonaire, PT : tronc pulmonaire, Ao : aorte. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 3 : Vue parasternale sur un petit axe (PSAX). (A-D) Positionnement de la sonde à ultrasons. (E, F) Le cœur murin normal dans PSAX. (G, H) PSAX après PTB. Abréviations : LV : ventricule gauche, RV : ventricule droit, PM : muscle papillaire. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 4 : Vue apicale à 4 chambres (A4CH). (A-D) Positionnement de la sonde à ultrasons. (E, F) Le cœur murin normal dans la vue A4CH. (G, H) Dilatation du VD et de la RA après PTB. Abréviations : VG : ventricule gauche, RV : ventricule droit, RA : oreillette droite, LA : oreillette gauche. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 5 : Régurgitation tricuspide visualisée par Doppler couleur dans la vue A4CH. (A) En diastole, l’écoulement du RA vers le RV est observé (flèche). (B) Pendant la systole, un mince jet d’écoulement du VD vers le RA est visible (flèche). Abréviations : VG : ventricule gauche, RV : ventricule droit, RA : oreillette droite, LA : oreillette gauche. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

6. Analyses de données

1. Mesurez le diamètre du tronc pulmonaire en trois cycles cardiaques dans PLAX et utilisez le diamètre moyen du tronc pulmonaire pour d’autres analyses de données. Mesurez l’ITV en trois cycles cardiaques dans PLAX pour chacune des trois boucles ciné stockées (au centre du tronc pulmonaire et près des parois du vaisseau). Utilisez la moyenne VTI de toutes les mesures VTI pour une analyse plus approfondie. Utilisez la formule suivante pour calculer le CO :
   
   : rayon du tronc pulmonaire, FC : fréquence cardiaque
2. Mesurer l’EIVG dans le PSAX au niveau mi-papillaire. À l’aide d’un outil de mesure, mesurez le plus grand diamètre intérieur du VG (LVid₁) du milieu du septum à la paroi libre. Ensuite, mesurez le diamètre intérieur du VG orthogonal à la première mesure (LVid₂). Répétez ces mesures sur trois cycles cardiaques et calculez l’EIVG à l’aide des diamètres intérieurs moyens du VG et de la formule suivante :
   
3. Mesurez le TAPSE en trois cycles cardiaques dans la vue A4CH et utilisez le TAPSE moyen pour des analyses de données plus approfondies.

7. Cathétérisme du cœur droit

1. Mesurez la pression et le volume ventriculaires droits (VD) par cathétérisme cardiaque droit avec un cathéter à micro-embout 1,4F 3 semaines après la chirurgie PTB.
2. Anesthésie et intrope la souris comme décrit aux étapes 3.1 à 3.4. Placez la souris sur un coussin chauffant couvert (37 °C) et maintenez l’anesthésie (3,5 % de sévoflurane dans 0,6 L/min, 100 % d’oxygène).
3. Administrer 2000 UI d’héparine (intramusculaire [i.m.]) et 0,5 mL de NaCl (sous-cutané [s.c.]).
4. À l’aide de ciseaux chirurgicaux, coupez la paroi abdominale juste caudalement à l’apophyse xiphoïde et accédez à la cavité thoracique en coupant soigneusement le diaphragme le long de son incision dans la paroi thoracique. Coupez le diaphragme et les côtes jusqu’à ce qu’un accès suffisant au cœur ait été obtenu.
5. Placez une ligature autour de la veine cave inférieure. Utilisez-le pour occlure le récipient afin de réduire la précharge pour l’enregistrement des mesures pression-volume plus tard dans le protocole.
6. Utilisez une aiguille 26G pour percer soigneusement un petit trou dans le VD. Assurez-vous qu’il est aussi près que possible de l’apex et que l’aiguille ne pénètre pas entièrement dans le ventricule, mais sert simplement de guide pour l’insertion du cathéter de conductance. En cas de saignement, appliquez une légère pression avec un petit coton-tige pour minimiser la perte de sang.
7. Identifiez le petit trou dans la paroi ventriculaire et insérez le cathéter en pénétrant dans le tissu.
   REMARQUE : Lors de l’insertion du cathéter, veillez à ne pas endommager la paroi ventriculaire interne.
8. Des changements de la pression ventriculaire droite (RVP) sont souvent observés pendant plusieurs minutes après l’insertion du cathéter. Attendez que la RVP se stabilise pour obtenir des mesures représentatives à l’état d’équilibre.
9. Pour obtenir des boucles pression-volume, utilisez la ligature préalablement placée autour de la veine cave inférieure. Tirez avec précaution sur la ligature pour obstruer le vaisseau, réduisant ainsi progressivement la précharge.
10. Une fois que les anses représentatives pression-volume ont été enregistrées, extrayez le cathéter et euthanasiez la souris par excision du cœur. À ce moment, prélevez des échantillons de sang et de tissus pour une analyse plus approfondie.

Des souris C57BL/6N (mâles, âgés de 5 semaines, 17-20 g) ont été randomisées pour recevoir soit une TBP sévère (sPTB, 250 μm, n = 12), soit une TBP légère (MBTm, 450 μm, n = 9), soit une chirurgie simulée (TBm, n = 15). L’évaluation de la fonction cardiaque a été réalisée par échocardiographie 1 semaine et 3 semaines après l’intervention. Un cathétérisme cardiaque droit suivi d’une euthanasie a été effectué 3 semaines après l’opération. Les organes ont été pesés et les tissus cardiaques ont été préparés pour les analyses histologiques.

L’échocardiographie 1 semaine après la chirurgie a révélé des signes de pression élevée et de dysfonctionnement du VD dans les groupes sPTB par rapport aux groupes mPTB et simulés. Le dysfonctionnement du VD était évident par une diminution du débit cardiaque (CO) et du TAPSE (figures 6A, B). Une diminution de l’indice d’excentricité ventriculaire gauche (LVEI) indiquait une augmentation de la pression VD (Figure 6C). Par conséquent, les interventions d’inversion peuvent être étudiées déjà après 1 semaine dans les modèles de PTB sévère. Le groupe mPTB a montré des signes échocardiographiques d’élévation de la pression VD par rapport à une pression simulée (diminution de la LVEI) après 1 semaine, mais aucun signe de dysfonctionnement du VD évalué par échocardiographie (Figure 6).

Figure 6 : Mesures échocardiographiques 1 semaine après l’intervention. (A) Débit cardiaque (CO). (B) Excursion systolique du plan annulaire tricuspide (TAPSE). (C) Indice d’excentricité ventriculaire gauche (EFVG). Abréviations : mPTB : anneau bénin du tronc pulmonaire (PTB) ; sPTB : PTB sévère. Les données sont présentées par des nuages de points avec des moyennes ± écart-type. *p < 0,05, **p < 0,001. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Après 3 semaines, les effets de la chirurgie PTB ont été accentués dans la sPTB avec une réduction supplémentaire du débit cardiaque et une diminution constante de la TAPSE par rapport à la simulation (Figure 7A,B). Aucune différence dans les paramètres échocardiographiques n’a été observée entre les groupes mPTB et simulé après 3 semaines (Figure 7A,B).

Le cathétérisme cardiaque droit a révélé une augmentation de la pression systolique VD (RVSP) dans les deux groupes PTB par rapport à un simulacre 3 semaines après la chirurgie (Figure 7C). La fonction diastolique du VD a été affectée dans le groupe sPTB, indiquée par une augmentation de l’élastance diastolique finale du VD (Eed), une mesure de la rigidité du VD indépendante de la charge (Figure 7D). La contractilité du rotavirus, évaluée par l’élastance systolique terminale (Ees), a également augmenté dans le groupe sPTB par rapport au groupe placebo, tandis que le groupe mPTB a montré une augmentation non significative (Figure 7E).

Les mesures anatomiques ont révélé une augmentation de l’hypertrophie du rotarynais avec une sévérité accrue de la TBP exprimée par une augmentation progressive du rapport poids du rotavirus/poids corporel (RV/PC) (figure 7F). La RVSP était linéairement proportionnelle au degré d’hypertrophie du rotavirus (figure 7G). La section transversale des cardiomyocytes du rotavirus a confirmé une augmentation de 40 % de l’hypertrophie du rotavirus dans le sPTB par rapport au placebo, tandis qu’il y avait une augmentation non significative du mPTB par rapport au placebo (Figure 8A-D). Le degré de fibrose dans le VD et l’oreillette droite (PR) était sept fois plus élevé dans le sPTB que dans le placebo. Aucune augmentation de la fibrose du rotavirus n’a été observée dans la tbm (Figure 8E-H).

Une régurgitation tricuspide (TR) a été observée chez 64 % des patients du groupe sPTB après 1 semaine et chez 91 % des patients à 3 semaines, alors qu’aucune régurgitation tricuspide n’a été observée dans les groupes placebo et mPTB (données non présentées). Des degrés variables de décoloration hépatique, signe de décompensation extracardiaque, ont été observés dans le groupe sPTB (Figure 9). Aucune décoloration n’a été observée dans les groupes mPTB et sham.

En résumé, nous montrons une corrélation entre le diamètre du bandeau et la gravité de la maladie. Le groupe mPTB imite un stade précoce de la maladie avec une légère hypertrophie du rotavirus sans dysfonctionnement du rotavirus, tandis que le groupe sPTB montre des signes de dysfonctionnement et d’échec du rotavirus.

Figure 7 : Mesures échocardiographiques, invasives, du volume de pression et anatomiques 3 semaines après l’opération. (A) Débit cardiaque (CO). (B) Excursion systolique du plan annulaire tricuspide (TAPSE). (C) Pression systolique ventriculaire droite (RVSP). (D) Élastance diastolique terminale (Eed). (E) Élastance terminale systolique (Ees). (F) Rapport entre le poids ventriculaire droit et le poids corporel (RV/PC). (G) Corrélation entre la pression systolique ventriculaire droite (RVSP) et le poids du VD/BW à 3 semaines après la chirurgie. Une analyse de régression linéaire a été effectuée et est présentée dans le graphique. R² ajusté = 0,75, p < 0,001. Abréviations : mPTB : anneau bénin du tronc pulmonaire (PTB) ; sPTB : PTB sévère. Les données normalement distribuées sont présentées par des nuages de points avec des moyennes ± écart-type. Les données non normalement distribuées sont présentées par des boîtes à moustaches avec des médianes avec IQR et avec des moustaches représentant des valeurs comprises entre 1,5 x IQR de Q1 et Q3, respectivement *p < 0,05, **p < 0,001. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 8 : Analyses histologiques du tissu du rotavirus. (A) Section transversale du rotavirus. (B-D) Tissu RV coloré par HE à partir de (B) sham, (C) mPTB et (D) sPTB. (E) Pourcentage de fibrose interstitielle par rapport aux tissus sains dans le rotavirus. (F-H) Tissu rotavirus coloré par Picrosirius à partir de (F) placebo, (G) mPTB et (H) sPTB. Barres d’échelle : (B-D) = 50 μm, (F-H) = 250 μm. Les données sont présentées par des boîtes à moustaches avec des médianes, des IQR et des moustaches représentant des valeurs comprises entre 1,5 x IQR et Q1 et Q3, respectivement. *p < 0,05, **p < 0,001. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 9 : Différents degrés de décoloration du foie. La décoloration a été notée de 0 à 3. La note était basée sur le degré d’apparence mouchetée et la couleur du tissu hépatique. Les images ont été prises au microscope, ce qui a rendu les tissus plus légers qu’à l’éclairage ambiant. (A) 0 : foie normal. (B) 1 : Légères taches sans décoloration. (C) 2 : mouchetures modérées et légère décoloration. (D) 3 : Taches sévères et décoloration (foie de noix de muscade). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Dans cet article, nous présentons un modèle murin d’hypertrophie et d’échec du VD induit par une surcharge de pression. Nous démontrons que : (i) la PTB chez les souris juvéniles peut induire divers degrés de pathologie du rotavirus, allant d’une légère hypertrophie du rotavirus à une défaillance du rotavirus avec des signes extracardiaques de décompensation et une fibrose du rotavirus histologiquement confirmée. (ii) Les signes de dysfonctionnement du VD peuvent être observés et quantifiés par échocardiographie à 1 et 3 semaines après la chirurgie PTB. (iii) Le degré d’hypertrophie du VD est proportionnel à la gravité du PTB et à l’augmentation de la pression du VD qui en résulte. Ce modèle peut aider à élucider la pathogenèse de l’échec du VD secondaire à la surcharge de pression du VD, car nous montrons que le modèle PTB est adapté à l’étude des différents stades de la pathologie du VD.

Pour garantir le succès et la reproductibilité du modèle PTB murin, une grande attention doit être accordée aux étapes suivantes. (i) Choisir le diamètre approprié du clip de ligature. Le bon diamètre de clip dépend de plusieurs facteurs, tels que le degré souhaité de surcharge de pression RV et le temps de suivi. L’âge et le poids corporel des souris sont également des facteurs importants à prendre en compte. En conséquence, le protocole peut être adapté en fonction de la question scientifique actuelle. Pour cette raison, nous recommandons d’effectuer des chirurgies pilotes et une échocardiographie à des moments pertinents après l’opération afin d’évaluer l’adéquation des diamètres de clip sélectionnés. (ii) Un réglage précis de l’applicateur de clip est essentiel pour garantir une pathologie reproductible. Nous recommandons d’utiliser du fil métallique ou des canules d’un diamètre extérieur bien défini comme guide pour ajuster l’applicateur de clip de ligature. (iii) La perte de sang était la complication grave la plus fréquente lors de la chirurgie PTB et la cause la plus fréquente de mortalité périopératoire et postopératoire. Pour limiter la perte de sang, utilisez des instruments microchirurgicaux émoussés et une dissection contondante dans la mesure du possible. N’utilisez des ciseaux chirurgicaux que lorsque cela est indiqué dans le protocole. (iv) Une autre cause de mortalité périopératoire est l’arythmie cardiaque. De courts épisodes de bradycardie peuvent survenir lors de la dissection du tronc pulmonaire et de l’application de la pince de ligature. Pour réduire le risque d’arrêt cardiaque, le temps de manipulation du tronc pulmonaire doit être limité. Lorsqu’une bradycardie est observée, interrompre la manipulation du tronc pulmonaire jusqu’à ce que la fréquence cardiaque se soit normalisée. (v) L’évaluation échocardiographique reproductible peut être difficile et nécessite une formation avant d’obtenir des résultats reproductibles. En raison de la petite taille du VR, il est particulièrement difficile d’obtenir une bonne visualisation du VR chez des souris exploitées par placebo en vue PLAX et A4CH. (vi) La fréquence cardiaque peut varier considérablement lors de l’évaluation échocardiographique. Pour réduire la variabilité, surveillez de près la fréquence cardiaque et utilisez de faibles doses d’anesthésie tout en veillant à ce qu’une anesthésie suffisante soit suffisante.

L’une des limites du modèle murin de PTB est la nécessité d’équipement chirurgical et de formation. Les chirurgies pilotes doivent toujours être effectuées pour la formation, et les méthodes doivent être adaptées à l’équipement disponible localement. Nous avons utilisé des clips de ligature en titane, qui se sont avérés être une méthode hautement reproductible pour l’induction de la surcharge de pression RV¹⁵. De plus, il a été démontré que l’utilisation de clips de ligature entraîne une mortalité périchirurgicale plus faible et une meilleure récupération postopératoire par rapport aux ligatures chirurgicales³¹.

L’échocardiographie pour l’évaluation de la fonction VD présente certaines limites, car elle dépend de l’opérateur, et la variabilité inter- et intra-opérateur peut influencer les résultats de l’échocardiographie. Dans la présente étude, l’échocardiographie a été réalisée par deux opérateurs. Pour éviter les biais dus à la variation interobservateur, les deux opérateurs ont effectué une échocardiographie sur un nombre égal de souris de tous les groupes. De plus, l’échocardiographie chez la souris présente des défis. Cela est particulièrement vrai chez les souris de petite taille et relativement en bonne santé, comme en témoigne la plus grande variation des mesures de CO et de TAPSE à 1 semaine (figure 5) par rapport à 3 semaines (figure 6). Pour obtenir une mesure plus précise du CO, l’ITV dans le tronc pulmonaire a été mesurée en trois cycles cardiaques à trois endroits différents (au centre du tronc pulmonaire et près des parois du vaisseau). De plus, il a été démontré que l’échocardiographie surestime le CO par rapport à l’IRM chez les rats soumis à la PTB³². L’IRM est l’étalon-or pour mesurer le CO chez la souris et peut donc être prise en compte lors de l’utilisation du modèle³² actuel. Un autre défi chez les souris avec peu ou pas d’élévation de la pression du RV est la petite taille du RV, ce qui complique une bonne vue A4CH pour mesurer, par exemple, TAPSE. Cela peut entraîner une sous-estimation de la TAPSE chez certaines souris des groupes placebo et mPTB. Malgré ces défis, des résultats statistiquement significatifs ont été obtenus pour le CO et le TAPSE dans le sPTB par rapport au smock et au mPTB. Cela montre que le CO et le TAPSE sont des marqueurs utiles de la fonction du VD dans le modèle actuel, mais souligne également la nécessité d’une formation approfondie des chercheurs avant l’évaluation échocardiographique des souris.

Une limitation inhérente à tous les modèles animaux est que les résultats ne peuvent pas être directement extrapolés aux humains en raison de différences génétiques et physiologiques.

À notre connaissance, il s’agit du seul modèle PTB chez les souris juvéniles. Cette approche a été utilisée chez les rats, où une augmentation progressive et lente de la postcharge se développe à mesure que les rats grandissent. Cette induction plus lente de la maladie imite mieux le développement de l’échec chronique du^rotavirus15.

Le protocole actuel comprend deux groupes distincts de souris présentant différents degrés de dysfonctionnement du VD. À notre connaissance, aucun autre modèle murin de PTB publié n’inclut un groupe présentant seulement une légère hypertrophie du rotavirus sans signes de dysfonctionnement du rotavirus, de déficience hémodynamique ou de fibrose. Ce stade précoce de la maladie est donc largement négligé. L’étude de ce stade précoce du développement de la maladie pourrait améliorer notre compréhension de la progression progressive de l’hypertrophie du rotavirus à l’échec du rotavirus observée chez les patients atteints d’HTAP^{chronique 17}.

Dans ce modèle, la pathologie de l’insuffisance chronique du rotavirus se développe dans les 3 semaines suivant la chirurgie, ce qui en fait l’un des modèles les plus rapides d’insuffisance chronique du rotavirus⁶. D’autres modèles murins de PTB rapportent des durées d’étude de 1 à 8 semaines 17,18,33,34,35. Nous avons observé des signes de dysfonctionnement du VD déjà 1 semaine après l’intervention dans le sPTB. Cette approche rapide avec un suivi de 3 semaines s’accompagne toutefois de limites. Les souris ne sont pas complètement développées à 8 semaines et un suivi plus long pourrait entraîner une sténose pulmonaire du tronc de plus en plus grave et une défaillance encore plus grave du rotavirus.

Les souris génétiquement modifiées sont facilement disponibles, et de nouvelles souches génétiquement modifiées peuvent être produites chez les souris relativement rapidement^{et rapidement.} Cela constitue un avantage majeur des modèles murins PTB par rapport aux modèles utilisant des rats ou des mammifères plus grands.

En conclusion, nous présentons un modèle murin reproductible d’hypertrophie et d’échec du VD induit par la surcharge de pression chez des souris juvéniles. Des protocoles détaillés pour l’intubation, la chirurgie et le phénotypage par échocardiographie sont inclus dans l’article. Des instruments sur mesure sont utilisés pour l’intubation et la chirurgie, ce qui permet une reproduction rapide et peu coûteuse du modèle. Le modèle peut être utilisé pour identifier les mécanismes qui régissent l’adaptation du VD à la surcharge de pression, ainsi que les processus sous-jacents à la pathologie du VD aboutissant finalement à l’échec du VD. Enfin, le modèle peut être utilisé pour tester de nouvelles cibles thérapeutiques pour le traitement de l’échec du rotavirus.

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Ce travail a été soutenu par Snedkermester, Sophus Jacobsen og Hustru, Astrid Jacobsens Fond, Helge Peetz og Verner, Peetz og hustru, Vilma Peetz Legat, Grosserer A.V. Lykfeldt og Hustrus Legat. En outre, les auteurs tiennent à remercier le personnel des animaleries du Département de médecine clinique de l’Université d’Aarhus pour leur soutien lors de l’exécution des travaux expérimentaux.