הפלת FAM83A כדי לאמת את תפקידו בצמיחת תאי סרטן צוואר הרחם וברגישות לציספלטין

כאן, אנו מציגים את ההליכים עבור FAM83A knockdown; הבדיקות לאיתור השפעותיו על התפשטות, הגירה ופלישה של תאי סרטן צוואר הרחם; ואת הרגישות של תאים אלה כדי cisplatin. מחקר זה מספק גן מטרה מבטיח לסרטן צוואר הרחם והפניה למחקר תרופתי נוסף.

חקר גני המטרה של הגידול הוא בעל חשיבות עליונה למניעה וטיפול בסרטן צוואר הרחם. במחקר זה, אנו מתארים את השלבים הכרוכים בזיהוי גן מטרה לגידול FAM83A בסרטן צוואר הרחם. ראשית, מערך הנתונים של אטלס גנום הסרטן שימש כדי לאמת את הביטוי ואת המשמעות הפרוגנוסטית של FAM83A אצל נשים. RNA מפריע קטן (siRNA) שימש להפלה של הגן FAM83A בתאי HeLa ו-C33a . לאחר מכן, 5-ethynyl-2'-deoxyuridine (EdU) צביעה בוצעה כדי לקבוע את ההשפעות על יכולות ההתרבות של תאי הגידול. ריפוי פצעים ובדיקות החדרת קרום נקבובי בוצעו כדי להעריך את נדידת תאי הגידול ואת יכולות הפלישה.

כתם מערבי שימש לכימות רמות חלבון הקשורות לאפופטוזיס. צביעת JC-1 שימשה להערכת שינויים בתפקוד המיטוכונדריה. יתר על כן, נעשה שימוש בהתערבות cisplatin (diaminedichloroplatinum, DDP) כדי להעריך את הפוטנציאל הטיפולי של גן המטרה. בדיקות ציטומטריית זרימה והיווצרות מושבה נערכו כדי לאמת עוד יותר את המאפיינים האנטי-סרטניים של הגן. כתוצאה מכך, הוכח כי FAM83A מעכב התפשטות, נדידה ופלישה של תאי סרטן צוואר הרחם וגורם לרגישות תאים אלה לציספלטין. מתודולוגיות מקיפות אלה מאמתות באופן קולקטיבי את FAM83A כגן מטרה הקשור לגידול, וטומנות בחובן הבטחה כיעד טיפולי פוטנציאלי במניעה ובטיפול בסרטן צוואר הרחם.

סרטן צוואר הרחם הוא דאגה עולמית מכיוון שהוא אחד הסוגים המובילים של ממאירות גינקולוגית בעולם והוא הגורם העיקרי לתמותה הקשורה לסרטן בקרב נשים¹. ניתוחים רדיקליים וכימותרפיה קשורים לשיעורי ריפוי גבוהים בשלב הראשוני. עם זאת, תוצאות הטיפול בחולות בשלב מתקדם של סרטן צוואר הרחם המפתחות מחלה גרורתית הן שליליות מאוד². לכן, חיוני להבין עוד יותר את המנגנונים הביולוגיים העומדים בבסיס ההגירה והפלישה של תאי סרטן צוואר הרחם ולזהות מטרות טיפוליות פוטנציאליות למניעה וטיפול במחלה זו.

זיהוי גני מטרה המעורבים בהתקדמות הסרטן ומציאת דרכים לעכב את ביטוים או פעולתם מציגים אפשרויות טיפול מבטיחות. במחקר זה זיהינו את FAM83 כגן הגורם לסרטן וחקרנו עוד יותר את ההשפעות המעכבות שלו על תאי C33a ו-HeLa. אונקוגנים ממשפחת FAM83 (FAM83A-H) מדווחים באופן נרחב בסרטן אנושי ^3,4. לאחרונה דווח כי FAM83A מווסת בסרטן ריאות⁵, שד⁶, שחלות⁷ ולבלב⁸, דבר המצביע על כך ש-FAM83A ממלא תפקיד חשוב בהתקדמות הסרטן באמצעות קידום התפשטות, פלישה, תכונות דמויות תאי גזע ועמידות לתרופות בתאי הגידול. חשוב לציין כי FAM83A זוהה כאחד הגנים המועמדים החדשים הקשורים להתקדמות נגע צוואר הרחם ולסרטן⁹. למרות האישור של ביטוי מוגבר של FAM83A בתאי סרטן צוואר הרחם האנושיים, ההשפעה הספציפית והמנגנונים הבסיסיים של FAM83A בסרטן צוואר הרחם עדיין אינם ברורים.

במחקר זה, אנו מתארים את הפרוטוקולים המעורבים בזיהוי FAM83A כגן מטרה לגידול בסרטן צוואר הרחם ומשתמשים ב- RNA מפריע קטן (siRNA) להפלת הגן FAM83A בתאי HeLa ו - C33a . צביעת 5-Ethynyl-2'-deoxyuridine (EdU) בוצעה כדי לקבוע את ההשפעות על התפשטות תאי הגידול, בעוד ריפוי פצעים ובדיקות החדרת קרום נקבובי סייעו להעריך נדידת תאי גידול ויכולות פלישה.

הקרישה המערבית בוצעה כדי לקבוע את רמות החלבונים הקשורים לאפופטוזיס, וצביעה של JC-1 שימשה להערכת שינויים בתפקוד המיטוכונדריה. לפיכך, דיווחנו כי FAM83A ממלא תפקיד קריטי בהתרבות תאים, גרורות ופלישה בסרטן צוואר הרחם. באמצעות הפרעות בתפקוד המיטוכונדריאלי הקשור למסלול PI3K/AKT ואפופטוזיס, FAM83A הפיל תאי סרטן צוואר הרחם רגישים לציספלטין (diaminedichloroplatinum, DDP). מחקר זה מספק יעד חדש לסרטן צוואר הרחם ואולי לסוגי סרטן אחרים והתייחסות לפיתוח אסטרטגיות להתגבר על עמידות תאי סרטן לתרופות כימותרפיות מסוימות.

המחקר תאם לחלוטין את הנחיות הפרסום שסופקו על ידי TCGA (https://cancergenome.nih.gov/publications/publicationguidelines). עיין בטבלת החומרים לקבלת פרטים הקשורים לכל החומרים, הריאגנטים והמכשירים המשמשים בפרוטוקול זה.

1. ניתוח מקורות נתונים וביואינפורמטיקה

1. קבל נתוני ריצוף RNA ממסד הנתונים של אטלס גנום הסרטן (TCGA) (https://cancergenome.nih.gov) לצורך ניתוח אשכולות. השתמש ב- GEPIA (http://gepia.cancer-pku.cn/), כלי מבוסס אינטרנט כדי לחשב מחדש נתוני RNA-Seq גולמיים של דגימות מפרויקטים של TCGA, כדי לסנן מטרות לתרופות מועמדות לסרטן עם צינור עיבוד סטנדרטי.
   הערה: אתר האינטרנט של GEPIA זמין באופן חופשי לכל המשתמשים.
2. גש לדף הבית של אתר GEPIA ולחץ על ניתוח סוג סרטן, בחר באפשרות ניתוח גנים דיפרנציאלי והגדר את הפרמטרים הבאים: שם סרטן = CESE (מוגדר כקרצינומה של תאי קשקש צוואר הרחם ואדנוקרצינומה אנדוצרביקלית בדף זה), |Log2FC| חיתוך = 1, חיתוך ערך q = 0.01, שיטות דיפרנציאליות = ANOVA, והתפלגות כרומוזומלית = שניהם. לאחר מכן, לחץ על רשימה כדי לקבל רשימת גנים המראה ביטוי דיפרנציאלי בין הגידול לקבוצות נורמליות.
   הערה: זה דורש סקירת ספרות מקיפה כדי לזהות גנים מועמדים המבוטאים באופן דיפרנציאלי. במחקר זה, בהתחשב ברקע מהספרות הזמינה, אנו מתמקדים בגן הגידול המעניין, FAM83A.
3. לאחר מכן, בדוק את הביטוי של FAM83A בסרטן צוואר הרחם וברקמות נורמליות באמצעות GEPIA על ידי המשך לאפשרות ביטוי DIY באתר ובחר Boxplot כסוג התרשים. הזן FAM83A בשדה פרמטר הגן והגדר את הפרמטרים הבאים: |Log2FC| ערך חיתוך = 1; q-value Cutoff = 0.01. בחר CESE כשם הסרטן והתאם נתונים רגילים של TCGA עבור שדה הנתונים Matched Normal , תוך השארת כל ההגדרות האחרות כברירת מחדל. לחץ על Plot ואפשר לאתר ליצור boxplot המייצג את הביטוי הדיפרנציאלי של הגן FAM83A ; שמור את boxplot לעיון וניתוח עתידיים.
4. לבסוף, לנתח את ההישרדות הכוללת של חולים הנושאים גידולים עם רמות שונות של ביטוי FAM83A בסרטן צוואר הרחם. נווט אל האפשרות חלקות הישרדות באתר, הגדר את הגן ל- FAM83A ובחר הישרדות כוללת כסוג הניתוח. הוסף את שם הגידול CESE, בחר חודשים עבור יחידות הציר והשאר את כל שאר הפרמטרים בהגדרות ברירת המחדל שלהם. לחץ על התוויית אתר האינטרנט ותן לאתר ליצור תרשים עקומת הישרדות; שמור תרשים זה לעיון וניתוח עתידיים.
5. יש לקחת בחשבון הן את הביטוי הדיפרנציאלי של FAM83A בגידולים והן את הקשר שלו עם ניתוח הישרדות המטופל כדי לזהות את FAM83A כגן מטרה טיפולי פוטנציאלי בסרטן צוואר הרחם.

2. ניסויים מבוססי תאים

1. תרבית תאים
   1. תרבית שורות תאי גידול אנושיים בתווך שונה ב 37 ° C באטמוספירה לחה 5% CO₂ .
      הערה: עיין בטבלת החומרים לקבלת מידע על קווי תאים ורכיבי מדיום תרבית.
2. טרנספקציה של תאים
   1. השתמש ב- siRNA כדי להפיל ביטוי FAM83A בתאים.
      הערה: ראה טבלה 1 עבור רצף siRNA ספציפי.
   2. תאי זרעים בצלחות 6 בארות ודגרים עם תערובת של 50 ננומטר si-FAM83A או siRNA-NC ו 8 μL של סוכן transfection או רק 8 μL של סוכן transfection במשך 4-6 שעות לאחר השגת 50%-70% מפגש. הוסף DMEM ללא סרום בלבד לבקרה השלילית.
   3. לאחר הדגירה, להחליף את המדיום המכיל את סוכן transfection עם DMEM + 10% סרום עגל העובר. יתר על כן, 48 שעות לאחר טרנספקציה, לטפל עם 5 מיקרומטר cisplatin (DDP) במשך 24 שעות כמתוכנן ולקצור את כל התאים עבור מיצוי RNA הכולל ניתוח qRT-PCR.

3. זיהוי EdU לבדיקת התפשטות תאים

הערה: השתמש בערכת התפשטות תאי EdU כדי להעריך את התפשטות התאים במבחנה בהתאם להוראות היצרן.

1. זרעו את התאים בצלחות 6 בארות ודגרו עליהם בתמיסת EdU של 10 מיקרומטר למשך שעתיים. תקן את התאים עם 4% paraformaldehyde במשך 15 דקות בטמפרטורת החדר (RT) וחדיר עם 0.3% Triton X-100 ב- PBS למשך 10 דקות ב- RT.
2. הסר את מאגר החדירות והוסף 500 μL של תמיסת תגובה 1x. לאחר מכן, לדגור במשך 30 דקות ב RT בחושך עבור צביעה גרעינית.
3. לצבוע תאים עם 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) ולדמיין אותם תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי בהגדלה 200x. הכתימו את גרעיני התאים המתרבים עם EdU ובדקו אותם לפלואורסצנטיות אדומה.
4. לבסוף, השתמש בתוכנה כדי לכמת את התוצאות על ידי ספירת לפחות 10 שדות אקראיים ולחשב את שיעורי ההתפשטות באמצעות היחס בין התאים החיוביים הפלואורסצנטיים לסך התאים.

4. בדיקת ריפוי פצעים

1. תאי זרע בצלחות 6 בארות בצפיפות של 2 × 10⁵ תאים לכל באר.
2. כאשר התאים מגיעים למפגש של 90%, השתמשו בקצה מיקרופיפטה סטרילי של 10 μL כדי ליצור בעדינות שריטה ליניארית בשכבה האחידה של התא. שטפו בעדינות את הבארות עם PBS סטרילי כדי להסיר תאים מנותקים ופסולת הנגרמת על ידי שריטה.
3. יתר על כן, לדגור את התאים בתווך המכיל 1% FBS. לאחר מכן, התבוננו וצלמו עם המיקרוסקופ ההפוך לריפוי האזור הפגוע ב-12, 24 ו-48 שעות.

5. בדיקת הוספת קרום נקבובי

1. הכינו תרחיף תאים בתווך תרבית תאים בריכוז התאים הרצוי (המכיל 4 × 10⁴ תאים), כולל תאי C33a נגועים או בקרה ו - HeLa. הוסף את מתלה התא לתא העליון של תוספות הממברנה, הבטחת חלוקה אחידה. הוסף מדיום שלם לתא התחתון.
2. לאחר הדגירה במשך 24 שעות, השתמש באלכוהול מתיל ו 0.1% סגול גבישי עבור קיבוע והכתמה של התאים הנודדים לחדרים התחתונים, בהתאמה.
3. השתמש במיקרוסקופ הפוך כדי לצלם תמונות ולאחר מכן נתח את מספר התאים הנודדים על-ידי ספירת לפחות 10 שדות אקראיים באמצעות ImageJ.
   1. לניתוח מספרים עם ImageJ, פתח את התמונה בתוכנת ImageJ, עבור אל הכרטיסייה תמונה בתפריט הכלי, בחר התאמה ולאחר מכן לחץ על סף. התאם את הגדרות הסף, במידת הצורך, עד שרק התאים יהיו גלויים על רקע לבן.
   2. לחץ על החל בחלון סף כדי להחיל הגדרות אלה על התמונה. כעת, בחר בכלי שרביט (מעקב) מסרגל הכלים (הממוקם בחלק העליון של החלון).
   3. לחץ על האזור בתמונה שבו ממוקמים התאים כדי לבחור את כל התאים בתמונת הסף. לאחר שהתאים מודגשים, עבור אל נתח בתפריט כלי ולאחר מכן, לחץ על נתח חלקיקים. בחלון ניתוח חלקיקים, הזן את הגודל הרצוי (לדוגמה, 0 - אינסוף) ואת ערכי המעגליות (לדוגמה, 0.00 - 1.00) בהתאם לדרישות הניסוי כדי לכלול את כל התאים בספירה.
   4. לחץ על אישור והמתן עד שהתוכנה תספור את התאים ויופיע חלון חדש עם תוצאות הניתוח.

6. בדיקת היווצרות מושבה

1. זרעים 2 × 10⁵ תאים לכל באר של קבוצות Si-NC ו- Si-FAM83A בצלחת 6 בארות עם או בלי טיפול 5 מיקרומטר ציספלטין (DDP) במשך 24 שעות.
2. לאחר תקופה של 24 שעות של טיפול תרופתי, נתק את התאים באמצעות 0.25% טריפסין והשהה אותם מחדש בתווך הנשר המעובד של דולבקו (DMEM) המכיל 10% FBS. זרעו את התאים המרחפים מחדש בצלחת 6 בארות בצפיפות של 1 × 10³ תאים לכל באר, ולאחר מכן לדגור באינקובטור 5% CO₂ בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס.
3. לאחר הדגירה במשך ~7-10 ימים כאשר המושבות גלויות, לתקן את התאים עם 4% Polyoxymethylene ולהכתים אותם עם תמיסת צביעה Giemsa במשך 20 דקות.
4. שטפו מעט את התאים ותנו לצלחות להתייבש באוויר. צלמו את צבירי המושבה במיקרוסקופ וספרו את מספר המושבות המכילות יותר מ-50 תאים.

7. ניתוח דפולריזציה של קרום מיטוכונדריאלי (MMP) באמצעות צבע JC-1

1. זרע 1.2 × 10⁶ תאי גידול מקבוצות Si-NC ו- Si-FAM83A לצלחת שש בארות ותרבית למשך 24 שעות עם או בלי טיפול של 5 מיקרומטר ציספלטין (DDP).
2. יש לדגור עם תמיסת צביעה JC-1 אחת למשך 15-20 דקות תחת 5% CO₂ ב-37°C באמצעות ערכת בדיקת פוטנציאל קרום מיטוכונדריאלי בהתאם להוראות היצרן.
3. שטפו את התאים ובחנו אותם תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי בהגדלה של פי 200 באמצעות אורכי גל עירור ופליטה עבור JC-1 ב~490 ננומטר ו-590 ננומטר, בהתאמה. כדי להמחיש את הפלואורסצנטיות של JC-1, השתמש במסננים מתאימים, כגון מסנן עירור כחול (450-490 ננומטר) ומסנן פליטה אדום (מעבר ארוך > 590 ננומטר) כדי ללכוד באופן סלקטיבי את האות הפלואורסצנטי הנפלט.

8. ניתוח ציטומטרי זרימה של mPTP

1. זרע 1.2 × 10⁶ תאי גידול מקבוצות Si-NC ו- Si-FAM83A לצלחת שש בארות ותרבית למשך 24 שעות עם או בלי טיפול של 5 מיקרומטר ציספלטין (DDP).
2. הסר את מדיום התרבית מהתאים, השעה מחדש את התאים ב- PBS, והוסף 300 μL כל אחד (נפח 1x) של תמיסת צביעת AM Calcein ותמיסת עבודה מרווה פלואורסצנטית כדי לכסות את התאים באופן שווה. לדגור את התאים ב 37 ° C בסביבה מוגנת אור במשך 30-45 דקות, ולהחליף את המדיום עם מדיום תרבית טרי שחומם מראש ב 37 ° C. לדגור על התאים ב 37 ° C בסביבה מוגנת אור במשך 30 דקות נוספות כדי להבטיח הידרוליזה מלאה של Calcein AM על ידי אסטרזות תאיות, וכתוצאה מכך הדור של קלצאין ירוק-פלואורסצנטי תוך תאי.
3. הסר את מדיום התרבית, שטוף את התאים 2-3x עם PBS, והוסף מאגר זיהוי. זהה mPTP של תאים באמצעות ציטומטריית זרימה ואורך גל עירור של 488 ננומטר.

9. ציטומטריית זרימה

1. זרע 1.2 × 10⁶ תאי גידול מקבוצות Si-NC ו- Si-FAM83A לצלחת שש בארות ותרבית למשך 24 שעות עם או בלי טיפול של 5 מיקרומטר ציספלטין (DDP).
2. לאחר 24 שעות של טיפול תרופתי, יש להשהות מחדש את התאים ב-200 μL של תמיסת חיץ קושרת ולערבב בעדינות 10 μL של Annexin V-FITC ו-5 μL של propidium iodide (PI) לתוך תרחיף התא. דוגרים על התערובת במשך 15 דקות תוך הימנעות מאור ומוסיפים 300 מיקרוליטר של תמיסת חיץ קושרת לתאים. זיהוי אפופטוזיס של תאים באמצעות ציטומטריית זרימה באורך גל עירור של 488 ננומטר.

10. ניתוח RT-PCR

1. זרע 1.2 × 10⁶ תאי גידול מקבוצות Si-NC ו- Si-FAM83A לצלחת שש בארות ותרבית למשך 24 שעות עם או בלי טיפול של 5 מיקרומטר ציספלטין (DDP).
2. חלץ את סך הרנ"א מתאי הגידול באמצעות מגיב מיצוי RNA והמיר את הרנ"א המופק לדנ"א משלים (cDNA) עם תערובת סינתזת cDNA על ידי דגירה ב 42 ° C במשך 45 דקות ולאחר מכן ב 95 ° C במשך 5 דקות.
3. הכינו את תערובת תגובת ה-PCR המכילה DNA פולימראז, נוקלאוטידים, חיץ ואת הפריימרים הספציפיים לגן המתוכננים. הוסף את תבנית cDNA לתערובת התגובה עבור תגובת PCR בזמן אמת ובצע PCR במכשיר PCR כמותי בזמן אמת עם התנאים התרמו-מחזוריים הבאים: דנטורציה ב- 95 ° C למשך 30 שניות, ואחריה 40 מחזורים של 95 ° C עבור 5 שניות ו- 60 ° C במשך 30 שניות, ושלב עקומת ההתכה ב- 95 ° C למשך 15 שניות, 60°C למשך דקה אחת, ו-95°C למשך 15 שניות. כמת את רמות ה-mRNA בשיטת ^2-ΔΔCq באמצעות GAPDH כבקרה פנימית.
   הערה: מערכת התגובה RT-PCR מוצגת בטבלה 1, ורצפי הפריימר מוצגים בטבלה 1.
   1. כדי לחשב את הערך 2^−ΔΔCq , מדדו את ערכי Cq עבור גן המטרה וגן הייחוס (GAPDH) בדגימות. חשב את ה- ΔCq על ידי הפחתת ערך Cq של גן הייחוס מערך Cq של גן היעד עבור כל דגימה. חשב את ה- ΔΔCq על ידי הפחתת ה- ΔCq של דגימת בקרה מה- ΔCq של כל דגימת ניסוי. לבסוף, חשב את הערך 2^−ΔΔCq על ידי העלאת 2 בחזקת הערך ΔΔCq.
      הערה: ערך Cq מייצג את מספר המחזור שבו האות הפלואורסצנטי מגיע לסף שנקבע.

11. ניתוח כתמים מערביים

1. זרע 1.2 × 10⁶ תאי גידול מקבוצות Si-NC ו- Si-FAM83A לצלחת שש בארות ותרבית למשך 24 שעות עם או בלי טיפול של 5 מיקרומטר ציספלטין (DDP).
2. אספו את התאים שגודלו בתרבית ושטפו אותם במי מלח חוצצים בפוספט קר כקרח (PBS) כדי להסיר כל שאריות של מצע גידול או סרום. Lyse התאים באמצעות RIPA Lysis Buffer המכיל phenylmethyl sulfonyl fluoride (PMSF) כדי לשחרר את החלבונים התאיים. לדגור על התאים על קרח במשך כמה דקות כדי להבטיח ליזה מלאה וצנטריפוגה ב 4 ° C, 12,000 × גרם במשך 15 דקות. אספו את הסופרנאטנט כדי לקבוע את ריכוז החלבונים שלו.
3. קבע את ריכוז החלבון בליזט התא באמצעות ערכת בדיקת חלבון BCA בהתאם להוראות היצרן. ערבבו את הליזט התא עם חיץ העמסה וחממו את התערובת בטמפרטורה של 95-100 מעלות צלזיוס למשך 5-10 דקות כדי לפרק את החלבונים ולהבטיח הפרדה אחידה על הג'ל.
4. מכל דגימה, טען 30 מיקרוגרם של חלבון כולל על ג'ל SDS-PAGE והפעל את SDS-PAGE תחת מתח קבוע של 80 V. עצור את האלקטרופורזה כאשר כחול הברומופנול מגיע לתחתית ג'ל ההפרדה.
5. מעבירים את החלבונים המופרדים מהג'ל לקרום פוליווינילידיפלואוריד באמצעות מערכת העברה רטובה באמבט קרח עם זרם של 200 mA למשך שעה וחצי.
6. חסום את הממברנה עם חלב 5% ללא שומן במי מלח חוצצים של Tris עם חיץ 0.05% Tween-20 (TBST) למשך שעה אחת ב- RT ודגור למשך הלילה ב- 4 ° C עם נוגדנים מתאימים הניתנים בטבלת החומרים.
7. שטפו את הממברנה מספר פעמים עם TBST ודגרו עם הנוגדנים המשניים (Table of Materials) במשך שעה אחת ב-RT, ולאחר מכן שטפו עם TBST. דמיינו את רצועות החלבונים באמצעות ערכת זיהוי כימילומינסנציה משופרת ומערכת הדמיה.

12. ניתוח סטטיסטי

1. מכיוון שכל נקודות הנתונים הניסיוניות יהיו בלתי תלויות, הציגו את הנתונים כממוצע ± SD. בצעו ניתוח סטטיסטי.
2. השתמש בניתוח חד-כיווני של שונות (ANOVA) להשוואות מרובות ובמבחן של דנט להשוואה בין כל קבוצה לקבוצת הביקורת. השתמש במבחן t של תלמיד (דו-זנב לא מזווג) להשוואה בין שתי קבוצות; שקול P < 0.05 להיות משמעותי.

ניתוח מסדי נתונים TCGA ותיקוף PCR

מניתוח מסד הנתונים של TCGA, ערכנו ניתוח השוואתי של רמות ביטוי mRNA ב-306 דגימות תאי סרטן צוואר הרחם וב-13 דגימות תאים נורמליים כדי לחקור את הביטוי הדיפרנציאלי של FAM83A. FAM83A היה מווסת בסרטן צוואר הרחם, בעוד שהביטוי שלו ברקמת צוואר הרחם הרגילה היה זניח (איור 1A). כדי לקבל תובנות נוספות לגבי ההשלכות הפרוגנוסטיות של ביטוי FAM83A , ביצענו ניתוח עקומת קפלן-מאייר. באופן מדהים, מטופלים עם ביטוי FAM83A גבוה יותר הציגו הישרדות כללית גרועה יותר באופן משמעותי (איור 1B). כדי לקבוע את התפקיד של FAM83A בסרטן צוואר הרחם, בחנו את רמות הביטוי של FAM83A בשני קווי תאים של סרטן צוואר הרחם, HeLa ו-C33a, כמו גם בקו תאי צוואר הרחם האימורטליים, End1/E6E7. באמצעות qRT-PCR ראינו ביטוי יתר משמעותי של FAM83A בקווי התאים HeLa ו-C33a בהשוואה לקו התאים End1/E6E7 (איור 1C). ממצאים אלה מדגישים את החשיבות של FAM83A בהקשר של סרטן צוואר הרחם.

ניסויי התפשטות ואפופטוזיס לאימות התפקוד הביולוגי של FAM83A בסרטן צוואר הרחם

כדי לחקור את התפקיד התפקודי של FAM83A בסרטן צוואר הרחם, השתמשנו בהפלה בתיווך siRNA של FAM83A בתאי C33a ו-HeLa (איור 2A,B). לאחר מכן הערכנו את ההשפעה של דיכוי FAM83A על התפשטות תאים. צביעת EdU גילתה כי ביטוי מופחת של FAM83A עיכב באופן משמעותי את התפשטות התאים הן בתאי C33a והן בתאי HeLa (איור 2C-F). תאים ממאירים בני אלמוות קשורים לשיעורי אפופטוזיס נמוכים ביותר¹⁰. לכן, רמות החלבונים האנטי-אפופטוטיים והפרואפופטוטיים הוערכו בתאי סרטן צוואר הרחם שטופלו ב-si-FAM83A. ניתוח כתמים מערביים גילה כי ביטוי מדוכא של FAM83A הגביר את הביטוי של חלבוני Bax וקספאז3 שסוע (חלבונים פרואפופטוטיים), הפחית את הביטוי של Bcl-2 (חלבון אנטי-אפופטוטי), והגדיל את שחרור Cytc (איור 2C-E), מה שעולה בקנה אחד עם התצפית שחלבונים אנטי-אפופטוטיים מווסתים אפופטוזיס על-ידי חסימת השחרור המיטוכונדריאלי של Cytc (איור 2G-J)¹⁰. באופן קולקטיבי, נתונים אלה הצביעו על כך ש- FAM83A ממלא תפקיד חשוב בוויסות התפשטות תאי סרטן צוואר הרחם ואפופטוזיס.

ריפוי פצעים והחדרת קרום נקבובי בדיקות כדי לאמת את הפונקציה הביולוגית של FAM83A בסרטן צוואר הרחם

בדיקות ריפוי פצעים והחדרת קרום בוצעו כדי לחקור את ההשפעות של דיכוי FAM83A על נדידה ופלישה של תאי סרטן צוואר הרחם. התוצאות הראו שתאי סרטן צוואר הרחם עם ביטוי FAM83A מדוכא נדדו (איור 3A-D) ופלשו (איור 3E-H) פחות ביעילות מאשר תאי הביקורת.

השפעות על תפקוד המיטוכונדריה ומסלול איתות PI3K/AKT

בהתחשב בתפקיד של PI3K/AKT בהשראת אפופטוזיס של תאים, ביקשנו לקבוע אם דיכוי ביטוי FAM83A יעכב את הזרחן המכונן של מסלול PI3K/Akt/mTOR בסרטן צוואר הרחם. דיכוי FAM83A עיכב באופן משמעותי את רמות החלבון הזרחניות העיקריות במסלול PI3K/Akt/mTOR, כולל p-PI3K, p-Akt ו-p-mTOR בתאי c333a ו-HeLa (איור 4A-D). מיטוכונדריה הם אברונים האחראים על חילוף החומרים בתאים ועל השראת אפופטוזיס של תאים. עדויות מצטברות מצביעות על כך שאפופטוזיס של תאים סרטניים כרוך בתפקוד לקוי של המיטוכונדריה דרך המסלול המיטוכונדריאלי הפנימי עקב חדירות מיטוכונדריאלית משופרת ושחרור מולקולות פרואפופטוטיות כגון Cytc לתוך הציטופלסמה¹⁰. מסלול PI3K/AKT יכול לווסת את הטרנסלוקציה של Bax לתוך המיטוכונדריה, ולגרום לשחרור Cytc בתגובה לגירויים אפופטוטיים. לכן, ניתן להעלות על הדעת כי המרכיבים האונקוגניים של מסלול האיתות PI3K-AKT מווסתים אפופטוזיס של תאים ישירות על ידי השפעה על התנהגות מיטוכונדריאלית. לפיכך, בוצעה בדיקת mPTP (ראשי תיבות של Live cell mitochondrial permeability transition pore) כדי לקבוע את מצב המיטוכונדריה. פתיחת mPTP קשורה למוות תאי אפופטוטי ונמק¹¹. בבדיקה זו, צבע פלואורסצנטי ירוק (calcein AM) נשמר בציטופלסמה ובמיטוכונדריה כאשר mPTP סגור, בעוד הצבע בציטופלסמה מרוהה על ידי CoCl₂, מה שמשאיר רק את הפלואורסצנטיות האינטנסיבית במיטוכונדריה. התוצאות הראו כי אוכלוסיות תאים עם פלואורסצנטיות ירוקה אינטנסיבית במיטוכונדריה פחתו באופן משמעותי לאחר דיכוי FAM83A, מה שמצביע על mPTP פתוח (איור 4E,F). יתר על כן, בחנו את השינויים בפוטנציאל הממברנה המיטוכונדריאלית (ΔΨm) באמצעות צביעת JC-1. JC-1 יוצר אגרגטים (פלואורסצנטיות אדומה) בתאים חיים המכילים מיטוכונדריה שלמים עם פוטנציאל ממברנה גבוה ומונומרים (פלואורסצנטיות ירוקה) תחת MMP נמוך בתאים אפופטוטיים. דיכוי FAM83A ירד בהדרגה ב-MMP (איור 4G).

ניתוח רגישות לתרופות לצורך התפשטות ופלישה

כימותרפיה מבוססת ציספלטין (DDP) היא אסטרטגיית טיפול סטנדרטית בסרטן צוואר הרחם. עם זאת, עמידות לכימותרפיה נותרה אתגר. חקרנו את התפקיד של FAM83A בטיפול בסרטן צוואר הרחם באמצעות ציספלטין. תאי HeLa שטופלו ב-SI-NC ו-si-FAM83A טופלו עם או בלי ציספלטין¹² של 5 מיקרומטר. יתר על כן, ההשפעות של דיכוי FAM83A על כדאיות התא הוערכו. DDP גרם להשפעה מעכבת משמעותית יותר על התפשטות תאי HeLa לאחר דיכוי FAM83A, בהשוואה לטיפול DDP בלבד (איור 5A ואיור 5C). לאחר טיפול בתאי סרטן צוואר הרחם עם ציספלטין של 5 מיקרומטר, דיכוי FAM83A גם עיכב פלישת תאים (איור 5B ואיור 5D).

ניתוח רגישות לתרופות לתפקוד המיטוכונדריה

על ידי טיפול בתאי HeLa שטופלו ב- Si-NC וב- si-FAM83A עם או בלי 5 מיקרומטר ציספלטין (DDP), הערכנו את פוטנציאל הממברנה המיטוכונדריאלית (MMP) והערכנו את הנזק המיטוכונדריאלי שנגרם על ידי מוות תאי באמצעות צביעת JC-1. DDP גרם ליותר נזק למיטוכונדריה, כפי שנחשף על-ידי ירידה באחוז המונומרים של JC-1 לאחר הפלת FAM83A, בהשוואה לטיפול ב-DDP בלבד (איור 6A ואיור 6D). לאחר טיפול בתאי סרטן צוואר הרחם עם ציספלטין של 5 מיקרומטר, FAM83A עיכב גם היווצרות מושבות (איור 6B ואיור 6E) והגביר אפופטוזיס של תאים (איור 6C ואיור 6F). נוסף על כך, הפלת FAM83A בנוכחות DDP הגבירה במידה ניכרת את הביטוי של חלבונים פרואפופטוטיים, Bax וקספאז שסוע3, קידמה את שחרור Cytc והפחיתה את ביטוי Bcl-2 (איור 6G,H). תוצאות אלה הצביעו על כך ש-FAM83A גרם לרגישות תאי סרטן צוואר הרחם ל-DDP באמצעות השראת אפופטוזיס.

איור 1: ביטוי יתר של FAM83A בתאי סרטן צוואר הרחם ומתאם עם פרוגנוזה גרועה יותר. (A) ניתוח Boxplot של רמות mRNA של FAM83A בדגימות סרטן צוואר הרחם. (B) ניתוח קפלן-מאייר של FAM83A לקביעת הישרדות כוללת בחולות עם סרטן צוואר הרחם. (C) רמות mRNA יחסיות של FAM83A בשורות תאי סרטן צוואר הרחם HeLa ו-C33a וקו תאי צוואר הרחם האימורטליים האנושיים End1/E6E7. הנתונים מוצגים כממוצע ± SD עבור שלושה ניסויים עצמאיים. *P < 0.05, בהשוואה לתאי End1/E6E7 המשתמשים ב-ANOVA חד-כיוונית. קיצורים: CESE = קרצינומה של תאי קשקש צוואר הרחם ואדנוקרצינומה אנדוצרביקלית; HR = יחס סיכון. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 2: השפעות דיכוי FAM83A על התפשטות ואפופטוזיס של סרטן צוואר הרחם. תאי C33a ו-HeLa הודבקו ב-siRNA ספציפי ל-FAM83A. (A,B) רמות mRNA של FAM83A הוערכו בשורות תאים של סרטן צוואר הרחם באמצעות qRT-PCR.התפשטות התאים בתאי (C) C33a ו-(D) HeLa נקבעה באמצעות בדיקת EdU. (ה,ו) תמונות הפלואורסצנטיות של EDU של תאי C33a ו- Hela. (ג-י) ניתוח כתמים מערביים לבחינת רמות חלבונים הקשורים לאפופטוזיס, כולל Cytc, Bcl-2, Bax, caspase3 ו-cleaved-caspase-3; GAPDH שימש כבקרת הטעינה. הנתונים מוצגים כממוצע ± SD עבור שלושה ניסויים עצמאיים. *P < 0.05; **P < 0.01; **P < 0.001, בהשוואה לתאי ביקורת המשתמשים ב-ANOVA חד-כיוונית. קיצורים: NC = שליטה שלילית; EdU = 5-ethynyl-2'-deoxyuridine; CytC = cytochrome C. לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 3: ההשפעה של FAM83A על נדידה ופלישה של תאי סרטן צוואר הרחם במבחנה. (A-D) בדיקת ריפוי פצעים בוצעה כדי להעריך נדידת תאים. התמונות צולמו ב-0, 24 ו-48 שעות. (E-H) בדיקות Transwell בוצעו כדי לבחון פלישה לתאים. פסי קנה מידה = 100 מיקרומטר (E,F). הנתונים מוצגים כממוצע ± SD עבור שלושה ניסויים עצמאיים. *P < 0.05; **P < 0.01; **P < 0.001, בהשוואה לתאי ביקורת המשתמשים ב-ANOVA חד-כיוונית. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 4: השפעת דיכוי FAM83A על מסלול PI3K/AKT/mTOR ועל תפקוד המיטוכונדריה. (א-ד) ניתוח כתמים מערביים כדי לקבוע את רמות החלבונים ממסלול PI3K/AKT/mTOR בתאי C33a ו-HeLa לאחר דיכוי FAM83A. (ה-ה) ניתוח פוטנציאלי של קרום מיטוכונדריאלי באמצעות צביעת JC-1. אגרגטים של JC-1 היו מוכתמים באדום, ומונומרים של JC-1 היו מוכתמים בירוק וציינו MMP נמוך יותר. (ט,י) חדירות מיטוכונדריאלית הוערכה באמצעות ערכת mPTP וציטומטריית זרימה. פסי קנה מידה = 50 מיקרומטר (E, F). הנתונים מוצגים כממוצע ± SD עבור שלושה ניסויים עצמאיים. *P < 0.05; **P < 0.01; P < 0.001, בהשוואה לתאי ביקורת המשתמשים ב-ANOVA חד-כיוונית. קיצורים: MMP = פוטנציאל קרום מיטוכונדריאלי; mPTP = נקבוביות מעבר חדירות מיטוכונדריאלית. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 5: השפעות דיכוי FAM83A על עיכוב על-ידי DDP על התרבות תאים ופלישה לתאי סרטן צוואר הרחם. תאי HeLa הודבקו ב- si-NC או si-FAM83A וטופלו עם או בלי DDP של 5 מיקרומטר. (א,ג) השפעת DDP על התפשטות התאים בתאי HeLa המטופלים ב-si-NC וב-si-FAM83. (ב,ד) השפעת DDP על פלישת תאים בבקרה, בתאי HeLa המטופלים ב-si-NC וב-si-FAM83. הנתונים מוצגים כממוצע ± SD עבור שלושה ניסויים עצמאיים. *P < 0.05; **P < 0.01; P < 0.001, בהשוואה לתאי הביקורת. ^& < 0.01; ^&P < 0.001, בהשוואה ל-DDP באמצעות ANOVA חד-כיוונית. קיצורים: DDP = diaminedichloroplatinum; EdU = 5-ethynyl-2'-deoxyuridine; DAPI = 4',6-diamidino-2-phenylindole. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 6: השפעות דיכוי FAM83A על ההשפעות של DDP על אפופטוזיס בתאי סרטן צוואר הרחם. תאי HeLa הודבקו ב- si-NC או si-FAM83A וטופלו עם או בלי DDP של 5 מיקרומטר. (א,ד) ניתוח MMP באמצעות צביעת JC-1. (ב,ה) תוצאות שכפול לוחות. (ג,ו) ציטומטריית זרימה המזהה שיעורי אפופטוזיס בקבוצות טיפול שונות. (ז,ח) ניתוח כתמים מערביים של חלבונים אפופטוטיים הקשורים למיטוכונדריה, כולל Bcl-2, Bax, Cytc וקספאז-3 שסוע במורד הזרם. GAPDH שימש כבקרת הטעינה. הנתונים מוצגים כממוצע ± SD עבור שלושה ניסויים עצמאיים. *P < 0.05; **P < 0.01; P < 0.001, בהשוואה לתאי הביקורת. ^&P < 0.05; ^&P < 0.01; ^& < 0.001, בהשוואה ל- DDP באמצעות ANOVA חד-כיוונית. קיצורים: DDP = diaminedichloroplatinum; EdU = 5-ethynyl-2'-deoxyuridine; DAPI = 4',6-diamidino-2-phenylindole. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

טבלה 1: siRNA, פריימרים qRTPCR ומערך תגובת qRT-PCR ששימש במחקר זה. אנא לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו.

חקירת גני היעד של הגידול היא בעלת חשיבות עליונה הן למניעה והן לטיפול בסרטן צוואר הרחם. הבנת הגנים הספציפיים הממלאים תפקיד משמעותי בהתפתחות והתקדמות סרטן צוואר הרחם מספקת תובנה חשובה לגבי המנגנונים המולקולריים הבסיסיים של המחלה. יתר על כן, זיהוי גני מטרה אלה יכול להוביל לפיתוח אסטרטגיות טיפוליות חדשניות וטיפולים ממוקדים. במחקר זה, אנו מתארים את השימוש בניתוח מערך הנתונים של TCGA כדי לזהות את FAM83A כגן מטרה ולחקור את תפקידיו המכניסטיים בסרטן צוואר הרחם. אנו רואים ביטוי גבוה משמעותית של FAM83A בתאי סרטן צוואר הרחם, אשר קשור לפרוגנוזה גרועה של חולות עם סרטן צוואר הרחם. סדרה של ניסויים מבוססי תאים חשפה ביטוי גבוה של FAM83A בתאי סרטן צוואר הרחם, אשר ממלא תפקיד קריטי בוויסות התפשטות תאים, נדידה ופלישה. דיכוי ביטוי FAM83A עיכב שגשוג ונדידה וקידם אפופטוזיס בתאי סרטן צוואר הרחם.

בניית קווי תאים של סרטן צוואר הרחם FAM83A היא השלב הקריטי ביותר במחקר זה. siRNAs מתוכננים ומאומתים על פי רצפי גני המטרה כדי להבטיח את יעילותם. יתר על כן, שורות תאי סרטן צוואר הרחם מועברים באמצעות siRNA. שיעור ההצלחה של טרנספקציית פלסמיד הוא קריטי לניסויים הבאים, הדורשים בקרה קפדנית על צפיפות התאים וצפיפות הפלסמיד. יתר על כן, יעילות transfection נצפתה תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי כדי להבטיח כי ניסויים הבאים ניתן לבצע. תוצאות הקרישה המערבית ותוצאות qRT-PCR מאשרות כי עיכוב FAM83A דיכא את מסלול PI3K/AKT וגרם לתפקוד לקוי של המיטוכונדריה. אנו משערים כי המנגנון כולל עיכוב של טרנסלוקציה של Bax מהציטופלסמה למיטוכונדריה על ידי PI3K/AKT, אשר מקדם הישרדות תאים¹³.

ההתקדמות בטיפול בסרטן צוואר הרחם אפשרה לפתח מולקולות מטרה חדשות. זיהוי של אונקוגן חדש יכול להיות מיושם באופן טיפולי כדי לשפר את הפרוגנוזה הקלינית של ממאירויות צוואר הרחם^14,15. במחקר זה, בנינו בהצלחה מערכת FAM83A בתאי HeLa ו-C33a ואימתנו את ההשפעות של FAM83A על תאי סרטן צוואר הרחם ברמה התאית. אנו מציעים כי עיכוב FAM83A יכול לשמש לטיפול בסרטן צוואר הרחם.

עם זאת, למחקר זה יש כמה מגבלות. ראשית, מחקר זה מבצע רק סינון גנים באמצעות מסד הנתונים וחסר נתונים פתולוגיים של חולים קליניים. שנית, מחקר זה רק תקף את ההשפעה במבחנה , ונדרשו מחקרי in vivo נוספים כדי לאמת את התוצאות. עם זאת, השיטות של זיהוי גני מטרה, נוקאאוט גנים ותיקוף תאי לזיהוי מוקדים טיפוליים ממוקדים שפורטו במחקר זה יכולות לספק רעיונות מחקריים לגילוי ותיקוף של גני מטרה למחלות אחרות.

לסיכום, FAM83A היה overexpression ובקורלציה עם פרוגנוזה גרועה יותר בסרטן צוואר הרחם. FAM83A מווסת את ההתפשטות, הנדידה והפלישה של תאי סרטן צוואר הרחם. דיכוי תפקוד לקוי של המיטוכונדריה ואפופטוזיס הנגרמים על ידי FAM83A, רגישות תאי סרטן צוואר הרחם לציספלטין. תוצאות אלה הצביעו על כך ש - FAM83A הוא יעד מחקרי מתאים לטיפול בסרטן צוואר הרחם. מחקר זה תרם להתקדמות בכימותרפיה אדג'ובנטית במטרה לשפר את הפרוגנוזה של חולות עם סרטן צוואר הרחם.

המחברים אינם מדווחים על ניגודי עניינים בעבודה זו.

עבודה זו נתמכה על ידי קרן לשכת המדע והטכנולוגיה של ג'ינגג'ואו (מס '2020HC06).