בדיקת סידן פלואורסצנטית "דו-תוספת" לבדיקת תפוקה גבוהה של קולטנים מצומדים לחלבון G רקומביננטי

בעבודה זו מתוארת בדיקה פלואורסצנטית של סידן תוך-תאי בעל תפוקה גבוהה עבור צלחות של 384 בארות לסינון ספריות מולקולות קטנות על קולטנים מצומדים לחלבון G רקומביננטי (GPCRs). המטרה, קולטן קינין מקרציית קדחת הבקר, Rhipicephalus microplus, מתבטאת בתאי CHO-K1. בדיקה זו מזהה אגוניסטים ואנטגוניסטים המשתמשים באותם תאים במבחן "תוספת כפולה" אחת.

קולטנים מצומדים לחלבון G (GPCRs) מייצגים את משפחת-העל הגדולה ביותר של קולטנים והם המטרות של תרופות אנושיות רבות. סינון בתפוקה גבוהה (HTS) של ספריות מולקולות קטנות אקראיות מול GPCRs משמש את תעשיית התרופות לגילוי תרופות ספציפיות למטרה. במחקר זה, נעשה שימוש ב-HTS כדי לזהות ליגנדות חדשניות של מולקולות קטנות של GPCRs נוירופפטידים ספציפיים לחסרי חוליות כבדיקות למחקרים פיזיולוגיים של וקטורים של פתוגנים קטלניים אנושיים ווטרינריים.

קולטן קינין הספציפי לחסרי חוליות נבחר כיעד משום שהוא מווסת תהליכים פיזיולוגיים חשובים רבים אצל חסרי חוליות, כולל דיאורזה, האכלה ועיכול. יתר על כן, הפרמקולוגיה של GPCRs חסרי חוליות רבים מאופיינת בצורה גרועה או אינה מאופיינת כלל; לכן, הפרמקולוגיה הדיפרנציאלית של קבוצות קולטנים אלה ביחס ל- GPCRs הקשורים במטזואנים אחרים, במיוחד בני אדם, מוסיפה ידע ליחסי המבנה-פעילות של GPCRs כמשפחת-על. בדיקת HTS פותחה עבור תאים בלוחות של 384 בארות לגילוי ליגנדות של קולטן קינין מקרציית קדחת הבקר, או קרציית בקר דרומית, Rhipicephalus microplus. קולטן הקרצייה קינין התבטא ביציבות בתאי CHO-K1.

קולטן קינין, כאשר הוא מופעל על ידי נוירופפטידים אנדוגניים של קינין או אגוניסטים אחרים של מולקולות קטנות, גורם לשחרור Ca²⁺ ממאגרי סידן לתוך הציטופלסמה. בדיקת סידן פלואורסצנטית זו בשילוב עם גישת "תוספת כפולה" יכולה לזהות מולקולות "פוגעות" פונקציונליות של אגוניסט ואנטגוניסט באותה צלחת בדיקה. כל בדיקה נערכה באמצעות לוחות תרופות שנשאו מערך של 320 מולקולות קטנות אקראיות. התקבל גורם Z אמין של 0.7, וזוהו שלוש מולקולות אגוניסט ושני אנטגוניסטים כאשר ה-HTS היה בריכוז סופי של 2 מיקרומטר. ניתן להתאים את בדיקת הסידן הפלואורסצנטית המדווחת כאן לסינון GPCRs אחרים המפעילים את מפל האיתות Ca²⁺ .

קולטנים מצומדים לחלבון G (GPCRs), הנמצאים משמרים ועד בני אדם, מייצגים את משפחת-העל הגדולה ביותר של קולטנים באורגניזמים רבים¹. הם ממלאים תפקידים קריטיים בוויסות כמעט כל התהליכים הביולוגיים בבעלי חיים. ישנם 50-200 GPCRs בגנום של פרוקי רגליים, כלומר הם מייצגים את משפחת קולטני הממברנה^{הגדולה ביותר 2}. הם מסווגים לשש מחלקות עיקריות, A-F, בהתבסס על דמיון הרצף והפונקציות שלהם³. GPCRs מתמרים אותות חוץ-תאיים שונים, כגון אלה של הורמונים, נוירופפטידים, אמינים ביוגניים, גלוטמט, פרוטון, ליפוגליקופרוטאינים ופוטונים⁴. GPCRs מצמידים לחלבוני G הטרוטרימרים (Gα, Gβ ו-Gγ) כדי להעביר אותות במורד הזרם. GPCRs המצומדים לחלבוני Gα_{s או Gα i/o} מגבירים או מקטינים, בהתאמה, את רמות האדנוזין מונופוספט (cAMP) התוך-תאיים 3', 5'-מחזורי על-ידי_{הפעלה או עיכוב} של אדניליל ציקלאז. GPCRs המצומדים ל-Gα_q/11 גורמים לשחרור סידן ממאגרי הסידן ברשתית האנדופלסמית על-ידי הפעלת מסלול הפוספוליפאז C (PLC)-אינוזיטול-1,4,5-טריפוספט (IP₃). GPCRs המצומדים ל- Gα_12/13 מפעילים את גורמי החלפת הנוקלאוטידים RhoGTPase ^5,6. GPCRs הם המטרה של יותר מ -50% של תרופות אנושיות ו acaricide, amitraz⁴. כאשר GPCRs מתמרים אותות כה מגוונים, הם מהווים יעדים מבטיחים לפיתוח חומרי הדברה חדשניים המשבשים תפקודים פיזיולוגיים ספציפיים לחסרי חוליות.

המטרה של HTS היא לזהות מולקולות פגיעות שיכולות לווסת את תפקודי הקולטן. HTS כולל פיתוח בדיקות, מזעור ואוטומציה⁷. GPCRs נוירופפטידים של פרוקי רגליים מעורבים ברוב הפונקציות הפיזיולוגיות, כגון התפתחות, נפילה ואקדיזיס, הפרשה, גיוס אנרגיה ורבייה⁴. רוב הנוירופפטידים GPCRs של פרוקי רגליים ומטזואנים מאותתים דרך מפל איתות הסידן 2,6,8,9,10^, כגון בקולטני הפפטיד המיואינהימבורי וה-SIFamide של הקרצייה השחורה Ixodes scapularis; הליגנדות שלהם הן אנטגוניסטיות במבחני תנועתיות אחוריים, כאשר SIF מעורר התכווצות ו- MIP מעכב אותו^11,12. קולטן דמוי NPY של יתוש הקדחת הצהובה, Aedes aegypti, מווסת את נקבת הפונדקאית המחפשת¹³. בהשוואה למבחנים חלופיים אחרים לגיוס סידן, כגון בדיקת הסידן הביולומינסנציה^{aequorin 14}, בדיקת הסידן הפלואורסצנטי קלה לביצוע, אינה דורשת העברה של חלבונים אחרים המזהים סידן רקומביננטי, והיא חסכונית. בדיקת הסידן הפלואורסצנטי מייצרת אות ממושך בהשוואה לאות הקינטי המהיר המתקבל בבדיקת הסידן הביולומינסנציה של אקוורין^14,15.

בדוגמה כאן, קולטן קינין מקרציית קדחת הבקר, Rhipicephalus microplus, התבטא באופן רקומביננטי בקו התאים CHO-K1 ושימש לבדיקת סידן פלואורסצנטי. יש רק גן אחד של קולטן קינין שנמצא במיקרופלוס R. ; הקולטן מאותת דרך מסלול איתות תלוי חלבון Gq ומפעיל את השטף של Ca²⁺ ממאגרי סידן לתוך החלל התוך-תאי¹⁶. ניתן לזהות ולכמת את התהליך הזה על-ידי פלואורופור, שמעורר אות פלואורסצנטי בעת קשירת יוני סידן (איור 1).

קולטן קינין הוא GPCR ספציפי לחסרי חוליות, השייך לקולטנים דמויי רודופסין מסוג A. קינין הוא נוירופפטיד איתות עתיק שנמצא במולוסקה, סרטנאים, חרקים ואקרי 4,17,18. קולופטרנים (חיפושיות) חסרים את מערכת האיתות של קינין; אצל היתוש Aedes aegypti, יש רק קולטן קינין אחד שקושר שלושה אדסקינינים, בעוד שלדרוזופילה מלנוגסטר יש קולטן קינין אחד עם דרוסוקינין כליגנד^{ייחודי 19,20,21}. אין קינינים הומולוגיים או קולטני קינין אצל בעלי חוליות. למרות שהתפקוד המדויק של קינין אינו ידוע בקרציות, הנקבות המושתקות ב-RNAi של קולטן קינין של R. microplus מראות ירידה משמעותית בכושר הרבייה²². קינינים הם פפטידים פלוטרופיים בחרקים. ב Drosophila melanogaster, הם מעורבים הן במערכת ויסות העצבים המרכזית והן ההיקפית 23, טרום אקדיזה²⁴, האכלה 25, מטבוליזם 26, ודפוסי פעילות שינה^26,27, כמו גם תנועה זחל ²⁸. קינינים מווסתים את ההתכווצות האחורית, דיאורזיס והזנה ביתוש A. aegypti 29,30,31. לפפטידים של קינין יש פנטפפטיד C-terminal Phe-X1-X2-Trp-Gly-NH₂ שמור, שהוא הרצף המינימלי הנדרש לפעילות ביולוגית³². הספציפיות של פרוקי הרגליים, הגודל הקטן של הליגנד האנדוגני, מה שהופך אותם לנוחים להפרעות של מולקולות קטנות, והתפקודים הפליאוטרופיים בחרקים הופכים את קולטן קינין למטרה מבטיחה להדברה⁴.

מבחן "התוספת הכפולה" (איור 2) מאפשר זיהוי של אגוניסטים או אנטגוניסטים באותה בדיקת HTS¹⁵. הוא מותאם מבדיקת "תוספת כפולה" המשמשת בדרך כלל בתעשיית התרופות לגילוי תרופות^33. בקצרה, התוספת הראשונה של תרופות לצלחת התא מאפשרת זיהוי של אגוניסטים פוטנציאליים בספרייה הכימית כאשר אות פלואורסצנטי גבוה יותר מזוהה בהשוואה ליישום של בקרת הממס. לאחר 5 דקות של דגירה עם מולקולות קטנות אלה, אגוניסט ידוע (פפטיד קינין) מוחל על כל הבארות. אותן בארות שקיבלו באופן אקראי אנטגוניסט מצלחת התרופה מציגות אות פלואורסצנטי נמוך יותר על תוספת אגוניסטית בהשוואה לבארות הבקרה שקיבלו את הממס בתוספת הראשונה. בדיקה זו מאפשרת זיהוי של אגוניסטים ואנטגוניסטים פוטנציאליים עם אותם תאים. בפרויקט HTS סטנדרטי, מולקולות פגיעות אלה יאומתו עוד יותר באמצעות מבחני מינון-תגובה ועל ידי מבחני פעילות ביולוגית נוספים, שאינם מוצגים כאן.

איור 1: המחשה של מנגנון בדיקת הסידן הפלואורסצנטי. חלבון ה-Gq מפעיל את מסלול איתות הסידן התוך-תאי. קולטן קינין (קולטן מצומד לחלבון G) בא לידי ביטוי רקומביננטי בתאי CHO-K1. כאשר הליגנד האגוניסט נקשר לקולטן, חלבון ה-Gq הקשור לקולטן קינין מפעיל את PLC, מה שמזרז את ההמרה של מולקולת PIP₂ ל-IP₃ ו-DAG. לאחר מכן, IP 3 נקשר ל-IP₃R על פני השטח של הרשתית האנדופלסמית, מה שמוביל לשחרור Ca 2+ לתוך הציטופלסמה, שם יוני Ca²⁺ נקשרים לפלואורופורים ומעוררים אות פלואורסצנטי. ניתן לקבל את אות הפלואורסצנציה על ידי עירור ב 490 ננומטר ולזהות ב 514 ננומטר. קיצורים: GPCR = קולטן מצומד חלבון G; PLC = פוספוליפאז C; PIP₂ = פוספטידילינוזיטול 4,5-ביספוספט; IP₃ = אינוזיטול טריספוספט; DAG = דיאצילגליצרול; IP3 R = קולטן IP₃. נוצר באמצעות BioRender.com. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

איור 2: תהליך העבודה של הקרנה בתפוקה גבוהה של מולקולות קטנות על קולטן מצומד לחלבון G המתבטא בתאי CHO-K1. (A) תאי CHO-K1 רקומביננטיים המבטאים ביציבות את קולטן הקינין נוספו לצלחת 384 באר (10,000 תאים/באר) באמצעות מערכת טיפול בנוזל (25 μL/well) ודוגרו באינקובטור CO₂ לח במשך 12-16 שעות. (ב ) חיץ הבדיקה המכיל את הצבע הפלואורסצנטי (25 μL/well) נוסף ללוחית התא באמצעות מערכת טיפול בנוזל. הצלחת דוגרה במשך 30 דקות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות ושיוותה ב-RT למשך 30 דקות נוספות. (D) תמיסות סמים מצלחת ספרייה של 384 בארות וממס ריק (כולם ב-0.5 μL/well) נוספו ללוחית הבדיקה התאית באמצעות מערכת טיפול בנוזלים. (E) תגובות פלואורסצנטיות של סידן תאי נמדדו עם קורא הצלחות מיד לאחר הוספת תמיסות התרופה; תרכובות המעוררות אותות פלואורסצנטיים גבוהים מהממוצע נבחרו כפגיעות אגוניסטיות. להיטים אנטגוניסטיים שחוסמים את ה-GPCR (אייקון למטה) נחשפו לאחר הוספת האגוניסט הפפטידי במהלך שלב G. (F) באותה צלחת בדיקה, לאחר 5 דקות של דגירה של התאים עם תרכובות הקרנה, פפטיד אגוניסט אנדוגני Rhimi-K-1 (QFSPWGamide) של קולטן קינין קרציות נוסף לכל באר (1 μM). (G) תגובות פלואורסצנטיות תאיות לאחר תוספת הפפטיד האגוניסטית נמדדו על ידי קורא הלוחות באופן מיידי. תרכובות המעכבות את האות הפלואורסצנטי נבחרו כפגיעות אנטגוניסטיות. קיצורים: GPCR = קולטן מצומד חלבון G; RT = טמפרטורת החדר; RFU = יחידות פלואורסצנטיות יחסיות. נוצר באמצעות BioRender.com. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

1. תחזוקת תאים

הערה: קו תאי CHO-K1 המבטא ביציבות את קולטן קינין מ - R. microplus, בשם BMLK₃, פותח על ידי Holmes et ^al.16. פרטי התפתחות קו התא מוצגים במקום אחר¹⁴. כל השלבים הבאים מבוצעים בתנאים סטריליים בארון בטיחות ביולוגית מדרגה II.

1. הגדל את קו התא הרקומביננטי במדיה סלקטיבית (מדיום F-12K המכיל 10% סרום בקר עוברי [FBS] ו-800 מיקרוגרם/מ"ל G418 סולפט) כדי להבטיח את הביטוי של קולטן המטרה. אחסן את התאים המבטאים ביציבות את הקולטן ב-1 מ"ל של מדיום מקפיא (90% FBS ו-10% דימתיל סולפוקסיד [DMSO]) בקריביאלי של 2 מ"ל במקפיא של −80 מעלות צלזיוס.
   הערה: לאחסון ארוך טווח של התאים הקפואים, אחסן אותם בחנקן נוזלי.
2. מחממים מראש את כל המדיה לפני תרבית תאים. בארון בטיחות ביולוגית, העבירו 13 מ"ל של מדיום סלקטיבי שחומם מראש (מדיום F-12K המכיל 10% FBS ו-800 מיקרוגרם/מ"ל G418 סולפט) לתוך בקבוקון T-75, ושמרו אותו בארון הבטיחות הביולוגית. הפשרת בקבוקון אחד של BMLK₃ תאים קפואים (~ 1.5 × 10⁶ תאים) באמבט מים 37 מעלות צלזיוס למשך 2-3 דקות. מעבירים את התאים המופשרים לתוך בקבוק T-75. שמור על התאים באינקובטור לח ב 37 מעלות צלזיוס ו 5% CO₂ אלא אם כן צוין אחרת.
3. כאשר התאים מגיעים למפגש של 90% (1-2 ימים), יש לחמם מראש את כל המדיה ל-37 מעלות צלזיוס, למעט תמיסת המלח החצובה בפוספט (DPBS) של דולבקו, שנשמרת בטמפרטורת החדר. בארון biosafety, להסיר את המדיום בילה מן בקבוק T-75, לשטוף את התאים במשך 5 s עם 10 מ"ל של DPBS על ידי מערבולת את הבקבוק בעדינות, ולאחר מכן להסיר את DPBS עם פיפטה סרולוגית.
   הערה: תמונה של תאי CHO-K1 במפגש של 90% מוצגת ב- Lu et ^al.14.
4. נתק את התאים מבקבוק T-75 על ידי הוספת 2 מ"ל של 0.25% טריפסין-EDTA, ודגירה במשך 3-5 דקות ב 37 מעלות צלזיוס בחממה. לאחר מכן, מוסיפים 8 מ"ל של מדיום סלקטיבי, ומערבבים היטב על ידי פיפטינג ושחרור בעדינות 2x-3x עם אותה פיפטה סרולוגית.
5. העבר 2 מ"ל של תרחיף התא (~ 1 × 10⁶ תאים) משלב 1.4 לתוך בקבוק T-75 חדש המכיל 10 מ"ל של מדיום סלקטיבי חם. לגדל את התאים במשך 1-2 ימים באינקובטור עד שהם מגיעים למפגש של 90%.
6. השתמש בתאים עבור הבדיקה שלאחר השלבים הבאים, או חזור על שלבים 1.4-1.5 פעם או פעמיים לפני השימוש בתאים בבדיקה.
   הערה: אין לחרוג משלושה עד ארבעה מעברים, מכיוון שאות הבדיקה עם קווי תאים מסוימים עלול להיחלש עם מעברים נוספים.

2. בדיקת סידן פלואורסצנטי

1. מצפים את צלחת התא.
   1. השתמש במערכת לטיפול בנוזלים הממוקמת בתוך ארון בטיחות ביולוגית עבור כל שלבי הצנרת בלוחות 384 הבארות. צור תוכניות מותאמות אישית לצינורות לתוך לוחות^{384 באר 31} (טבלה משלימה S1). מצפים מראש את הצלחות הסטריליות של 384 בארות. בארון בטיחות ביולוגית, יש לטעון 10 μL/well של תמיסה מימית של פולי-D-ליזין (PDL) ב-0.05 מ"ג/מ"ל לכל צלחת, ולדגור במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר.
   2. רוקנו את הצלחת על ידי היפוך מהיר של הצלחת והכתמתה בעדינות על מגבות נייר סטריליות. לאחר מכן, יש לשטוף כל באר ב-10 מיקרו-ליטר מים, לרוקן את הצלחת ולהשאיר את הצלחת לייבוש בארון הבטיחות למשך הלילה ללא המכסה. סוגרים את הצלחת עם המכסה, ומאחסנים בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס במקרר.
      הערה: ניתן לאחסן את הלוחות המצופים בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך עד 6 חודשים.
2. יום 1
   1. הוציאו את צלחת התרופות (100 מיקרומטר ב-90% DPBS + 10% DMSO, הריכוז הסופי בבאר עבור HTS יהיה 2 מיקרומטר) המאוחסן במקפיא −20 מעלות צלזיוס, והניחו אותה בטמפרטורת החדר.
      הערה: פריסת צלחת התרופות: כל צלחת 384 בארות (24 עמודות x 16 שורות) מכילה 320 בארות עם תרכובות ספרייה שונות ו -64 בארות עם ממס ריק (DPBS המכיל 10% DMSO), המסודרות בארבע עמודות, עם שתי עמודות בקצה כל צד. ראו טבלה משלימה S2 לפריסת הצלחות.
   2. כאשר תאים מגיעים למפגש של ~70%-90% בבקבוקון T-75, נתק את התאים מבקבוק T-75 כמתואר להלן. מחממים את כל המדיה ל-37 מעלות צלזיוס למעט ה-DPBS (טמפרטורת החדר).
      1. הסר את המדיום בילה, לשטוף את התאים עם 10 מ"ל של DPBS, ולאחר מכן להסיר את DPBS. נתק את התאים מבקבוק T-75 באמצעות 2 מ"ל של 0.25% טריפסין-EDTA למשך 3-5 דקות ב-37 מעלות צלזיוס באינקובטור, הוסף 8 מ"ל של מדיום סלקטיבי והעבר את מתלה התא לצינור חרוטי של 15 מ"ל לצנטריפוגה ב-1,000 × גרם למשך 3 דקות.
      2. יש להשליך את הסופר-נטנט ולתלות מחדש את גלולת התא ב-10 מ"ל של מדיום F-12K המכיל 1% FBS ו-400 מיקרוגרם/מ"ל G418 סולפט. שמור את המתלים בארון הבטיחות הביולוגית בעת קביעת ספירת התאים.
   3. קבע את צפיפות התאים של התרחיף לצורך דילול נוסף: ערבב 20 μL של תרחיף התא לתוך 20 μL של 0.4% טריפאן כחול, ולאחר מכן טען 20 μL של התערובת לתוך תא ספירת תאים כדי להיקרא על ידי מונה תאים עבור צפיפות התא.
   4. לדלל את תרחיף התא באותו מדיום (מדיום F-12K המכיל 1% FBS ו-400 מיקרוגרם/מ"ל G418 סולפט) לנפח סופי של לפחות 15 מ"ל בצפיפות של 4 × 10⁵ תאים/מ"ל.
   5. זרעו את התאים בצלחת 384 המצופה ב-PDL. העבר 15 מ"ל מתלי התא הנ"ל (4 × 10⁵ תאים למ"ל) למאגר ריאגנטים ידידותי לרכב של 150 מ"ל. יש לחלק 25 μL של תרחיף התא (~ 10,000 תאים / באר) לתוך כל באר של 384 בארות של הצלחת באמצעות מערכת טיפול בנוזל בשני שלבים. טען 384/12.5 μL קצוות שמירה נמוכים על ראש המטפל בנוזל, שאף 12.5 μL מהמאגר (מהירות 5.2 μL/s), והשלך לתוך כל באר (מהירות: 3.1 μL / s).
   6. חזור על הפיפטינג כמו בשלב הקודם 2.2.5 כדי להגיע ל-25 μL לכל באר. לאחר מכן, לדגור את הצלחת לילה (14-16 שעות) ב 37 מעלות צלזיוס ו 5% CO₂ באינקובטור לחות.
      הערה: מכיוון שנפח הפיפטינג המרבי הוא 12.5 μL עבור ראש ספציפי זה, פיפטינג עבור 25 μL מבוצע בשני שלבים.
3. יום 2
   1. למחרת בבוקר, בדוק את צלחת התא המכוסה תחת מיקרוסקופ; אם לא מפגש, המתן עד שהתאים יגיעו למפגש של 90%.
   2. הכן תמיסת מלאי של צבע פלואורסצנטי: השהה צבע פלואורסצנטי ליופילי ב- 100 μL של DMSO, והימנע מאור ישיר בתמיסת המלאי. יש לעטוף את השפופרת ברדיד אלומיניום כדי למנוע הלבנת פוטו.
      הערה: ניתן להעלות את המניה ל-15 μL aliquots עבור כל בדיקת צלחת כדי למנוע הקפאה והפשרה חוזרות ונשנות; ניתן לאחסן את האליקוטים ב- −80 מעלות צלזיוס למשך עד חודש אחד.
   3. בארון הבטיחות הביולוגית עם האורות כבויים, הכינו צבע העמסה (1x) בצינור חרוטי של 15 מ"ל עטוף ברדיד אלומיניום, המשלב 15 μL מתמיסת הצבע הפלואורסצנטי (משלב 2.3.2) ושאר רכיבי הערכה שחוממו מראש (37 מעלות צלזיוס): 13.5 מ"ל של 1x HHBS (המאגר של האנק עם 20 mM HEPES) ו-1.5 מ"ל של מגיב B (מעכב efflux צבע).
      הערה: תאורת החדר דולקת במהלך שלב זה.
   4. סגרו את הצינור וערבבו היטב על ידי היפוך עדין של הצינור מספר פעמים (בדרך כלל 3-5x).
      הערה: יש לשמור בטמפרטורת החדר ולהשתמש בתערובת הצבעים לטעינה תוך 30 דקות.
   5. כאשר התאים מגיעים למפגש של 90%, הסר את המדיום המושקע מצלחת הבדיקה של 384 בארות על ידי היפוך מהיר של הצלחת והכתמה עדינה על מגבות נייר סטריליות; חזור על תנועה זו 2x-3x כדי להסיר את כל הנוזל מהצלחת. השליכו את המגבות הרטובות.
   6. כבו את רוב האורות הישירים המלאכותיים בחדר (משאירים מנורת שולחן רכה ועמומה דולקת או דומה כדי לאפשר תנאי עבודה נראים לעין) ובארון הבטיחות הביולוגית לכל השלבים עד סוף הבדיקה (בערך למשך שעה וחצי).
   7. מקם 15 מ"ל של צבע הטעינה (1x) משלב 2.3.3 למאגר ידידותי לרכב של 150 מ"ל.
      1. העבר 25 μL של צבע ההעמסה (1x) מהמאגר לתוך כל באר באמצעות מערכת טיפול בנוזלים עם 384/12.5 μL טיפים לשמירה נמוכה על ידי חלוקת 12.5 μL לתוך כל באר של הצלחת (שאיפה ומהירות חלוקה: 3.8 μL / s).
   8. חזור על שלב הפיפטינג כמו ב- 2.3.7.1 כדי להגיע לנפח סופי של 25 μL בכל באר של הצלחת. מכסים ועוטפים את הצלחת בנייר אלומיניום כדי להגן עליה מפני אור הסביבה.
   9. דגירה של צלחת התא המכוסה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס באינקובטור האדים CO₂ למשך 30 דקות, הסר אותה מהאינקובטור ושיווי משקל בטמפרטורת החדר בתוך קורא הצלחות או על הספסל, תוך שמירה על הצלחת מכוסה ועטופה בנייר כסף למשך 30 דקות נוספות. לאחר מכן התאים מוכנים להקרנה בתפוקה גבוהה (HTS).
   10. הכנה כימית: סובבו את צלחת התרופה משלב 2.2.1 ב-1,200 × גרם בצנטריפוגת צלחת למשך דקה אחת בטמפרטורת החדר.
       1. הכינו תמיסת פפטידים אגוניסטית 10x של Rhimi-K-1 (QFSPWGamide) (10 μM) על ידי החייאת 100 nmoles של פפטיד lyophilized ב 10 מ"ל של 1x HHBS המכיל 0.1% DMSO, ולהעביר את התמיסה למאגר 150 מ"ל ידידותי אוטומטית.
   11. מדוד את אות הרקע: עבור כל בדיקת HTS בקורא הלוחות, תחת פרוטוקולים, בחר מצב פלואורסצנציה של נקודת קצה.
       הערה: האות הפלואורסצנטי נקרא מתחתית הלוח באורכי גל עירור/פליטה של 495 ננומטר/525 ננומטר.
       1. הכנס את לוחית התא לקורא הלוחות. בלוח המחוונים, בחר כוונן רווח, בחר באר אקראית על הלוח, הקצה אותה כ- 5%-10% מערך הפלואורסצנציה המרבי הניתן למדידה, ובחר התאם (קריאה) גובה.
       2. לחץ על התחל מדידה כדי לקרוא את כל הלוח עבור אות הפלואורסצנציה ברקע ביחידות פלואורסצנטיות יחסית (RFU).
   12. בדיקת "תוספת כפולה"
       1. שימוש במערכת הטיפול בנוזלים עם טיפים של 384/12.5 μL, כדי לערבב את תמיסת התרופה בכל באר של צלחת התרופה, פיפטה פי 3 למעלה ולמטה 10 μL של תמיסת התרופה (ב-DPBS המכילה 10% DMSO) (מהירות פיפטינג: 5.2 μL/s), ו"לשאוף" 1.5 μL מכל באר של צלחת התרופה (מהירות שאיפה: 1.0 μL/s).
       2. "מחלקים" 0.5 μL של התרכובות לתוך צלחת הבדיקה של התא (מהירות פיפטינג: 1 μL/s) כדי להגיע לריכוז סופי של 2 μM ב 0.2% DMSO.
       3. הנח את צלחת הבדיקה מיד לתוך קורא הלוחות לאחר הוספת תרכובות ההקרנה. קרא את אותה צלחת בכיוון הקריאה קדימה ואחורה. כדי להשיג קריאות אלה, הגדר תוכנית לקריאה מתוך "באר 1-384" ומיד מ "384-1".
          הערה: הקריאה בשני הכיוונים אורכת 2 דקות בסך הכל. עיצוב קריאה זה נועד לפצות על הירידה בעוצמת האות המתרחשת במהלך קריאת הלוח בכל כיוון. עיין בשלב 3.1 לניתוחי הקריאה.
       4. השליכו את 1 μL הנותרים של תמיסת התרופה בקצוות על ידי טבילת הקצוות לתוך מאגר פסולת של 150 מ"ל המכיל ~ 50 מ"ל של DPBS (מהירות חלוקה: 1.0 μL / s).
       5. דגרו את תרכובות הסינון עם התאים למשך 5 דקות בסך הכל (כולל 2 דקות של קריאת צלחת) בטמפרטורת החדר בארון הבטיחות הביולוגית כשהאורות כבויים. הוסף 3 μL של הפפטיד האגוניסטי, Rhimi-K-1 (QFSPWGamide), מהמאגר (מהירות שאיפה: 3.1 μL/s) לתוך צלחת הבדיקה באמצעות מערכת הטיפול בנוזל (מהירות חלוקה: 3.1 μL / s) עם 384/12.5 μL טיפים.
       6. מניחים את הצלחת בקורא הצלחות מיד לאחר הוספת הפפטיד האגוניסטי. קרא את הלוח הן בכיוון קדימה והן בכיוון ההפוך באמצעות אותה תוכנית כמו בשלב 2.3.12.3

3. ניתוח נתונים

1. באמצעות תוכנת הניתוח המשויכת לקורא הצלחות המותקן במחשב, חשב את תגובות הפלואורסצנציה התאית (ב- RFU) עבור שתי הקריאות לאחר התוספת התרכובת הראשונה (קריאה ראשונה; _לפני RFU [טבלה משלימה S2]) ולאחר שלבי התוספת האגוניסטית (קריאה שנייה = _נמלת RFU [טבלה משלימה S2]). כל קריאה מתקבלת על ידי ממוצע של שני הערכים המתקבלים (לא מוצגים) על ידי קריאות הלוח קדימה ואחורה משלב 2.3.12.3 ושלב 2.3.12.6, בהתאמה.
   הערה: _לפני RFU, _נמלת RFU מתייחסת ליחידות הפלואורסצנטיות היחסיות של להיטי האגוניסט הפוטנציאליים (נקראים בשלב 2.3.12.3) וללהיטי האנטגוניסטים הפוטנציאליים (נקראים בשלב 2.3.12.6), בהתאמה.
2. ייצא את כל שלוש קבוצות הנתונים, RFU _bg, _{RFU לפני ונמלת} RFU, מתוכנת הניתוח לשלושה גיליונות אלקטרוניים נפרדים. כל גיליון אלקטרוני יכלול שתי עמודות בלבד: מיקום טוב ו- RFU גולמי (קבצים שאינם מוצגים כאן).
   הערה: _{RFU bg} מתייחס ל- RFU של הרקע שנקרא בשלב 2.3.11.2.
3. עצב את הנתונים משלושת הגיליונות האלקטרוניים וארגן את הנתונים לעיל בקובץ csv אחד (ראה את הדוגמה בטבלה המשלימה S2). הפחת את אות הרקע שנקרא _מלפני RFU _ומנמלת RFU, בהתאמה (עמודות G ו- H בטבלה המשלימה S2).
4. יבא את קובץ ה- csv לתוך "פלטפורמת נתונים מקוונת של HTS" הזמינה באופן מסחרי (ראה טבלת חומרים) לניתוח נתונים במורד הזרם (טבלה 1) ואחסון.
5. חשב באופן ידני את גורם Z עבור בקרת האיכות של כל בדיקת צלחת באמצעות משוואה (1):
   משוואה (1):
   (1)
   הערה: μ _c ו- μ_c+ מייצגים את ה_- RFUs הממוצעים של קריאות של אותן בארות, המשמשות כבקרות שליליות בתוספת הראשונה לאחר הוספת הממס (ממס ריק, n = 64; מספרים בכחול בטבלה משלימה S2) ומשמשות כבקרות חיוביות לאחר הוספת האגוניסט (ממס ריק + אגוניסט, n = 64; מספרים במגנטה), בהתאמה. בנוסף, σ _{c ו-} σ_c+ מייצגים את סטיות התקן (SDs) המתאימות שלהם.
6. בחר ידנית את מולקולות הפגיעה ממפות החום ב"פלטפורמת הנתונים המקוונת של HTS", וחשב את הפעלת האחוזים המנורמלת (NPA) והפעילות המעכבת (I_o) עבור להיטי האגוניסט ולהיטי האנטגוניסטים באמצעות משוואה (2) ומשוואה (3):
   (2)
   (3)

צלחת תרופות פנימית (SAC2-34-6170) המורכבת מ-320 מולקולות קטנות אקראיות שימשה להדגמת מבחן HTS זה כדוגמה. ל-HTS הייתה איכות בדיקה מצוינת עם מקדם Z' של 0.7 (טבלה 1). גורם Z' זה משקף את איכות הבדיקה ללא תלות בתרכובות שנבדקו³⁴. גורם Z′ של 0.5 ומעלה מציין טווח דינמי של אות בדיקה טוב בין ה- RFUs של הפקדים החיוביים לבין הבקרות השליליות. למבחנים עם גורם Z קטן מ-0.5 יש טווח דינמי של אות לא אופטימלי, הם בדרך כלל לא אינפורמטיביים לבחירת להיטים, ולכן הם מושלכים. התגובה (שנמדדה ביחידות פלואורסצנטיות יחסיות, RFU) מבוקרים חיוביים (RFU ממוצע של 64 תגובות בקרה חיוביות, μ_c+ = 130,139) הייתה בממוצע גבוהה פי 19 מזו של הבקרות השליליות (RFU ממוצע של 64 תגובות בקרה שליליות, μ_c- = 6,675). פלואורסצנטיות החיתוך לבחירת "להיטי אגוניסט" כאן הוגדרה ליחס מקסימלי של אחוז הפעלה מנורמל (NPA) של >50%. פלואורסצנטיות החיתוך לבחירת "פגיעות אנטגוניסטיות" הוגדרה לפעילות מעכבת נצפית (I_o) של >50%. נבחרו שלוש מולקולות פגיעה אגוניסטיות ושני פגיעות אנטגוניסטיות: SACC-0090237 (NPA = 153%), SACC-0036982 (NPA = 118%), ו- SACC-0006532 (NPA = 152%) כאגוניסטים, ו- SACC-0103392 (I o = 53%) ו- SACC-0041280 (I _o = 56%) כאנטגוניסטים (הנתונים הגולמיים מוצגים בטבלה המשלימה S2). דוגמאות לחישובים של NPA ו- I_o עבור אגוניסטים (שורות ירוקות) ואנטגוניסטים (שורות כתומות), בהתאמה, מוצגות בטבלה המשלימה S2.

תוספת תרכובת	μs1	σשניות	μג-	σג-	ערך Z'
	(n = 320)	(n = 320)	(n = 64)	(n = 64)
	9,212	18,130	6,675	1,895	0.7
תוספת פפטיד אגוניסטית	μ שניות	σשניות	μc+	σc+
	1,22,322	15,987	1,30,139	11,062

טבלה 1: סיכום תגובות התאים המנורמלים מכל הצלחת במבחן HTS. הממוצע (μ) וסטיית התקן (σ) מתקבלים מניתוח כספת CDD. קיצורים: HTS = סינון תפוקה גבוהה; RFUs = יחידות פלואורסצנטיות יחסיות; ¹שניות (דגימות) = 320 תרכובות שנבדקו; μ_s = הערך הממוצע של תגובות סלולריות (RFUs) מ-320 בארות; μ_c- = הערך הממוצע של RFUs מבקרות שליליות; μ_c+ = הערך הממוצע של RFUs מבוקרים חיוביים; σ_s = סטיית תקן של תגובות סלולריות (RFUs) מ-320 בארות; σ_c- = סטיית תקן של RFUs מבקרות שליליות; σ_c+ = סטיית תקן של RFUs מבקרות חיוביות.

טבלה משלימה S1: תוכניות מותאמות אישית של מערכת הטיפול בנוזלים לשלבי הצנרת האוטומטיים. טבלה זו שונתה מ- Xiong et ^al.31. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

טבלה משלימה S2: הנתונים הגולמיים של התוצאות המייצגות. השורות המודגשות בירוק מייצגות את הלהיטים האגוניסטיים, והשורות המודגשות בכתום מייצגות את להיטי היריבים. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

המטרה של HTS היא לזהות מולקולות פגיעות באמצעות סינון מספר עצום של מולקולות קטנות. לכן, התוצאות מדוגמה זו מייצגות רק חלק קטן מניסוי HTS קונבנציונלי. יתר על כן, מולקולות הפגיעה שזוהו צריכות להיות מאומתות במבחנים במורד הזרם, כגון בדיקה תלוית מינון על אותו קו תאים רקומביננטי ועל קו תאים CHO-K1 הנושא רק את הווקטור הריק, אשר ניתן לבצע בו זמנית כדי להציל מולקולות קטנות. מבחני ציטוטוקסיות יסייעו להוכיח כי חוסר תגובה בתוספת השנייה אינו נובע מתמותת תאים. יש לבצע בדיקות ביולוגיות אחרות כדי לאמת את הפעילות ברקמות המבודדות במבחנה, או על ידי יישום או הזנה של המולקולות הקטנות לפרוקי רגליים חיים. את הצינור המלא של זיהוי ליגנד במולקולות קטנות של קולטן הקרצייה קינין ניתן למצוא בפרסום קודם³¹. באמצעות צינור זה זוהו בסך הכל 36 פגיעות אנטגוניסטיות של קולטן קינין הקרציות. שלושה מהאנטגוניסטים הללו נבדקו עוד יותר בבדיקת התכווצות רקמות והראו פעילות אנטי-מיוטרופית על היתוש האחורי, שם קולטני קינין יתושים אורתולוגיים באים לידי ביטוי³¹.

כל קו תאים המבטא GPCR צריך להיות מאומת לתנאי ניסוי מתאימים לפני ביצוע HTS. תנאים אלה כוללים את צפיפות התאים (10,000 תאים לבאר), ריכוז התרכובות הנבדקות (2 μM), ריכוז ה- DMSO הסופי (0.2%) בבדיקה, ריכוז הליגנד האגוניסטי המשמש לתוספת השנייה (1 μM), מהירות ועומק הפיפטינג, וזמן הקריאה לאחר הוספת הפפטיד האגוניסט (5 דקות). זה קריטי להתאים את העומק והמהירות של מערכת הטיפול בנוזלים כדי להבטיח ששלבי החלוקה לא יפריעו לתאים אם התאים דבקים. האימות של תנאים אלה לפני היציאה ל- HTS יסייע בפתרון בעיות אם איכות הבדיקה ירודה. חשוב שהתאים יהיו בתנאים אופטימליים: התאים צריכים להגיע למפגש של 90%-100% אך לא להיות בעלי צפיפות יתר בצלחת התא כאשר משתמשים בהם עבור HTS. אם אותות הרקע בבארות מסוימות נמוכים או גבוהים באופן חריג, לאחר אישור תחת המיקרוסקופ לצפיפות תאים נמוכה או גבוהה בעליל, יש להסיר את החריגים באופן ידני בעת ניתוח הנתונים. לפני התאמת בדיקת הסידן הפלואורסצנטי ל- HTS, העקומה הקינטית של הפפטיד החיובי חייבת להיות ידועה, שכן התגובה הקינטית של התאים לפפטיד האגוניסט צריכה להימשך 1-2 דקות כדי שהיא תותאם למבחן HTS ותימשך מספיק זמן כדי לקרוא את הצלחת כולה. כדי להשיג את האות הממושך, יש ליישם ריכוז גבוה יחסית של הפפטיד האגוניסטי, או לבדוק צפיפות תאים גבוהה יותר. אם התגובה הקינטית של תאי הקולטן המסוימים קצרה מדי (נמשכת פחות מדקה אחת), מומלץ לקרוא במהירות גבוהה יותר בקריאת נקודת הקצה או להשתמש רק בחלק מהצלחת עבור HTS. אין ספק שאיכות קו התאים הרקומביננטיים ביחס לרמת ביטוי הקולטן חיונית להצלחה. סביר להניח שקווי תאי שבלולית שונים ישתנו, שכן החדרת הפלסמיד היא אקראית בגנום, וזה בהחלט יכול להשפיע על ביטוי הקולטן. זה יהיה אידיאלי לשלב בדיקת סידן פלואורסצנטית מוקדמת של המאגר הטרנספקטיבי ובמהלך תהליך בחירת קווי התאים הקלוניים.

המגבלה של בדיקת הסידן הפלואורסצנטי היא שהיא מודדת את פעילותם של השליחים המשניים במקום את הקשירה הישירה של הליגנד לקולטן. למרות שניתן לשלול את פגיעות האגוניסט מחוץ למטרה על ידי סינון מולקולות הפגיעה על התאים שאינם מבטאים את קולטן המטרה, לא ניתן לשלול לחלוטין את מולקולות הפגיעה של האנטגוניסט מחוץ למטרה באמצעות בדיקה זו מכיוון שייתכן שמולקולות מסוימות עשויות לעכב את מסלולי שחרור הסידן התאיים במורד הזרם של איתות ה- GPCR. לכן, יש צורך באימות נוסף באמצעות בדיקת קשירת ליגנד או בדיקה ביולוגית לאימות ברמת האורגניזם, כגון בבדיקת רקמת קרציות עם אגוניסט ידוע, כפי שנעשה בעבר עם יתושים³¹.

רוב המבחנים הפונקציונליים שמזהים הפעלת GPCR מודדים בעיקר אירועים תוך-תאיים בשני מסלולי איתות עיקריים: מסלולים תלויי חלבון G ומסלולים שאינם תלויים בחלבון G. מבחנים תלויי חלבון G מודדים Ca²⁺, אינוזיטול טריפוספט (IP₃), או ריכוזי cAMP, בעוד שבדיקות שאינן תלויות בחלבון G מזהות בעיקר סחר בקולטנים או גיוס β-arrestin⁷. מבחנים שונים משתמשים בטכנולוגיות שונות לקריאה, כגון צבעים רגישים ל-Ca 2+ (מבחני פלואורסצנציה), פוטופרוטאינים כגון aequorins (מבחני Ca²⁺ bioluminescence)¹⁴, חלבונים פלואורסצנטיים מתויגים, מבחנים מבוססי העברת אנרגיה בתהודה פלואורסצנטית (FRET), מבחנים מבוססי העברת אנרגיה בתהודה ביולוגית (BRET), או מבחנים תאיים מבוססי ביוסנסור אופטי ללא תווית. מבחנים אלה וטכנולוגיות הקריאה הזמינות המתאימות נבדקו בפירוט על ידי ג'אנג ושיה³⁵. חלק מהמבחנים ישימים לכל GPCRs, וחלקם ספציפיים ל-GPCRs מסוימים (לדוגמה, בדיקת Ca²⁺ עבור קולטנים מצומדים G q, cAMP עבור קולטנים מצומדים_{G i / o} או_{G s}). עם זאת, על ידי ביטוי משותף מופקר של חלבוני G מסוימים עם הקולטן בתאים הרקומביננטיים, ניתן לשנות את מסלול האיתות. לדוגמה, חלבוני G_q15/16 יכולים לבוא לידי ביטוי משותף עם קולטנים שאינם מצומדים ל-Gq עבור זיהוי איתות PLC-IP_3-Ca ^{2+ 7,36}. בניגוד למבחנים המודדים אירוע מולקולרי יחיד, ישנם מבחני ניתוח בעלי תוכן גבוה, אשר אוספים כמות עצומה של נתונים ביולוגיים כדי לשפר את הספציפיות של הליגנד³⁷. סוג זה של בדיקה הוא גם מורכב יותר ויקר יותר לביצוע⁷.

במחקר חסרי חוליות, המבחנים הפונקציונליים הנפוצים ביותר מזהים הפעלת GPCR על ידי ניתוח התנודות בריכוזים של שליחים שניים, כגון Ca²⁺ או cAMP. בשל ההבדלים במסלולי האיתות בין יונקים לחסרי חוליות, רוב טכנולוגיות הקריאה האחרות שהוזכרו לעיל עדיין לא אומצו באופן נרחב עבור מחקרי GPCR של חסרי חוליות. עם זאת, חלבוני G נשמרים יחסית ברחבי ממלכת החי. לאחרונה, Lismont et ^al.38 הראו כי ניתן להתאים כמה ביוסנסורים של חלבון G המבוססים על BRET אנושיים גם כדי לזהות את ההפעלה של GPCR חרק כאשר הם באים לידי ביטוי משותף בתאים הרקומביננטיים של הקולטן. על ידי ביטוי משותף של כל אחד מהביוסנסורים השונים המבוססים על חלבון G (G_s, G_i/o, G q/11 או G_12/13) עם GPCRs ספציפיים, ניתן להבהיר את מנגנון צימוד החלבון G. במחקר שנערך על ידי Lismont et ^al.38, ה-Schgr-CRF-DH יכול היה להפעיל באופן תלוי מינון את הביוסנסורים G_i/o ו-G q/11 ולא הפעיל את הביוסנסורים G_s ו-G_12/13.

בסך הכל, בדיקת הסידן הפלואורסצנטית המבוצעת בצלחת של 384 בארות בשילוב עם גישת "התוספת הכפולה" המתוארת כאן מאפשרת סינון של עשרות אלפי מולקולות בזמן קצר יחסית. זוהי גישה חסכונית יחסית בזמן ובמחיר לגילוי מולקולות פגיעה עבור אימותים ויישומים במורד הזרם.

למחברים אין ניגוד עניינים לחשוף.

עבודה זו נתמכה על ידי פרס USDA-NIFA-AFRI לבריאות ורווחת בעלי חיים (פרס מספר 2022-67015-36336, PVP [מנהל הפרויקט]) ומקרנות תחרותיות מתוכנית המענקים למחלות וקטוריות חרקים של טקסס A&M AgriLife (FY'22-23) ל- P.V.P. קבוצת הסגל A.W.E.S.O.M.E. של המכללה לחקלאות ומדעי החיים, TAMU, מוכרת על עזרה בעריכת כתב היד. טבלה משלימה S2 מכילה נתונים מספריית מולקולות קטנות פנימית, אקראית, שהתקבלו ממעבדתו של ד"ר ג'יימס סאצ'טיני באוניברסיטת A&M בטקסס A&M AgriLife Research.