Erythrocyte Sedimentation Rate: אפיון מונחה פיזיקה בהקשר רפואי

שיעור שקיעת אריתרוציטים (ESR) הוא פרמטר פיזי, המשמש לעתים קרובות בבדיקות בריאות שגרתיות ואבחון רפואי. לאחרונה פותח מודל תיאורטי המאפשר לחלץ פרמטרים בעלי משמעות פיזיקלית מכל עקומת השיקוע, המבוסס על ידע קולואידי מודרני. כאן, אנו מציגים פרוטוקול לאיסוף אוטומטי של ESR לאורך זמן, ומחלצים את הפרמטרים של מודל עדכני זה מאיסוף נתונים אוטומטי זה. פרמטרים מעודנים אלה עשויים לשפר גם את העדות הרפואית.

שיעור שקיעת אריתרוציטים (או תאי דם אדומים) (ESR) הוא פרמטר נגזר פיזי של דם המשמש לעתים קרובות בבדיקות בריאות שגרתיות ואבחון רפואי. לדוגמה, במקרה של דלקת, ESR גבוה יותר הוא ציין בשל הגידול הקשורים פיברינוגן וחלבונים פלזמה אחרים. הוא האמין כי עלייה זו נובעת היווצרות של אגרגטים גדולים יותר של תאי דם אדומים (RBCs) שנגרמו על ידי הגידול בפיברינוגן. ואכן, פיברינוגן הוא צבירה המעודדת סוכנים של RBCs ובמשטר סטוקס - מניחים שהוא נצפה במשקעים אגרגטים גדולים יותר בדם. עם זאת, כל המודלים של מדידות ESR המבוססים על השערה זו דורשים הנחות פיזיקליות ספציפיות נוספות, שאינן נדרשות בשום מערכת אחרת. חוץ מזה, מחקרים מודרניים בתחום המתלים הקולואידים הוכיחו כי חלקיקים אטרקטיביים יוצרים אגרגטים מחלחלים (כלומר אגרגטים רחבים כמו המיכל). השקיעה של קולואידים אלה באה לאחר מה שמכונה "קריסת ג'ל קולואידית". לאחרונה, הוכח כי RBCs למעשה בצע את אותה התנהגות. השערה זו מאפשרת גם למדל באופן יעיל ואנליטי את עקומת השקיעה של RBCs, שממנה ניתן לחלץ תיאורים חזקים ובעלי משמעות פיזית. כתב יד זה מתאר כיצד לבצע ניתוח כזה, ודן ביתרונות של גישה זו.

שיעור שקיעת כדורית הדם (ESR) הוא כלי קליני רפואי במבחנה, שהוצג רשמית ברפואה מבוססת ראיות במהלך המאה העשרים 1,2,3,4. כיום משתמשים בו ברחבי העולם כבדיקה דלקתית לא ספציפית, או כדי לעקוב אחר האבולוציה של כמה תנאים ספציפיים 5,6,7,8. זאת בעיקר בשל עלייה בריכוז הפיברינוגן, אך גם ברכיבי פלזמה אחרים כגון IgM 1,9,10,11. על פי הפרוטוקול הסטנדרטי הנוכחי של Westergren, ערכי ESR מדווחים כמדידה של שכבת פלזמה נטולת תאים בנקודת זמן נתונה (30 דקות או 1 שעות) לאחר השארת צינור אנכי בגודל טיפוסי של 20 ס"מ אנכית במנוחה¹². עם זאת, שיטת מדידה זו זכתה לביקורת מכיוון שדווחו שלבים שונים מבחינה איכותית בתהליך השיקוע, כולל עיכוב לפני הגעה למהירות השיקוע המרבית¹³. עיכוב זה נמשך יותר משעה בכמחצית מהדגימות הבריאות¹⁴. המהירות בשלב זה מצייתת לקנה מידה שונה מאשר בשלב השני, המהיר יותר, של שיקוע¹⁵. הגבלת הקריאה למהירות השקיעה הממוצעת במהלך השעה הראשונה ואז משווה תערובת שונה של תכונות דם שונות בין אנשים שונים.

יתר על כן, לאחרונה הוכח כי השיקולים התיאורטיים הרגילים מאחורי פרוטוקול זה היו שגויים^16,17,18. בהמטוקריט פיזיולוגי (מעל כ-25%), תאי דם אדומים (RBCs) אינם משקעים כאגרגטים נפרדים, אלא כרשת רציפה, מה שנקרא חלחול, של RBCs 17,18, המצייתת למערכת שונה של משוואות פיזיקליות מאשר שקיעת סטוקס ^16,17 המוזכרת בדרך כלל. הוכח כי התחשבות בתיאור פיזי המבוסס על מדידות שנפתרו בזמן של השקיעה (העקומה כולה) הייתה חזקה יותר בכמה הקשרים רפואיים חדשים^19,20. יתר על כן, מדידות אלה יכולות לשמש כדי לשפוך אור על המנגנונים הפיזיים המשנים את ESR בפתולוגיות שבהן צורות התא משתנות^19,20. בנוסף, ESR איטי יכול להיות פרשנות רפואית שימושית, כפי שצוין במדידות של קבוצה של חולי תסמונת neuroacanthocytosis^19,20. מאמר זה סוקר כיצד ליישם באופן מעשי את המדידה של פרמטרים בעלי משמעות פיזית, בהתבסס על קינטיקה ESR כולה. ליתר דיוק, השיטה המוצגת כאן מחלצת את מהירות השקיעה המקסימלית U_m, שערכה ניתן לתקן כדי לשקול את השפעת ההמטוקריט של התורם^16,17. פרמטר זה מדויק יותר ולכן אמין יותר מהמדידה המסורתית^16,17,19,20.

בנוסף, בכמה מחקרים בסיסיים, במקום לפקח על מצב דלקת של חולה נתון, מעניין להוציא את ההשפעה של המטוקריט על ESR 21,22,23, או לחקור את התפקיד של RBCs ב ESR שונה 19,20,24,25 בין תורמים שונים. כדאי להשוות דגימות שאינן ישירות דגימות דם מלאות מחולים. לכן, השעיה מחדש של RBCs עם המטוקריט מבוקר בפלזמה האוטולוגית, או בתחליף פלזמה, עשויה לשמש כצעד הראשון של מדידת ESR. לדוגמה, תמיסות של דקסטרן 70 kDa עם ריכוז של 55 מ"ג/מ"ל במי מלח חוצצים פוספט (PBS) מייצרות טווח שיקוע בטווח הבקרה לתאים בריאים¹⁹. כתב יד זה מראה גם כיצד יש לבצע צעדים כאלה, וכי הניתוח המוצג רלוונטי גם במקרים אלה.

איסוף דגימות דם וניסויים אושרו על ידי "Ärztekammer des Saarlandes", ethics votum 51/18, ובוצעו לאחר שהתקבלה הסכמה מדעת על פי הצהרת הלסינקי. מדידות סטנדרטיות יש לבצע עם חומצה ethylenediaminetetraacetic (EDTA)-דם נוגד קרישה (ריכוז EDTA סטנדרטי של 1.6 מ"ג / מ"ל דם, הנורמה האירופית NF EN ISO 6710), בצינורות Westergren. הנפח הדרוש למילוי צינור ווסטרגרן תלוי ביצרן (מכיוון שחלקים נמוכים יותר מכילים לפעמים מאגר רחב יותר); נפח צריך להיות כ 1 מ"ל של דם מלא, ו 800 μL עבור צינורות המצוין בטבלת החומרים. עם זאת, השיטה המתוארת להלן תקפה ללא קשר לתרחיף הספציפי ולצורת המיכל, כל עוד ההמטוקריט של הדגימות הנבדקות גבוה מ- 25%¹⁶. לכן יש לבחור נפחים, מכולות, מדיום תרחיף ותוספים בהתאם למטרות הספציפיות של המחקר שבוצע.

1. ניסויים ומדידות

הערה: רשום את קצב השקיעה של הדגימה בכל דקה.

1. הכנת מדגם (במידת הצורך): אם נדרש המטוקריט בקרה או נוזל מרחף, התחל בשטיפת התאים והכנת הדגימות (כדוגמה, אנו מראים כיצד להכין דגימות עם רמות פיברינוגן שונות, על ידי ערבוב סרום אוטולוגי ופלזמה). סרום אכן יכול להיות משוער כמו פלזמה נטולת פיברינוגן^26,27, והוא יכול לשמש על מנת להפחית את הצבירה של RBCs^, בתנאים פיזיולוגיים אחרים. על מנת להכין מספר דגימות, לאסוף את הדם בצינורות EDTA סטנדרטיים של 9 מ"ל ואת הסרום בצינורות סרום סטנדרטיים (עם חרוזי סיליקה כמפעילי קרישה) של 9 מ"ל.
   1. צנטריפוגה את דגימות הדם (כלומר, 9 מ"ל של צינורות EDTA סטנדרטיים וסרום בדוגמה שנבחרה) ב 3,000 x גרם במשך 7 דקות לפחות, לדחיסה אופטימלית של אריתרוציטים ארוזים. החליפו את הסופרנאטנט ב-PBS או בנוזל המרחף הרצוי, אם יש כמות מספקת זמינה. אם זה פשוט נדרש כדי לשלוט hematocrit בפלזמה אוטולוגית, להמשיך ישירות לשלב 1.1.3. אחרת, מערבבים בעדינות לאחר הכללת הסופרנאטנט לשטיפה.
   2. חזור על הפעולה שלוש פעמים. בצע את הכביסה האחרונה עם נוזל ההרחיה הרצוי בכל מקרה.
      1. בדוגמה שנבחרה, הכינו תערובות של פלזמה וסרום אוטולוגיים עם פרופורציות קבועות (למשל, 25%/75%, 50%/50%, או 75%/25% מחלק נפח הפלסמה-סרום). לדוגמה, בעת הכנת 2.5 מ"ל של תערובת 25%/75% פלזמה בסרום, להוסיף 0.625 מ"ל של פלזמה ל 1.875 מ"ל של סרום.
   3. חלץ את הנפח הנדרש של תאים ארוזים ולהשעות אותו בנוזל הרצוי. מעבדים את התאים הארוזים כנוזל צמיג מאוד (באמצעות קדם-פיפטינג סטנדרטי ו/או פיפטינג הפוך או פיפטה עם תזוזה חיובית²⁸). בדוגמה שנבחרה, עבור מדגם 4 מ"ל בהמטוקריט של 45%, להשעות 1.8 מ"ל של תאים ארוזים בתוך 2.2 מ"ל של תערובת פלסמה-סרום.
2. אם ההמטוקריט של המדגם אינו נשלט, לקבוע אותו על ידי מיקרוצנטריפוגה במהירות גבוהה (שיטות סטנדרטיות אחרות מתאימות גם).
   1. חלץ את כמות הדגימה הנדרשת לקביעת המטוקריט: מלא את נימי המיקרו-המטוקריט על ידי טבילת קצהו התחתון בנוזל. עצור אותו על ידי כיסוי הפתח העליון כאשר כמות הדגימה הנדרשת עולה בצינור על ידי יניקה נימית.
   2. אוטמים את הנימים בשעווה אוטמת. הכניסו אותם לצנטריפוגת המיקרו-המטוקריט והפעילו אותה במהירות של 15,000 x גרם (12,000 סל"ד) למשך 5 דקות, או לפי הוראות היצרן.
   3. קרא את רמת המטוקריט על הנימים ולרשום אותו לעיון.
3. הגדירו מצלמה לתיעוד שקיעת הדגימות. כדי למנוע עומס יתר על הזיכרון או ריקון הסוללה, הפעל את ההתקן מרשת החשמל ושמור את התמונות ישירות במחשב או בכונן קשיח חיצוני.
   1. התקן מצלמה יציבה מול המחזיק שבו צינורות ESR יישארו במנוחה. השתמש ברקע לבן ומואר (גיליונות נייר לבנים ברקע עובדים בצורה מושלמת).
   2. באמצעות צינורות Westergren ריקים, רצוי ללא סימונים, להגדיר את המיקוד ואת שדה הראייה של המצלמה כדי לקבל את הרזולוציה הגבוהה ביותר שבו הדגימות ימוקמו. רצוי, ודא שגבולות התמונות מיושרים בכיוון האנכי והאופקי.
   3. צלם תמונה של צינור שקנה המידה שלו השתנה כדי לחלץ את רזולוציית הפיקסל. מומלץ להשתמש בתמונות RGB.
   4. הגדר את האור ואת זמן החשיפה של המצלמה כך שיהיה רקע לבן, אך ללא רוויה. הדוגמה באיור 1 התקבלה באמצעות Canon EOS M50, עם זמן חשיפה של 1/15 שניות, צמצם של F8.0, איזון לבן של טונגסטן, במצב צילום בודד עם מיקוד ידני, ומהירות ISO של 1,000.
4. הכן ומקם את צינורות ה- ESR.
   1. מלא את המיכל התחתון של צינור Westergren עם נפח המתאים להוראות היצרן. הכנס את צינור Westergren במיכל התחתון כפי שצוין על ידי היצרן.
   2. ברגע שהצינור הראשון מוכן, הניחו אותו במחזיק והתחילו את הקלטת המצלמה. הקלטת תמונה אחת בכל דקה בדרך כלל נותנת רזולוציה טובה של העקומה הקינטית ESR.
   3. הכינו והניחו את הדגימות הבאות. הקפד לא לעמוד מול שום דגימה בעת צילום תמונה.
   4. תן למדידות לרוץ לפחות שעתיים, כדי להשוות למדידות סטנדרטיות של 30 דקות, שעה ושעתיים. עם זאת, עדיף גם לראות את הרוויה ואת המעצר של משקעים. עבור דגימות בריאות, או במקרה של דלקת, רישום הדגימות במשך הלילה, בין 12 שעות ל 24 שעות, הוא יותר ממספיק מאז העקמומיות של הדגימות המהירות ביותר נראה בתוך 3 שעות^13,19. עם זאת, אם מצב מסוים מקטין את מהירות השקיעה, כפי שעושה ירידה בריכוז הפיברינוגן (כלומר, בדוגמה שנבחרה, מקטע נפח גבוה בסרום), הקלטות של 50 שעות או יותר עשויות להידרש כדי לקבל את המידע המדויק ביותר^16,19.

2. ניתוח תמונות

הערה: לאחר הקלטת התמונות, חלץ את עקומת ה- ESR. דוגמה לקוד Matlab מסופקת כקובץ משלים 1 (MatlabCodeImageAnalysisSampled.m).

1. בחר או זהה אזור עניין (ROI) שבו רק צינורית אחת גלויה, כאשר הגבול התחתון ממוקם מתחת למיקום הנמוך ביותר של ממשק פלזמה ללא תאי אריתרוציטים אך בתוך הדגימה (ראה איור 1A, B). במידת הצורך, סובב את התמונה כך שהכיוון האנכי מיושר לאורך הרכיב הראשון של התמונה.
2. המר את החזר ההשקעה של תמונת RGB לתמונה בקנה מידה אפור או למטריצה Gr. בדרך כלל, שילוב שלושת הערוצים (אדום [R], ירוק [G] וכחול [B]) כ- Gr = 2 * R - B - G יעיל מאוד עם רקע ברור (ראה איור 1C ו- MatlabCodeImageAnalysisSampled.m שורות 121-128).
3. בינאריזציה של התמונה. עבור דגימה בריאה, שימוש בסף^{Otsu 29} בדרך כלל נותן תוצאה עקבית (ראה איור 1D ושורה 133 של MatlabCodeImageAnalysisSampled.m). עבור דגימות עם המטוקריט גבוה או עם המוליזה מסוימת, ייתכן שעדיף להתאים אותו ידנית או להשתמש בשיטה אוטומטית אחרת (כפי שנעשה בשורות 129-131 של MatlabCodeImageAnalysisSampled.m), בהתאם לניגודיות המדויקת המתקבלת בין השלבים השונים בתוך הצינור.
4. קבל את הממוצע של ערכי הפיקסלים (או הרכיבים) של Gr לאורך הכיוון האופקי. שלב זה ממזער את הרעש וממוצע ביעילות את אי הסדירות האפשרית בממשק (ראה איור 1E ו- MatlabCodeImageAnalysisSampled.m שורה 137).
5. לפני חישוב הווריאציות, החליקו את העקומה עם ממוצע נע, במיוחד אם הצינורות מכילים כמה סימונים אופקיים (ראו איור 1F). עבור הדוגמאות שסופקו, חלון נע של ~ 2.5 מ"מ (50 פיקסלים) שימש לתהליך זה (ראה שורה 138 של MatlabCodeImageAnalysisSampled.m). לאחר מכן, זהו את מיקום הממשק כנקודה עם שונות העוצמה הגבוהה ביותר (ראו איור 1G).
6. חזור על הפעולה עבור כל תמונה וכל דוגמה. עבור כל מדגם, שמור את מיקומי הממשק לאורך זמן בפורמט מתאים כדי להתאים את המודל הפיזי עם כל תוכנה מתאימה.

3. התאמת המודל הפיזי

1. באמצעות כל תוכנה מתאימה, לדעת את המטוקריט ואת הגובה ההתחלתי של עמודת הדם h 0, למצוא את הערכים של זמן עיכוב t₀, זמן חסר ממד γ, ואת חלק נפח ארוז הסופי Φ_mשל אריתרוציטים הממזער את סכום סטיות שיורית בריבוע עבור המודל הפיזיקלי¹⁷. קוד Matlab (ShapeAnalyzerIntegrated.m) מסופק כקובץ משלים 2 כדוגמה לביצוע התאמה כזו. ראו קובץ משלים 2 להוראות נוספות. כפי שתואר במקום אחר^16,17, אריתרוציטים במשקעים המטוקריט פיזיולוגיים כג'ל חלקיקים רכים, כאשר הפרמטרים הפיזיים החשובים הם ההבדל בצפיפות בין הפלזמה לבין RBCs של התורם Δρ, הקוטר האופייני של RBC r_RBC, צמיגות הפלזמה בטמפרטורת החדר η^, וההמטוקריט של התורם Φ . באמצעות פרמטרים אלה, ובהנחה שהלחץ הכבידתי הוא התהליך המניע העיקרי של הפלזמה לזרום כלפי מעלה דרך הרשת הנקבובית שנוצרה על ידי אריתרוציטים לאחר זמן עיכוב t₀, מקבלים את האבולוציה הטמפורלית^16,17:
   
   עם , , ו - הוא רדיוס הדיסק הממוצע של אריתרוציטים. דוגמה לקוד Matlab המבצע זאת מסופקת כקובץ מצורף (ShapeAnalyzerIntegrated.m מתאים לפונקציה המוגדרת ב- SedimFit.m [קובץ משלים 3]). לחלופין, G/γ יכול לשמש גם ישירות כפרמטר התאמה עם יחידות של 1/t.
2. לאחר חילוץ העקומה הכמותית מהתמונה, שמור את הפרמטרים הפיזיים של המדגם. עדיין ניתן לחלץ מהעקומה ערכי ESR מסורתיים של 30 דקות, שעה או שעתיים לצורך הפניה (ראה שורות ShapeAnalyzerIntegrated.m 123-132).

דוגמה לרצף תמונות שנרכש כהלכה מסופקת כסרט משלים 1 (MovieS1.avi). סדרה של התאמות אופייניות של המודל מוצגת עבור תנאים שונים באיור 2. ריכוז הפיברינוגן נקבע מריכוז הפיברינוגן בפלזמה Fib₀, בהנחה שבסרום אין פיברינוגן כלל. לפיכך, Fib = C Fib₀, כאשר C הוא חלק נפח הפלזמה בתערובת פלסמה-סרום. במחקרים קודמים¹⁶, Fib₀ נקבע בשיטות סטנדרטיות במעבדה לכימיה קלינית של בית החולים האוניברסיטאי סארלנד (הומבורג, גרמניה). אם יש צורך למדוד כמות כזו באופן עצמאי, שיטה נוחה לקביעת ריכוז פיברינוגן כוללת מדי קרישה כדוריים אוטומטיים (למחצה), אשר עשויים לדרוש גם קבלת דגימת דם נוגדת קרישה ציטראט מהתורם³⁰. עקומות ESR מהמחקרים שיצרו עקומות אלה יכולות להיות מצוידות במקדם פירסון R 2 [0.974, 0.9996], עם ממוצע של 0.996 וסטיית תקן של 0.004 (רק עקומה אחת מתוך 35 נתנה R² < 0.99). הפרמטרים שחולצו בסופו של דבר הם ההמטוקריט הסופי בשלב RBC Φ_m, זמן העיכוב t₀ - הדרוש לג'ל להישבר ולהתחיל לקרוס - והמהירות המיידית המקסימלית , שהושגה בתחילת הקריסה. הפרמטר חסר הממדים γ משויך להופכי של אזור הנקבוביות ברשת הדחיסה של RBCs (מבוטא בכפולות של רדיוס חלקיקים), Δρ הוא ההבדל בצפיפות בין הפלזמה לבין RBCs של התורם, a הוא הקוטר האופייני של RBC, η הוא צמיגות הפלזמה בטמפרטורת החדר, ו- Φ הוא המטוקריט של התורם. ההתאמה מבוצעת למעשה על ידי תיקון Δρ,a,η ו- Φ ולאחר מכן קביעת γ, Φ_m ו- t₀ הטובים ביותר. ההמטוקריט צריך להיקבע באופן עצמאי באמצעות שיטה סטנדרטית אחרת, בעוד השני יכול להיות קבוע בערכים סטנדרטיים (Δρ80kg/m^{3 31,32}, η1.5 mPa s ^33, ו 4מיקרומטר). כל סטייה של הפרמטרים האחרים פשוט תשנה את הערך שנקבע של γ על ידי גורם מתאים, אך לא תשנה את הקביעה הסופית של U_m, שהוא אז פרמטר חזק בהקשר זה.

אוספים של ערכי פרמטרים שנאספו במחקרים בסיסיים קודמים, המראים את מגמות הפרמטרים כפונקציה של רמות המטוקריט ופיברינוגן, מוצגים באיור 3 ובאיור 4.

איור 1: עיבוד תמונה . (A) תצוגה אידיאלית של מספר דגימות, עם החזר השקעה רלוונטי, מסומן עבור מדגם אחד. (B) זום על החזר ההשקעה שנבחר. (C) המרה של החזר ההשקעה הצבעוני לרמה אפורה. (D) תמונה בינארית המתקבלת עם סף אוטסו. (E) העוצמה הממוצעת האופקית של התמונה הבינארית כפונקציה של הגובה (לפי המוסכמה הרגילה בעיבוד תמונה, המקור נחשב לחלק העליון של התמונה; ראה גם שלב 2.4 של הפרוטוקול). (F) החלקה של העוצמה על ידי ביצוע ממוצע נע בשכונה אנכית של 50 פיקסלים (ראה גם שלב 2.5 של הפרוטוקול). (G) וריאציות של העוצמה המוחלקת לאורך הכיוון האנכי. המיקום של הערך המקסימלי המוחלט נלקח כמיקום הממשק (ראה גם שלב 2.5 של הפרוטוקול). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 2: התאמות אופייניות. (A) עקומות והתאמות המתקבלות עבור תורם בריא, עם המטוקריטים מותאמים שונים. העקומות מותאמות ממחקר קודם¹⁷. (B) עקומות והתאמות המתקבלות עבור תורם בריא, עם ריכוזי פיברינוגן שונים. ריכוזי פיברינוגן שונים התקבלו על ידי ערבוב פלזמה וסרום אוטולוגיים בפרופורציות שונות. העקומות והנתונים הם ממחקר קודם¹⁶. קווי שגיאה (המתקבלים מרזולוציית פיקסלים או מסטטיסטיקת התאמה) קטנים יותר מגודל הסמל. האיורים הודפסו מחדש באישור Dasanna et al.16 (18 דגימות מארבעה רישומי דם עצמאיים) ו-Darras et al.17 (¹⁶ דגימות משבעה רישומי דם עצמאיים). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 3: ערכים אופייניים של הפרמטרים שחולצו עבור המטוקריטים שונים . (A) וריאציה של מהירות השיקוע המרבית המופקת U_mכפונקציה של המטוקריט הדגימה Φ. מעגלים הם מדידות בודדות; צבעים שונים קשורים לתורמים בריאים שונים. הקו האדום הרציף הוא המגמה שנחזה על ידי המודל, המתקבלת עם הערכים הממוצעים של Φ_m ו- γ. הערך המתוקן של U_mעבור המטוקריט של Φ = 0.45 מוצג גם הוא, הן כמשולשים עבור ערכים בודדים והן כקו ישר עבור הקבוע החזוי של המודל. ערך מתוקן זה חושב על פי המודל כ - . (B) ערכים המתקבלים עבור הפרמטר γ. (C) ערכים שהתקבלו עבור הפרמטר Φ_m. (D) ערכים המתקבלים עבור הפרמטר t₀. קווי שגיאה עבור נתונים בודדים המתקבלים מסטטיסטיקת התאמה קטנים יותר מגודל הסמל. נתון זה הותאם באישור Darras et ^al.17. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 4: ערכים אופייניים של הפרמטרים שחולצו עבור ריכוזי פיברינוגנים שונים . (A) וריאציה של מהירות השיקוע המקסימלית המופקת U_mכפונקציה של ריכוז הפיברינוגן של הדגימה. צבעים שונים קשורים לתורמים בריאים שונים. (B) ערכים המתקבלים עבור הפרמטר γ. (C) ערכים שהתקבלו עבור הפרמטר Φ_m. (D) ערכים המתקבלים עבור הפרמטר t₀. קווי שגיאה עבור נתונים בודדים המתקבלים מסטטיסטיקת התאמה קטנים יותר מגודל הסמל. נתון זה הודפס מחדש באישור Dasanna et ^al.16. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

סרט משלים 1: דוגמה לרצף תמונות שנרכש כהלכה. סוגים שונים של דגימות מוצגים בתמונות אלה משני תורמים שונים (אותה קבוצת דם). משמאל לימין, כל הדגימות שיש כפילויות: דם מלא מתורם 1, השעיה של RBCs מתורם 1 בדקסטרן 70 kDa (55 מ"ג / מ"ל PBS) עם המטוקריט מבוקר ב 45%, דם מלא מתורם 2, השעיית RBCs מתורם 2 בדקסטרן (45% המטוקריט), השעיית RBCs מתורם 1 בפלזמה של תורם 2 (45% המטוקריט), והשעיה של RBCs מתורם 2 בפלזמה של תורם 1 (45% המטוקריט). לדגימות יש טווח רחב של מהירויות שיקוע, והמתלים בדקסטרן מראים גם המוליזה. עם זאת, הקוד שסופק MatlabCodeImageAnalysisSampled.m מנתח ביעילות את כולם. אנא לחץ כאן כדי להוריד סרט זה.

קובץ משלים 1: MatlabCodeImageAnalysisSampled.m. הקוד הראשי המשמש לניתוח התמונה (שלב 2 של הפרוטוקול). כדי להפעיל את הקוד במכשיר מסוים, יש לשנות את שורה 8. הוא צריך להכיל את הנתיב לתיקייה המכילה את התמונות של צינורות Westergren לנתח, מסתיים עם הקידומת של התמונות, אם בכלל. ערכה של תמונות דחוסות זמינה להורדה בגישה פתוחה ב-Zenodo (DOI: 10.5281/zenodo.7290177). הקוד, ובפרט המאפיינים של כל מדגם (המוגדר בשורות 14-61), כבר הותאם לניתוח תמונות אלה. עבור ערכת תמונות זו, הקידומת בה נעשה שימוש הייתה 'IMG_'. לכן, שורת המחרוזת 8 צריכה להסתיים ב- '\IMG_' (או '/IMG_' במערכות לינוקס). החלק האחרון של הקוד (שורות 166-179) גם משרטט באופן אוטומטי את עקומות השיקוע שחולצו עבור כל דגימה. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

קובץ משלים 2: ShapeAnalyzerIntegrated.m. הקוד הראשי משמש כדי להתאים את המודל הפיזי (שלב 3 של הפרוטוקול). כדי להפעיל קוד זה, פשוט העתק והדבק אותו בתיקיה המכילה את קבצי טקסט הפלט מ- MatlabCodeImageAnalysisSampled.m, יחד עם SedimFit.m. שמות הקבצים לניתוח (ללא סיומת .txt) צריכים להופיע בשורה 9. ההמטוקריט הראשוני וגובה הצינור צריך להיות כלול גם בשורות 12 ו -15, בהתאמה. קוד זה כבר מוכן לנתח את העקומות שחולצו מהתמונות הפתוחות ב- Zenodo (DOI: 10.5281/zenodo.7290177). לאחר שינוי קודי השורה הנ"ל, פשוט לחץ על כפתור 'הפעלה' בסרגל הכלים של עורך Matlab. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

קובץ משלים 3: SedimFit.m. מודל פיזי מותאם על ידי ShapeAnalyzerIntegrated.m. קובץ זה הוא פונקציית Matlab, המגדירה את הפונקציות המותאמות לעקומות הניסוי כדי לחלץ את הפרמטרים הפיזיים. הוא אמור להיות באותה תיקיה כמו ShapeAnalyzerIntegrated.m בעת הפעלת הניתוח. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

כדי שהפרוטוקול האוטומטי יעבוד ביעילות, חשוב שיהיה רקע ברור ותאורה מתאימה. רקע כהה עלול למנוע את קיומו של סף בינאריזציה יעיל. עבור דגימות עם המוליזה מסוימת, אשר מתרחשת בדרך כלל (עולה) לאורך זמן, חשוב לוודא תחילה כי סף בינאריזציה שנבחר רלוונטי הן עבור התמונה הראשונית והן עבור התמונה הסופית.

כשמדובר בתהליך הבינאריזציה של התמונה, בחירת החזר ההשקעה וסף הבינאריות היא השלב הרגיש ביותר. כדאי לבדוק ידנית ערכי סף שונים בשלוש תמונות שונות (בתחילתו, באמצעו ובסופו) כדי לוודא שבחירת הסף אכן מספקת את הבינאריות הרלוונטית לכל התהליך. אם הדגימה חווה המוליזה חזקה, ייתכן שיהיה צורך להגביל את ניתוח הדגימה לתחילת התהליך, כאשר עדיין ניתן להבחין בממשק ברור. באשר לכל מדידת ESR, זה גם חיוני כדי למנוע נוכחות של כל בועות בצינור. עם זאת, אם כמה בועות קטנות נצפות בחלק העליון של הצינור, החזר השקעה המתחיל מתחת לבועות וממש על גבי הממשק הראשוני עשוי עדיין לספק את המדידה הרלוונטית. במקרה זה, עם זאת, חשוב לכלול שטח רקע בצד ימין ושמאל של הצינור, כך שניתן יהיה לקבוע את סף Otsu תוך התחשבות תמיד בכמות משמעותית של פיקסלים עם הרמה האפורה של הרקע.

השיטה, כמו בכל מדידות ESR, מסתמכת על ההנחה שניתן לראות ממשק ברור בין אריתרוציטים ארוזים לפלזמה נטולת תאים. אם המדגם חווה כמות משמעותית של המוליזה, או אם ההמטוקריט של המדגם מדולל מדי (מתחת ל -25% ¹⁷), ממשק כזה לא ייצפה יותר. מדידת ESR בתנאים אלה היא אז בלתי אפשרית לביצוע.

כאמור, שיטה זו מבטיחה לספק את המהירות הרלוונטית של קריסת הג'ל U_m, אשר ניתן לתקן על פי המטוקריט הראשוני של המטופל¹⁷. איור 3A, יחד עם המדידות הגולמיות של U_m, מראה גם את הערכים המתוקנים עבור המטוקריט מנורמל של Φ 0 = _0.45. ניתן לראות כי התיקון מסיר את התלות הכוללת ב-Φ₀, כמו גם את רוב פיזור הנתונים. קביעת U_mבהתבסס ישירות על המודל הפיזי הרלוונטי מרמזת גם כי הטכניקה היא אובייקטיבית יותר מאשר החלקת עקומה שרירותית, עם בחירות שרירותיות של פרמטרים החלקה. בין היתר, שיטה זו הוכחה כחזקה יותר בהקשרים רפואיים שבהם נצפו ערכי ESR נמוכים באופן חריג^19,20.

עניין מהותי נוסף של מדידה זו הוא שהיא נותנת נתונים חזקים יותר וניתנים לפירוש פיזי. לדוגמה, במקרה של ESR מונמך, הוא מאפשר להבחין אם זמן ההשהיה t₀ של הקריסה הוא ממושך, אם הרשת של RBCs היא חריגה מופרע דרך γ, או אם דחיסה סופית Φ_m של התאים הוא איכשהו מעוכב^16,19,20.

באופן מעניין, מדידת מהירות השקיעה המרבית היא גם חזקה ורגישה יותר לרמות פיברינוגן, כפי שכבר הודגשו במחקרים קודמים^13,14,15. זוהי תכונה חשובה, כמו ESR משמש לעתים קרובות כדי לפקח על דלקת, אשר קשורה רמות גבוהות של פיברינוגן. רגישות זו נובעת למעשה מניתוק U_m מזמן קריסת הג'ל, אשר ידוע שיש לו מרכיב אקראי חשוב^34,35,36. ליתר דיוק, כפי שמודגש באיור 4D¹⁶, עבור ריכוזים גבוהים יותר של פיברינוגן, השונות האקראית הפנימית של זמן ההשהיה (שבה מדידות מעל 150 מ"ג/מ"ל הן בין 12 דקות ל-30 דקות, אפילו בקרב תורם יחיד) היא באותו סדר גודל כמו התלות הבסיסית שלה בפרמטר זה (בין 150 מ"ג/ד"ל ל-300 מ"ג/ד"ל; המגמה הממוצעת של המדידות יורדת רק מ-0.45 שעות ל-0.4 שעות [ כלומר, 27 דקות עד 24 דקות]). מכיוון שזמן עיכוב זה נכלל למעשה במדידת הגובה המסורתית של 30 דקות או שעה (משכי זמן עיכוב זה יכול לפעמים להגיע אליהם או לחרוג מהם), חילוץ המהירות המרבית U_m (הצגת מגמה שיטתית ומשמעותית עבור כל תורם) מספק פרמטר חזק ומשמעותי יותר 13,14,15,34,35^{, 36}.

יתר על כן, הפרמטר U_m ניתן לתקן ביעילות עבור המטוקריט הראשוני, על פי התוצאה המעשית שתוארה קודם לכן¹⁷. כאשר משלבים נתונים עבור כל התורמים הבריאים במחקר קודם¹⁷, מתקבלים ערכים של γ = 0.50 ± 0.06 ו- Φ m = 0.86 ± 0.04, אשר משחזרים יפה את המגמה של U_m כפונקציה של ההמטוקריט התורם Φ , כפי שמוצג באיור 3. אולם במקרים מעשיים, ייתכן שיהיה קפדני יותר לתקן את ה-ESR עם ערכי γ ו-Φ_mהמתקבלים עבור תורם ספציפי, מאחר שרמות הפיברינוגן יכולות גם להשתנות באופן משמעותי בין תורמים ולהשפיע באופן משמעותי על פרמטרים אלה (איור 4).

בהתחשב בנקודות שנדונו והכללתן בהליכים רפואיים שגרתיים, הדיוק והרבגוניות של ESR ככלי קליני במבחנה ישתפרו עוד יותר.

למחברים אין ניגודי עניינים להצהיר שהם רלוונטיים לתוכן מאמר זה.

עבודה זו נתמכה על ידי יחידת המחקר FOR 2688 - Wa1336/12 של קרן המחקר הגרמנית ועל ידי הסכם המענק של מארי סקלודובסקה-קירי מס '860436-EVIDENCE. T. J. ו- C. W. מכירים במימון מהאוניברסיטה הגרמנית הצרפתית (DFH / UFA). א.ד. מכיר במימון של מענק החוקר הצעיר של אוניברסיטת סארלנד.