חקר ארגינין מתילום על ידי ספקטרוסקופיית תהודה מגנטית גרעינית

הפרוטוקול הנוכחי מתאר הכנה ומדידה כמותית של ארגינין חופשי וקשור לחלבון ומתיל-ארגינינים על ידי ספקטרוסקופיית H-NMR ¹.

ארגינין הקשור לחלבון עובר מתילציה בדרך כלל בחלבונים רבים ומווסת את תפקודם על ידי שינוי התכונות הפיזיקוכימיות, האינטראקציה שלהם עם מולקולות אחרות, כולל חלבונים אחרים או חומצות גרעין. עבודה זו מציגה פרוטוקול קל ליישום לכימות ארגינין ונגזרותיו, כולל דימתילארגינין אסימטרי וסימטרי (ADMA ו-SDMA, בהתאמה) ומונומתיל ארגינין (MMA). לאחר בידוד חלבונים מנוזלי גוף ביולוגיים, רקמות או ליזטים של תאים, מתוארת שיטה פשוטה להומוגניזציה, משקעים של חלבונים והידרוליזה של חלבונים. מאחר שההידרוליזות מכילות רכיבים רבים אחרים, כגון חומצות אמינו אחרות, שומנים וחומצות גרעין, שלב טיהור באמצעות מיצוי בשלב מוצק (SPE) הוא חיוני. SPE יכול להתבצע באופן ידני באמצעות צנטריפוגות או רובוט pipetting. הרגישות ל-ADMA בפרוטוקול הנוכחי היא כ-100nmol/L. הגבול העליון של גילוי ארגינין הוא 3 mmol / L עקב רוויה SPE. לסיכום, פרוטוקול זה מתאר שיטה חזקה, המשתרעת מהכנת דגימות ביולוגיות לזיהוי מבוסס NMR, ומספקת רמזים ומלכודות יקרי ערך לעבודה מוצלחת בעת לימוד מתילום ארגינין.

במהלך שני העשורים האחרונים, מתילציה של שאריות ארגינין הוכרה כשינוי חיוני לאחר תרגום של חלבונים. זה משפיע על תהליכים ביולוגיים בסיסיים כמו ויסות של שעתוק, העברת אותות, ועוד^רבים 1. החלבונים העיקריים המעורבים בוויסות מתילציה של ארגינין הם חלבון ארגינין מתילטרנספראזות (PRMTs)². הנגזרות העיקריות של ארגינין הן ω-(N G,N G)-דימתילארגינין אסימטרי (ADMA), ω-(N G,N'G)-דימתילארגינין סימטרי (SDMA), ו-ω-N ^{G-מונומתילארגינין} (MMA)².

PRMTs משתמשים ב-S-אדנוזיל-l-מתיונין כדי להעביר קבוצות מתיל לקבוצת גואנידינו הטרמינלית (עם שתי קבוצות אמינו שוות ערך) של ארגינין הקשור לחלבון¹. ניתן להבחין בין שני אנזימים עיקריים: אנזימים מסוג I ואנזימים מסוג II מזרזים את שלב המתילציה הראשון ליצירת MMA (ובכך מאבד את הסימטריה שלו). לאחר שלב זה, אנזימים מסוג I (לדוגמה, PRMT1, 2, 3, 4, 6, 8) משתמשים ב-MMA כמצע ליצירת ADMA, בעוד שאנזימים מסוג II (בעיקר PRMT5 ו-PRMT9) מייצרים SDMA. PRMT1 היה החלבון הראשון ארגינין מתילטרנספראז שבודד מתאי יונקים³. עם זאת, PRMTs נשמרו אבולוציונית⁴ בבעלי חיים אחרים כמו בעלי חוליות שאינם יונקים, אקורדטים חסרי חוליות, אכינודרמים, פרוקי רגליים ונמטודות cnidarians⁵, צמחים⁶, ופרוטוזואה, כולל פטריות כמו שמרים⁷. במקרים רבים, נוקאאוט של אחד מ-PRMTs מוביל לאובדן כדאיות, וחושף את התפקיד החיוני של מיני ארגינין שעבר מתילציה המעורבים בתהליכים תאיים בסיסיים כמו שעתוק, תרגום, העברת אותות, אפופטוזיס והפרדת פאזה נוזלית-נוזלית (כלומר היווצרות אברונים חסרי קרום, למשל נוקלאולי), הכוללים באופן קבוע תחומים עשירים בארגינין ^8,9,10 . בתורו, זה משפיע על הפיזיולוגיה ומצבי מחלה, כולל סרטן 11,12,13, מיאלומה נפוצה¹⁴, מחלות לב וכלי דם 15, פתוגנזה ויראלית, ניוון שרירים בעמוד השדרה 16, סוכרת ^17, והזדקנות¹. רמות ADMA מוגברות בזרם הדם, למשל שמקורן בריאה¹⁸ עקב פירוק חלבונים, נחשבות קשורות לתפקוד לקוי של האנדותל, מחלת ריאות כרונית¹⁹ ותסמונות אחרות של מחלות לב וכלי דם²⁰. ביטוי יתר של PRMTs נמצא כמאיץ גידולים וקשור לפרוגנוזה גרועה^21,22. חוץ מזה, אבלציה של PRMT6 ו- PRMT7 מפעילה פנוטיפ הזדקנות תאי²³. ירידה משמעותית ב-ADMA וב-PRMT1 נמצאה במהלך ההזדקנות של פיברובלסטים^{WI-38 24}.

האתגר הוא להבין כיצד מתילציה פועלת בתהליכים פיזיולוגיים (פתו) היא זיהוי וכימות מתילציה של ארגינין חלבון. רוב הגישות הנוכחיות משתמשות בנוגדנים כדי לזהות ארגינינים מתילטים. עם זאת, נוגדנים אלה הם עדיין ספציפיים להקשר ועלולים להיכשל בזיהוי מוטיבים שונים של חלבונים מתילציה ארגינין^25,26. בפרוטוקול המתואר, ניתן לכמת את כל נגזרות הארגינין שהוזכרו לעיל באופן מהימן על ידי ספקטרוסקופיית תהודה מגנטית גרעינית (NMR), כלומר לבד, בשילוב, או, כמו ברוב המקרים, בתוך מטריצות ביולוגיות מורכבות כמו תאים אאוקריוטים (למשל, משמרים, עכבר או ממקור אנושי) ורקמות²⁷, כמו גם בסרום²⁸. עבור חלבונים ומטריצות מורכבות אלה, הידרוליזה של חלבון²⁹ היא תנאי מוקדם ליצירת חומצות אמינו חופשיות (מותאמות), כגון ארגינין, MMA, SDMA ו- ADMA. מיצוי שלב מוצק (SPE)³⁰ מאפשר העשרת תרכובות העניין. לבסוף, ספקטרוסקופיית H-NMR ¹מאפשרת זיהוי מקביל של ארגינין וכל נגזרות המתיל העיקריות של ארגינין. ספקטרוסקופיית NMR מגיעה עם היתרון שהיא באמת כמותית, ניתנת לשחזור ברמה גבוהה, וטכניקה חזקה^31,32. את מדידות התמ"א הסופיות ניתן לבצע לאחר מכן לאחר איסוף והכנת דגימות רבות. לבסוף, פרוטוקול זה מתמקד בעיקר בהכנת דגימות מכיוון שזה אינו דורש ספקטרומטר NMR משלו. זה יכול להתבצע ברוב המעבדות הביוכימיות. עם זאת, כמה רמזים על אילו מדידות ספקטרוסקופיה NMR צריך להיעשות מובאים בעבודה זו.

הידרוליזה של חלבון שמרים שימשה כדגימות לתוצאות המייצגות של עבודה זו. הפרוטוקול כולו מסוכם באיור 1.

1. הכנת חומרים וריאגנטים

1. מתנול/מים: הכינו תערובת של שני חלקים של 99% מתנול (MeOH) וחלק אחד של H 2 O, המסומן כ-MeOH/H 2 O. אחסנו MeOH טהור ו-MeOH/H₂O בטמפרטורה של-20°C כדי למזער את אידוי האלכוהול ולהגביר את יציבות הדגימה.
2. חומצה הידרוכלורית (HCl): לדלל 9 mol/L מ HCl מרוכז (12.0 mol / L או 37%) כמו גם 0.1 mol / L של HCl. התמיסה המרוכזת יותר (9 mol/L) משמשת להידרוליזה של חלבונים, ואילו התמיסה המרוכזת יותר (0.1mol/L) משמשת למיצוי בשלב מוצק.
   אזהרה: יש לעבוד בתוך מכסה האדים.
3. הכינו תמיסה חלופית ל-SPE המכילה 10% תמיסת אמוניה רוויה (במלאי: 30% עם אמוניה), 50% מתנול ו-40% מים (v/v).
4. מאגר NMR: להמיס 5.56 גרם של דיסודיום מימן פוספט (Na 2 HPO 4, 0.08 mol/L), 0.4 גרם של 3-(trimethylsilyl) חומצה פרופיונית-2,2,3,3-d4 מלח נתרן (TSP, 5 mmol / L), 0.04% (w/v) של נתרן אזיד (NaN₃) ב 500 מ"ל של דו תחמוצת דאוטריום (D₂O) ולהתאים ל- pH_7.4 (באמצעות HCl או NaOH, בהתאמה) (ראה טבלת חומרים). בדוק את הטוהר של כל אצווה חיץ חדשה על ידי ספקטרוסקופיית NMR.
   הערה: כמות המזהמים (למשל, אתנול) צריכה להיות נמוכה ככל האפשר.
5. מלא צינורות עיסה בחרוזי תחמוצת זירקוניום (צינורות 2 מ"ל וחרוזים 1.4 מ"מ מתאימים לרוב היישומים, אך קיימות גרסאות שונות) (ראה טבלת חומרים). מלאו בערך 10-20 חרוזים ביד או קנו צינורות ממולאים מראש, הזמינים גם כן.
6. שמור פיפטות ואת הקצוות המתאימים מוכן בטווח של 10-1,000 μL.
   הערה: מים טהורים מאוד, המסומנים כ-H 2 O, המוגדרים על ידי התנגדות גבוהה של ≥18.2 MΩ·^cm-1, שימשו לאורך כל העבודה. זה מתאים למים מזוקקים כפולים.

2. איסוף ואחסון דוגמאות

1. יש להקפיא את הדגימות הנוזליות (סרום/פלזמה, תרבית תאים וכו') בחנקן נוזלי ולאחסן אותן בטמפרטורה של -80°C עד לשימוש.
2. הכינו את החומרים המוצקים כמפורט להלן.
   1. אספו את התאים מתרביות תאים (3-5 מיליון תאים) על ידי איסוף תאים דבקים, לאחר שטיפה במי מלח חוצצי פוספט קר, גירוד וצנטריפוגה, או צנטריפוגה ישירה של תאים שגדלו בתרחיף.
   2. הסר את supernatants התא (אשר עשוי להיאסף לניתוח נוסף, או על ידי מדידה ישירה רצופה, ראה שלב 6, או לאחר משקעים של חלבונים מסיסים, ראה שלב 3.1), ולאחר מכן הבזק להקפיא את הכדוריות עם חנקן נוזלי ולאחסן ב -80 ° C. לעיבוד נוסף, ראה שלב 3.2.
   3. אחסן ואסוף את הרקמות בהתאם למטרת המחקר. עבור רקמות הומוגניות מאוד, כגון הכבד או השריר, לנתח כל חלק של זה. לדוגמה, במקרה של מוח עכבר, לקבוע מתילציה גלובלית ארגינין של המוח כולו או קטעי המוח.
      הערה: המשקל האידיאלי של רקמות להיות מעובד הוא 30-60 מ"ג. רצוי להקפיא ולכתוש את המוח כולו ולהשתמש באליציטוטים ממנו. לחלופין, ניתן להשתמש בחלקי מוח ספציפיים (למשל, חזיתית, המוח הקטן, אזורים עורפיים, או חצי כדור אחד, במשקל ~ 250 מ"ג).

3. הכנת מדגם ראשוני

הערה: בצע את העבודה על קרח, תוך שמירה על MeOH קר. הדגימות חייבות להישמר גם על קרח כדי למנוע פירוק חלבון.

1. עבור דגימות נוזליות, הוסף 400 μL של מתנול קר כקרח ל 200 μL של הדגימה. המשך לשלב 3.3.
   הערה: אם יש פחות מדגם זמין, התאם את אמצעי האחסון בהתאם; רגישות NMR היא בדרך כלל גבוהה מספיק עבור כמויות מדגם קטנות יותר, אבל צריך לבדוק בנפרד.
2. במקרה של חומרים מוצקים, להכין מספיק צינורות 1.5 מ"ל עבור lysates (להשתמש צנטריפוגה לאחר הומוגניזציה).
   1. בזהירות, אך ביסודיות, להשהות מחדש את כדורי התא ב 600 μL של MeOH/H₂O ולהעביר את כל השלב הנוזלי לתוך צינורות עיסה.
   2. הכניסו רקמות לתוך צינורות עיסה (ניתן לשקול אותן ישירות לתוך הצינורות) והוסיפו 600 μL של MeOH/H₂O (עבור 30-60 מ"ג; התאימו אם המשקל שונה באופן משמעותי).
   3. הכניסו את הצינורות לתוך ההומוגנייזר של הרקמה (ראו טבלת חומרים) ובצעו הומוגניזציה פעם אחת למשך 20 שניות עם טלטול כבד (עבור כדורי תאים, רקמות רכות) או פעמיים במשך 20 שניות כל אחת (או יותר במידת הצורך) עם מרווח של 5 דקות בין לבין (עבור רקמות נוקשות).
   4. לאחר הומוגניזציה, מיד לשים דגימות על הקרח שוב ולהעביר את כל lysates לתוך צינורות חדשים 1.5 מ"ל.
3. יש לאחסן דגימות למשך 30 דקות לפחות (עד מספר ימים) בטמפרטורה של -20°C לפני עיבוד נוסף.
4. צנטריפוגה ב-10,000 x גרם למשך 30 דקות ב-4°C. בינתיים, הכינו מספיק צינורות של 1.5 מ"ל כדי לאסוף את הסופרנאטנטים.
   הערה: סופרנאטנט זה (המסומן "(1)" באיור 1) עשוי להיזרק לפח, לעבור ליופיליזציה ולעבד ישירות עבור NMR (שלב 6) או לנתח אותו בדרך אחרת.
5. בפרוטוקול זה, משקע MeOH (= גלולה המתקבלת לאחר שלב 3.1 או 3.2.2, בהתאמה) משמש לניתוח נוסף המכיל, בין היתר, רכיבים כגון חומצות גרעין ושומנים, חלבונים מתילציה ארגינין. המשך עם הידרוליזה חלבון או לאחסן את הכדוריות ב -20 ° C במשך כמה ימים.

4. הידרוליזה של חלבון

1. הוסף 500 μL של 9mol/L של HCl לכל דגימה. לאחר מכן, חתכו את הכובעים של כל צינור עם מספריים והכניסו אותם לצינורות תרבית הזכוכית (איור 2A). בזהירות, אך בחוזקה, סגרו את הכובעים האדומים (ובכך בדקו את האיטום).
   הערה: לפני השימוש, יש לבדוק תמיד כל איטום (רדיד PTFE אפור בתוך מכסי הברגים האדומים) להידוק נכון ולנקות אותם באופן קבוע במים.
2. בסיום, הניחו את הצינורות בתוך מלאה חלקית בחול (להעברת חום טובה יותר) ובצעו הידרוליזה במשך כ-16 שעות בטמפרטורה של 110°C בתא ייבוש.
3. לאחר הידרוליזה, לקרר את הדגימות (~ 1 שעות).
4. לאחר מכן, lyophilize לילה באמצעות צנטריפוגה עם ואקום גבוה (מתחת 100 Pa).
5. להמיס את הכדוריות - אם יבש לחלוטין (אם לא, להמשיך lyophilization) - ב 1 מ"ל של 0.1 mol / L HCl ולהוסיף 50 μL של כלורופורם (CHCl₃) לכל צינור; ממיסים היטב את הגלולה עם פיפטה של 1,000 מיקרוליטר, ובכך מערבבים את הנוזלים, ולאחר מכן מעבירים את הנפח המלא לצינור חדש.
   אזהרה: יש לעבוד תמיד עם כמויות קטנות כדי למזער אידוי נרחב
6. לאחר מכן, צנטריפוגה ב 8,000 x גרם במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר.
7. אספו בזהירות את השלב העליון של הנוזל הדו-פאזי שמכיל את החלק המסיס במים (איור 2B, החלק עם הצפיפות הנמוכה יותר) עם פיפטה ומלאו אותו בצינורות חדשים. השתמשו בשפופרות של 1.5 מ"ל עבור SPE ידני (סעיף 5.2) או בבקבוקוני זכוכית עבור SPE רובוטי (סעיף 5.3 ואיור 2D). הימנעו מזליגה על_{CHCl 3} ותכולתו (איור 2C).

5. מיצוי בשלב מוצק (SPE)

1. לפני השימוש הראשון, נקה את מחסניות SPE פעמיים עם 1 מ"ל של הפתרון החלופי (שלב 1.3) ואחריו צנטריפוגה ב 800 x גרם למשך דקה אחת בטמפרטורת החדר (ממוקם לתוך צינורות 15 מ"ל). הם יכולים לשמש 10-20 פעמים כל אחד.
2. SPE ידני
   1. התנה מראש את המחסניות (ראה טבלת חומרים) בכל ריצה עם 1 מ"ל מתנול טהור ו- 2 x 1 מ"ל PBS, בכל פעם ולאחר מכן צנטריפוגה ב 800 x גרם למשך דקה אחת בטמפרטורת החדר (מונח לתוך צינורות 15 מ"ל).
   2. לאחר מכן, טען את הדגימות (משלב 4.7) על מחסניות SPE וצנטריפוץ אותם ב 600 x גרם במשך 2 דקות בטמפרטורת החדר.
   3. לאחר מכן, יש למרוח מחזור כביסה כמפורט להלן.
      1. הוסף שלוש פעמים 1 מ"ל של H₂O (כל אחד ואחריו צנטריפוגה במשך דקה אחת ב 800 x גרם בטמפרטורת החדר).
      2. יש להוסיף חמש פעמים 1 מ"ל של 0.1 mol/L HCl (כל אחד מהם ולאחר מכן צנטריפוגה למשך דקה אחת ב 800 x גרם בטמפרטורת החדר).
      3. הוסף פעמיים 1 מ"ל של MeOH (כל אחד ואחריו צנטריפוגה במשך דקה אחת ב 800 x גרם בטמפרטורת החדר).
   4. לאחר מכן, לפלוט ארגינין ונגזרותיו עם 3 x 1 מ"ל של פתרון חלופי (ואחריו צנטריפוגה 1 דקות ב 800 x גרם בטמפרטורת החדר) לתוך צינור יחיד 15 מ"ל.
      הערה: הפתרון החלופי משמש כמקל עבור ארגינין ונגזרות ומשמש גם לניקוי המחסניות (כל החומרים נשטפים לפני ההדחה או בערך החומציות הבסיסי של התמיסה החלופית). עם זאת, כדי למנוע זיהום לאורך זמן, השימוש החוזר צריך להיות מוגבל (ראה שלב 5.1).
3. SPE רובוטי
   הערה: כאן, רובוט פיפטינג (החלק העיקרי המורכב ממחט צנרת, תחנת שטיפה למחט, אספקת מגיב ומיקומים עבור דגימות ואלואטים, ראה טבלת חומרים) מסופק עם מחזיק מחסנית עבור עמודות SPE. עבור מכשירים אחרים, הקפד להיות מצויד באופן מלא עם כל הדברים המפורטים.
   1. מלאו את הסופרנאטנט (משלב 4.7) ישירות לתוך בקבוקוני זכוכית עם איטום PTFE (איור 2D), הכינו מספיק ריאגנטים (100 מ"ל מכל אחד, כלומר תמיסת החלפה, 99% של MeOH, PBS, H 2 O ו-0.1 של mol/L HCl), צינורות של 5 מ"ל עבור אלוציה ותמיסת שטיפה עבור המחט של הרובוט (בדרך כלל H₂O).
   2. השתמש ביישום או שיטה בתוכנה של הרובוט בהתבסס בדיוק על השלבים המתוארים עבור SPE ידני (שלב 5.2).
      הערה: הפרטים עשויים להשתנות מאוד בין ספקי מכשירים, לכן עיין במדריך התוכנה של הרובוט המתאים לתכנות. רובוט פיפטינג עובד בדרך כלל על ידי הפעלת לחץ אוויר על המחסניות במקום צנטריפוגה, וזה ההבדל העיקרי. אם הפרוטוקול מבוסס ומופעל בפעם הראשונה, כלול פקדים (לדוגמה, L-ארגינין בריכוז ידוע) כדי לאמת זרימת עבודה מיטבית.

6. הכנה סופית לתמ"א

1. דגימות Lyophilize לילה כדי יובש מוחלט להיפטר אמוניה H₂O.
2. ממיסים כל דגימה ב-500 מיקרוליטר של מאגר NMR (שלב 1.4) ומעבירים לצינורות NMR. חשוב לציין, הנפח חייב להיות זהה בכל הצינורות, והדגימות חייבות להיות הומוגניות (ללא שאריות ושומנים, הנוטים להצטבר).
   הערה: הפרטים של ספקטרוסקופיית NMR חורגים מעבר לסקירת שיטה זו ומתוארים בפירוט רב יותר במקום אחר²⁷. כאן, רק הדרישות העיקריות ואת השלבים מוסברים. כימות הארגינין והמטבוליטים שלו מבוצעים על ספקטרומטר NMR של 600 מגה-הרץ (ראה טבלת חומרים). באופן עקרוני, ניתן להשתמש בכל עוצמות שדה אחרות של ספקטרומטר NMR/NMR, בתנאי שניתן לזהות את אותות ה-NMR של ארגינין וארגינינים שעבר מתילציה ברגישות מספקת וללא חפיפת אותות. ניתן להשתמש בכל ראש בדיקה עם שיפועים של ציר z המסוגל להקליט ספקטרום H ^אחד, בתנאי שרצפי הפולסים מוגדרים בהתאם.
3. הקלט ספקטרום 1D באמצעות רצף פולסים CPMG (Carr-Purcell-Meiboom-Gill)^33,34 (cpmgpr1d, 512 סריקות, גודל fid 73728, רוחב ספקטרלי של 11904.76 הרץ ב- NMR של 600 MHz^, עיכוב מיחזור 4 שניות) עם דיכוי אות מים באמצעות רוויה.
4. בניסויים אלה, הסירו את הצימודים הסקלריים של ¹H על ידי ניתוק וירטואלי, ובכך הפחיתו את חפיפת האותות. הקלט נוסף עבור שאלות ספציפיות ו / או דגימות מורכבות או מטריצות, למשל, ^{1 H-13 C-heteronuclear}Single Quantum Coherence (HSQC) ספקטרום²⁷.
   הערה: עבור מטריצות מורכבות ^{יותר שבהן אותות}1H NMR של ארגינינים מתילציה יכולים להיות חופפים חלקית ^{עם אותות}1 H NMR של מטבוליטים אחרים (למשל, ליזין ^{), 1}H הומו-גרעיני J-resolved spectra (JRES)³⁵ נדרשים.
5. בצע כימות מוחלט על ידי שילוב עוצמות השיא בהתאמה של תקנים של ריכוז ידוע, למשל, 100 μmol / arginine.
   הערה: באופן שגרתי, ADMA, SDMA ו-MMA (ראה טבלת חומרים) מדווחים כיחס ביחס לארגינין. יש לכך יתרון משמעותי שאין צורך לבצע נורמליזציה נפרדת (למשל, מספר תאים, מסת רקמות, ריכוזי חלבונים). במקרה כזה, ארגינין משמש כסטנדרט פנימי, ודי בכימות יחסי כדי לקבל מידע רלוונטי מבחינה ביולוגית.
6. לצורך התמיינות של SDMA ו-MMA, ליופיליזציה של הדגימות שוב כדי להיפטר מ-D₂O (אם הן הושעו מחדש במאגר NMR בעבר), אשר מוחלף בדימתיל סולפוקסיד (d_6-DMSO), המאפשר רזולוציה של תהודה מתיל²⁷. לכן, לשאוף את הדגימות מן צינורות NMR עם פיפטות פסטר, lyophilize, ולהמיס אותם ב 500 μL של d_6-DMSO.

באופן ^{שגרתי, תחזיות}1 H 1D של ספקטרום NMR דו-ממדי J-resolved (JRES), כמעט מנותק, משמשות למשימות שיא וכימות במעבדה³⁶ שלנו. איור 3 מראה ספקטרום JRES מייצג של הידרוליזה של חלבון שמרים מטוהרים באמצעות פרוטוקול SPE הנוכחי. אם כי בריכוזים שונים מאוד, ניתן להפריד ולכמת את שני החומרים במטריצה תאית. בהתבסס על מספר הפרוטונים של קבוצת המתיל הספציפית (-CH₃) או מתילן (-CH₂-) בשינוי הכימי המתאים, ספקטרוסקופיית H-NMR ¹מאפשרת כימות מדויק. כפי שצוין בפרוטוקול (שלב 0), הכימות היחסי של נגזרת מתיל-ארגינין בהשוואה לארגינין מספיק בעיקר כדי לצפות בתהליכים ביולוגיים, למשל, שינויים במתילציה של ארגינין כתגובה למודולציות, כגון הפלה/ביטוי יתר של גנים, שינויים בחומרים מזינים או טיפול במעכבים.

כפי שמוצג קודם לכן 27, L-ארגינין ו- ADMA יכולים להיות מופלים היטב על ידי השינויים הכימיים האופייניים השונים שלהם ב-^3.25 ו- 3.02 ppm, בהתאמה. פרוטוני מתיל SDMA ו-MMA חושפים שיאים חופפיםב-D 2 O (מאגר ה-NMR המתואר בשלב 1.4) בשינוי כימי של 2.85 ppm. אם שיא קיים במיקום המתאים, ניתן להפריד SDMA ו- MMA על ידי המסת הדגימות ב- d 6-DMSO כמתואר בשלב_6.6 של הפרוטוקול. באמצעות גישה זו, ניתן להפריד ולכמת ^{את השינויים}הכימיים של 1 H NMR של SDMA ו-MMA עם שינויים כימיים אופייניים ב-2.76 ppm (SDMA) ו-2.74 ppm (MMA)²⁷. איור 3B מציג נתונים מייצגים של SDMA ו-MMA (שניהם 100 μmol/L) ב-D₂O_{וב-d 6-DMSO}, בהתאמה. נתונים מקבילים של SMDA ו-MMA שזוהו בתאים וברקמות שונות דווחו לאחרונה²⁷. כמתואר בשלבים 6.4-6.5 של הפרוטוקול, ניתן להשתמש בתקני ייחוס של ריכוזים ידועים לצורך כימות. כל תקני הייחוס המוזכרים בטקסט זמינים מסחרית.

איור 1: סקירה כללית של הכנת המדגם. תכנית החושפת את השלבים המשמעותיים מאיסוף הדגימות ועד למדידת תמ"ג. התיבות השחורות מתייחסות למספור בסעיפי הפרוטוקול. בנוסף, כמות הימים המשוערת (משתנה בהתאם למספר הדגימות) מוצגת. דגימות נוזל לא הומוגניות עשויות לעבור צנטריפוגה לפני הוספת MeOH (שלב 3.1) כדי להסיר את השאריות (לא מוצגות). הסופרנאטנט לאחר צנטריפוגה ראשונית (1) המכיל, למשל, מטבוליטים תוך תאיים או מטבוליטים של ארגינין שאינם קשורים לחלבון עשוי להיות מאוחסן ב -20 מעלות צלזיוס לניתוח נוסף. באופן שגרתי, כדורי MeOH (2) מנותחים עוד יותר. קיצורים: CHCl₃, כלורופורם; HCl, חומצה הידרוכלורית; MeOH, מתנול; NMR, תהודה מגנטית גרעינית; o/n, לילה; ס"נ, סופרנטנט; SPE, מיצוי בשלב מוצק. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 2: טיפול בהידרוליזה של חלבונים והכנה למיצוי בשלב מוצק. (A) מלאה בחול, צינורות זכוכית, מכסי ברגים ברדיד איטום פוליטטרה-פלואוראתילן אפור (PTFE), ודגימות בצינורות 1.5 מ"ל לאחר חיתוך המכסים. (B) צינור לאחר צנטריפוגה (שלב 4.6) ו-(C) לאחר הסרת הסופרנאטנט המימי (שלב 4.7): ייתכן שיישארו שאריות מים (~50 μL). השאריות השחורות מכילות שאריות אורגניות פחמים בלתי מסיסות. עם זאת, דגימות מסוימות עשויות להכיל חומרים צבעוניים (D), שאינם מפריעים למדידת L-ארגינין. זה נובע בחלקו ממיצוי שלב מוצק (SPE) לאחר מכן, באמצעות שלבי צנטריפוגה עוקבים (E) או רובוט צנרת (F). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 3: ספקטרום NMR טיפוסי של L-ארגינין ונגזרותיו מתיליות. ¹ ספקטרום ה-NMR H 1D החזוי J-resolved יכול להבחין בקלות בין פרוטוני δ-(CH₂) של L-ארגינין (3.25 ppm) לבין 3-פרוטונים ω-N-CH של דימתילארגינין אסימטרי (ADMA, ב-3.02 ppm). דגימות מכדורי שמרים (A) החושפות כמויות משתנות של ADMA ניתנות לכימות על ידי שילוב עוצמות אות אפילו בנוכחות כמויות גבוהות של ארגינין (שימו לב ששיא הארגינין המלא אינו מוצג). (B) מאחר ש-ω-(N G,N'G)-סימטרי דימתילארגינין (SDMA) ו-ω-N ^{G-מונומתיל} ארגינין (MMA) בקושי ניתן להפליה בחיץ תחמוצת דאוטריום (D 2 O), יש להמיס דגימות בדימתיל סולפוקסיד מפורק (d_6-DMSO), שם ניתן להבחין בקלות בין הפסגות (במקרה זה 100 μmol/L של כל חומר) (פסגות של 2.75 _ו-2.76ppm, בהתאמה) ולכמת. כל הספקטוגרמות יוצאו ישירות מתוכנת הבקרה של ספקטרומטר NMR. התוכנה חושפת את התוצאות הראשוניות, אשר צריך להיבדק לפני ניתוח מפורט יותר, כולל סטטיסטיקה של דגימות רבות, נעשה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

בחלק הבא, המוקד העיקרי הוא על השיטה עצמה; ההשלכות הביולוגיות של מתילציה של ארגינין מתוארות בחלק המבוא.

ראשית, רקמות בעלות נוקשות שונה עשויות להזדקק להתאמה של ליזה דגימה: תאים מתרבית תאים (כולל חיידקים, שמרים וכו') ורקמות כמו מוח, כבד צעיר, שריר חלק וכו', יכולים להיות הומוגניים במהירות. עבור רקמות בעלות קשיחות גבוהה (כולל כבד של נבדקים קשישים, עורקים, עצמות וכו '), ההומוגניזציה צריכה להיעשות פעמיים (ראה שלב 3.2.3). עם זאת, אין להמשיך בתהליך זה לעתים קרובות יותר, גם אם נותרו כמה שרידים בלתי מסיסים. במקום זאת, הדגימות צריכות להיות צנטריפוגות במשך 10 דקות ב 10,000 x גרם ואת supernatants לאסוף לניתוח נוסף (כדי למזער את השפלת הדגימה).

בכל שלב שבו הדגימות מוקפאות (בתחילה, לאחר הוספת MeOH, שלבים 3.3, 3.4 או 3.5, בהתאמה) או לאחר ליופיליזציה (שלבים 4.4 ו-6.1), ניתן לאחסן דגימות למשך מספר ימים לפני עיבוד נוסף. נוסף על כך, הסופרנאטנט משלב 3.4 (לאחר הומוגניזציה; מסומן כ-"(1)" באיור 1) עשוי להיות מאוחסן גם לניתוח נוסף, למשל למדידת מטבוליטים שאינם מתיל-ארגינינים^36,37,38.

מצד אחד, שלבים קריטיים כרוכים באחסון דגימה, שכן פירוק חלבונים עלול לשנות את התוצאה. אם פירוק חלבונים מתרחש לפני משקעים MeOH, ארגינין ונגזרותיו מתיל עשוי להיות מוערך בחסר. לכן, אחסון דגימות הוא חיוני, למשל, לפני ואחרי התא או ליזה רקמות ב -20 ° C, או, במידת האפשר, ב -80 ° C. לפני או אחרי הומוגניזציה (שלב 3.2), הדגימות צריכות להישמר על קרח.

מצד שני, מתנול מראש טיפול של דגימות כדי לזרז חלבונים אינו משנה את דפוס מתילציה של ארגינין. זה נבדק עם ליזוזים ותמציות חלבון Escherichia coli (שאינן מכילות ארגינין מתילציה)²⁷. עם זאת, דיווחים קודמים הראו כי MeOH עשוי מתילאט את קבוצות קרבוקסיל מסוף של גלוטמט ו aspartate³⁹.

עבור הידרוליזה של חלבונים, ודא שהאיטום של מכסי הברגים שלם (שלב 4.1). אם לא, אידוי HCl עלול להשפיע על תא הייבוש. עם זאת, ייתכן שהריכוז של האנליטים לא ישתנה באופן קריטי, מכיוון שהם אינם מתאדים, ושאריות HCl מתאדות מאוחר יותר על ידי ליופיליזציה. ניתן להשתמש בריכוזים נמוכים יותר של HCl, למשל, 6mol/L, אך עשויים לדרוש זמן הידרוליזה ארוך יותר. לאחר הידרוליזה, ניתן לטפל בדגימות בטמפרטורת החדר. עם זאת, הסרה נכונה של שומנים היא חיונית. שומנים עשויים ליצור תערובות דו-פאזיות במים (או D₂O, בהתאמה) מאוחר יותר במהלך מדידת NMR. אי-הומוגניות זו מובילה להתרחבות שיא של תמ"ג ועלולה להשפיע על האיכות והרגישות של ניסויי תמ"ג.

אם אין רובוט צנרת זמין עבור SPE, זה שווה את ההשקעה (זה יכול לשמש גם למטרות אחרות). הדגימות על רובוט הצנרת SPE מעובדות ברצף, ובמערך הנוכחי, דגימה אחת לוקחת ~ 40 דקות לריצה מלאה. בשל מגבלות של יכולות מגיב (כלומר, 100 מ"ל), רק 19 דגימות ניתן לעבד בבת אחת (לוקח ~ 13 שעות בסך הכל). ובכל זאת, זמן הידיים הוא הרבה פחות מאשר עבור הליך SPE ידני דורש פחות חומר. במהלך תקופה זו, דגימות ניתן לאחסן בתוך הרובוט בטמפרטורת החדר עד lyophilization. מוצרים מקבילים עשויים להחליף את המטריצות ומחסניות SPE המשומשות. עם זאת, מומלץ להעריך את פרוטוקול SPE ולהתאים אותו במידת הצורך.

מגבלת הזיהוי של ADMA היא ~100nmol/L כפי שהוערך בעבר על ידי דילולים סדרתיים ושימוש בזמני מדידת NMR המדווחים. מצד שני, ריכוזי ארגינין גבוהים עשויים גם להעריך יתר על המידה את היחס בין ADMA לארגינין (שהוא בדרך כלל בטווח של 5%-15%). הסיבה לכך היא מעל 3 mmol / L של ארגינין; קיבולת קשירת עמודת SPE עשויה להגיע לרוויה²⁷. לבדיקת רגישות וספציפיות של זרימת העבודה כולה במקרה של תוצאות בלתי צפויות (למשל, אין פסגות או פסגות חופפות בספקטרום H-NMR ¹בשינויים הכימיים המדווחים), תקנים של ADMA, SDMA ו- MMA זמינים מספקים מסחריים (ראה טבלת חומרים). אם למעבדה כלשהי אין ספקטרומטר NMR, כל השלבים, כולל ליופיליזציה סופית (שלב 6.1), יכולים להתבצע במעבדה המתאימה, ודגימות עשויות להישלח למתקן NMR לניתוח.

בהשוואה לשיטות אחרות, כגון ספקטרומטריית מסות, אין צורך בתיוג של האנליטים, וניתן לבצע אותו ללא סטנדרטים פנימיים לכימות. מצד שני, הרגישות של NMR היא מעט נמוכה יותר, אשר ברוב המקרים הביולוגיים אם כי לא משחק תפקיד, כמו ארגינין ונגזרותיו מתיל יכול בקלות להיות מזוהה בכל מיני תאים או רקמות אאוקריוטים. כפי שהוזכר קודם, 3 מיליון תאים מספיקים כדי לכמת ADMA הקשור לחלבון - מספר תאים שניתן להשיג בקלות עם רוב קווי התאים. במקרה של תאים ראשוניים הגדלים לאט, ללא שינוי ממקור אנושי כמו תאי גזע בוגרים⁴⁰, תאים עשויים להיות מגודלים לתקופה ממושכת יותר או מאוגדים מניסויים נפרדים. הדבר נכון גם לגבי דגימות רקמות. ~30 מ"ג רקמה, המתאימה לאיברים רבים, למשל של עכברים (בחלקם או בכולם, למשל שרירים קטנים) או דגימת ביופסיה, מספיקה כדי להכין מספיק ליזט וחלבון הידרוליזה למדידת NMR²⁷. שיטות אחרות למדידת מתילציה של חלבון ארגינין כוללות שימוש במבחני לומינסנציה מצומדים לאנזים⁴¹ או ³H-labeled S-adenosyl-methionine (SAM)⁴². הרגישות גבוהה וניתן להגביר אותה על ידי שימוש ^{ב-SAM 14}עם תווית C אך על חשבון עלויות מוגברות. בנוסף, השימוש בחומרים רדיואקטיביים (כולל הנוזלים לספירת נצנצים) גורם לטיפול מיוחד בפסולת, שאינו הכרחי בפרוטוקול הנוכחי.

שיטה משלימה לפרוטוקול הנוכחי, באמצעות ספקטרוסקופיית NMR הטרו-גרעינית דו-ממדית, יכולה לחשוף דפוסי מתילציה ספציפיים לאתר בתוך חלבונים מבודדים. הוא פורסם לאחרונה, כולל תיאור מפורט של זיהוי מתיל-ארגינינים על ידי ספקטרוסקופיית NMR בכלל⁴³. הפרוטוקול הנוכחי אינו מספק מידע על מתילציה של ארגינין ספציפי לאתר בתוך חלבונים. ובכל זאת, מתילציה גלובלית משתנה ברמה התאית והפיזיולוגית, כולל גדילה והתמיינות תאים, הזדקנות, סרטן ^1,2,12, לב וכלי דם²⁰, ומחלות נוירודגנרטיביות ^8,44. הפרטים על המנגנונים המדויקים המעורבים עדיין אינם מובנים במלואם, ומועמדים אפשריים לתרופות המפריעות למתילציה של חלבון-ארגינין¹¹ הן במבחנה והן in vivo זקוקים לחקירה נוספת¹. חקר הקינטיקה של מתילציה (שהקבוצה שלנו הראתה לאחרונה)²⁷ חיוני להשגת תובנות לגבי שינוי ארגינין ומנגנוני פירוק חלבונים. מדידות מתילציה גלובליות של ארגינין וניסויים קינטיים (ניתן להקפיא דגימות בכל עת) החל מחלבונים בודדים ועד דגימות מאורגניזמים שלמים יכולים להתבצע בקלות באמצעות פרוטוקול זה. זה, אם כן, מספק שיטה חזקה, אשר ניתן בקלות להתאים למחקר עתידי.

המחברים מצהירים כי אין אינטרסים מתחרים.

העבודה נתמכה על ידי מענקי קרן המדע האוסטרית (FWF) P28854, I3792, doc.funds BioMolStruct DOC 130, DK-MCD W1226 BioTechMed-Graz (פרויקט דגל DYNIMO), מענקי הסוכנות האוסטרית לקידום המחקר (FFG) 864690 ו- 870454, המרכז לחקר מטבוליזם אינטגרטיבי גראץ; תוכנית התשתיות האוסטרית 2016/2017, ממשלת סטיריה (Zukunftsfonds) וקרן סטארט-אפ לכישרונות ברמה גבוהה של האוניברסיטה הרפואית פוג'יאן (XRCZX2021020). אנו מודים למרכז למחקר רפואי על הגישה למתקני תרביות תאים. F.Z. הוכשר במסגרת תוכנית הדוקטורט רפואה מולקולרית, האוניברסיטה הרפואית של גראץ. Q.Z. הוכשר במסגרת תוכנית הדוקטורט מטבולית ומחלות לב וכלי דם, האוניברסיטה הרפואית של גראץ.