ייצור של מכשירי microfluidic נייר מבוססים תלת ממדי עבור Immunoassays

אנו בפירוט שיטה לפברק מכשירים microfluidic תלת מימדי המבוסס על נייר לשימוש בפיתוח immunoassays. הגישה שלנו הרכבת מכשיר היא סוג של multilayer, ייצור כתוסף. אנחנו מדגימים immunoassay כריך לספק תוצאות נציג עבור סוגים אלה של מכשירים מבוססי נייר.

נייר פתילות נוזלים באופן עצמאי בשל פעולת נימים. על ידי דפוסי נייר עם חסמי הידרופובי, להובלת נוזלים ניתן לשלוט וביימה בתוך שכבה של נייר. יתר על כן, לערום מספר שכבות של נייר בדוגמת יוצר רשתות microfluidic תלת ממדי מתוחכם שיכול לתמוך בפיתוח של מבחני אנליטיים bioanalytical. נייר מבוסס התקני microfluidic זולים, ניידים, קלים לשימוש, ואין צורך בציוד חיצוני לפעול. כתוצאה מכך, הם מחזיקים הבטחה גדולה כפלטפורמה לאבחון נקודות של טיפול. על מנת להעריך את השירות כראוי ביצועים אנליטיים של מכשירים מבוססי נייר, שיטות מתאימות חייבות להיות מפותחות על מנת להבטיח הייצור שלהם הוא לשחזור בקנה מידה שמתאים הגדרות במעבדה. בכתב היד הזה, שיטה לפברק ארכיטקטורה לשימוש כללי בבניית מכשירים שיכולים לשמש immunoassays מבוססי נייר מתואר. אנו משתמשים בצורה כלשהי של manufacturin כתוסףg (למינציה רבה שכבתית) להכין תקני מרכיבות מספר שכבות של נייר בדוגמת דבקה בדוגמת. בנוסף הוכחת את השימוש הנכון של תלת ממדי אלה מכשירים microfluidic מבוססי נייר עם immunoassay עבור גונדוטרופין כוריוני אנושי (hCG), שגיאות בתהליך הייצור שעשויים לגרום לכשלים מכשיר הם דנו. אנו מצפים גישה זו לייצור מכשירים מבוסס נייר ימצא כלי רחב בפיתוח יישומים אנליטיים שתוכננו במיוחד עבור הגדרות מוגבלות במשאבים.

נייר זמין נרחב במגוון של ניסוחים או ציונים, יכולה להיות פונקציונלי לכוון את המאפיינים שלו, יכול להעביר נוזלים באופן אוטונומי על ידי פעולת נימים או פתילה. אם הנייר הוא בדוגמת עם חומר הידרופובי (למשל, photoresist ¹ או ² שעווה), את הפתילה של נוזלים ניתן לשלוט מרחבית בתוך שכבה של נייר. לדוגמא, מדגם מימי שימושי יכול להיות מופנה למספר האזורים השונים כדי להגיב עם ריאגנטים כימיים וביוכימיים מאוחסנים בתוך הנייר. מכשירי microfluidic מבוסס נייר אלה הוכחו להיות פלטפורמה שימושית לפיתוח של מבחני אנליטית ניידים וזולים ^{3, 4, 5, 6, 7.} יישומים של מכשירים microfluidic מבוססי נייר כוללים אבחון הצבע של טיפולEF "> 8, ניטור של מזהמים סביבתיים ^9, זיהוי של תרופות מזויפות ^10, ובריאות delocalized (או" טלרפואה ") ב-משאב מוגבל הגדרות ^11.

מספר שכבות של נייר בדוגמת ניתן לקבץ אותם לתוך מכשיר משולב היכן אזורי הידרופילי משכבות שכנות (כלומר, מעל או מתחת) להתחבר מקימים רשתות fluidic רציפות אשר מפרצוני שקעים עשויים להיות יחד או שמאלה עצמאיות. שכבה ¹² כל אחד יכול מהווים דפוס ייחודי, אשר מאפשר הפרדה מרחבית של ריאגנטים מבחני מרובים להתבצע על מכשיר אחד. המכשיר microfluidic תלת ממדי המתקבל הוא לא רק מסוגל הפתילה נוזלים כדי לאפשר מבחני אנליטית (למשל, תפקודי כבד בדיקות ¹³ ו זיהוי אלקטרוכימי של מולקולות קטנות ^14), אבל זה יכול גם supיציאת מספר הפונקציות מתוחכמות (למשל, שסתומי ¹⁵ ופשוט מכונה ¹⁶⁾ המשותף לגישות microfluidic מסורתיות. חשוב לציין, כי נייר פתילות נוזלים על ידי פעולה נימי, מכשירים אלה יכולים להיות מופעלים עם מאמץ מינימאלי מהמשתמש.

מאז ריאגנטים ניתן לאחסן בתוך הארכיטקטורה תלת ממדי של מכשיר המבוסס על נייר, פרוטוקולים מורכבים ניתן לצמצם תוספת אחת של מדגם מימית למכשיר. לאחרונה, הצגנו ארכיטקטורה מכשיר תלת ממדי כללי שניתן להשתמש בהם לפיתוח immunoassays מבוססי נייר בטכניקה שעווה ההדפסה כדי ליצור שכבות בדוגמת. ^{17, 18} מחקרים אלה התמקדו כיצד היבטים הקשורים בעיצוב של המספר-ההתקן של שכבות מוערמות בשימוש, בהרכב השכבות, ואת התבנית של שבשליטת הרשת microfluidic תלת ממדי לכל הכלליותformance של immunoassay. בסופו של דבר, הצלחנו להשתמש בכללים הללו עיצוב להקל על ההתפתחות המהירה של immunoassay מרובב ^19. בכתב היד הזה, immunoassay שפותחו בעבר עבור גונדוטרופין כוריוני אנושי (hCG; הורמון ההריון) ¹⁷ משמש כדוגמה כדי להמחיש את האסטרטגיות שפיתחנו עבור הרכבה וייצור של immunoassays תלת מימדי המבוסס על נייר. בהתאם לכך, אנו מתמקדים ההרכבה וההפעלה של מכשיר ולא לפיתוח assay.

בעוד immunoassay כריך, אשר הוא התבנית המשמשת לאיתור hCG, לכידת נוגדן ספציפי למקטע אחד של ההורמון מצופה על מצע מוצק, אשר נחסם אז להגביל את הספיחה הלא הספציפית של מדגם או כל מגיב שלאחר מכן. המצע הזה הוא לרוב צלחת microwell קלקר (למשל, עבור assay immunosorbent enzyme-linked או ELISA). המדגם הוא אזהתווסף באר מותר דגירה במשך פרק זמן מסוים. לאחר כביסה קפדנית, נוגדן ספציפי לתת יחידה האחרת של hCG מתווסף ואפשר כדי לדגור. נוגדן זה גילוי ניתן מצומדות כדי חלקיק קולואידים, אנזים, או fluorophore כדי לייצר אות למדידה. הבאר נשטפה שוב לפני לפרש את התוצאות של assay (למשל, באמצעות קורא צלחת). בעוד ערכות מסחריות להסתמך על תהליך רב שלבים רבים הפעם, כל השלבים הללו יכולים להתבצע במהירות מכשירי microfluidic מבוסס נייר עם התערבות מינימאלית למשתמש.

המכשיר משמש immunoassay hCG מונה שש שכבות פעילות, אשר הן, מלמעלה למטה, המשמשות בנוסף מדגם, אחסון המצומד, דגירה, ללכוד, לשטוף, כתם (איור 1). ההשכבה בנוסף מדגם עשויה נייר סינון איכותי. זה הופך לפשוט יותר כניסתה של מדגם נוזלי ומגן על ריאגנטים המצומד Layer מזיהום מהסביבה או מגע מקרי על ידי המשתמש. השכבה המצומד (נייר סינון איכותי) מחזיקה מגיב בייצור צבעים (למשל, נוגדן זהב שכותרתו קולואידים) עבור immunoassay. שכבת הדגירה (נייר סינון איכותי) מאפשרת המדגם לנסוע חילופי תפקידים בתוך המטוס של העיתון כדי לקדם מחייב של אנליטי עם ריאגנטים לפני ההגעה לשכבה הבאה, השכבה ללכוד. השכבה ללכוד (קרום ניילון) מכילה ליגנדים ספציפיים עבור אנליטי שנספח החומר. לאחר assay הושלמה, שכבה זו מתגלה כדי לאפשר הדמיה של immunocomplex הושלמה. השכבה לשטוף (נייר סינון איכותי) שואבת עודף נוזלים כולל ריאגנטים חינם המצומד הרחק פני שכבת ללכוד לתוך שכבת כתם (נייר כרומטוגרפיה עבה). המכשיר שש השכבתי מוחזק ביחד על ידי חמש שכבות של דבק בדוגמת, דו צדדי: ארבע שכבות של דבק קבוע לשמור על השלמות של עאסםמכשיר דימם שכבה אחת של דבק נשלף המקלה קילוף של המכשיר כדי לבדוק את התוצאות של immunoassay על השכבה ללכוד.

לצורך כתב יד זה, אנו משתמשים רק דגימות בקרה שליליות וחיוביות של hCG (0 mIU / mL ו -81 mIU / mL, בהתאמה) על מנת לספק תוצאות נציג של immunoassay מבוסס נייר, המאפשר דיון ייעודי של מערכת היחסים בין שיטות ייצור ואת הביצועים של המכשיר. בנוסף הוכחה כיצד לייצר מכשירים בהצלחה, אנו מדגישים כמה שגיאות ייצור שיכול להוביל לכישלון של התקן או תוצאות assay irreproducible. הפרוטוקול והדיון מפורט בכתב היד הזה יספקו לחוקרים עם תובנה חשובה איך immunoassays מבוסס נייר מתוכנן מפוברק. בעוד אנו מתמקדים ההפגנה שלנו על immunoassays, אנו צופים כי הקווים המנחים המוצגים במסמך זה יהיה שימושי רחב לייצור שלושה דימןsional נייר מבוסס מכשירי microfluidic.

1. הכנת שכבות התקן נייר מבוסס Microfluidic

1. הכן תבניות עבור שכבות של נייר, ניילון, דבק באמצעות תוכנה לעיצוב גרפי. ⁶ כל שכבה יכולה להיות תבנית שונה.
   הערה: התבנית עשויה לכלול חורי יישור כי אינם נדרשים עבור immunoassay נייר מבוסס פונקציונלי, אלא לסייע בייצור לשחזור של התקנים תלת ממדי. מיקום החורים האלה יהיו שונים אם מכשירים מורכבים בנפרד, בפסים, או כמו בגיליונות מלאים. תכנית התוכנה המשמשת לעיצוב תבניות עשויה להשתנות בהתבסס על הבחירה של טכניקת דפוסים (למשל, photolithography, הדפסת שעווה, או חיתוך). ⁶
2. רסס את אזור העבודה עם תמיסה של 70% (V / V) אתנול ומים. נגב את אזור העבודה עם מגבת נייר נקייה.

2. הכנת שכבות נייר: לדוגמא תוספת, המצומד חפץ, דגירה, ואת שכבות לשטוף

1. הכנת שכבות של נייר איכותי מסנן באמצעות חותך נייר שולחן גדול. חותכי גיליון מניות של נייר לתוך גודל נייר כדי להקל דפוסים באמצעות מדפסת דיו מוצק (שעווה). לדוגמה, גיליון בודד 460 x 570 מ"מ ² יכול לעשות 4 גיליונות נייר Letter ארה"ב (8.5 x 11 אינץ ^'2). ידית נייר עם כפפות נקיות בכל העת כדי למזער זיהום.
2. טען גיליון נייר חתוך כרומטוגרפיה למגש המדפסת. הדפס שכבות שנועדו קודם לכן (ראה איור 1).
   הערה: דפוס ניתן להדפיס ישירות על-גבי גיליון זה באמצעות הזנה אוטומטית. רק גיליון נייר אחד צריך להיות מודפס בכל פעם, כדי למנוע חסימות נייר. עבור כל השכבות, להשתמש בהגדרות "המשופרות" הדפסה.

3. הכנת שכבת קרום ניילון: Layer הלכידה

1. חותכים את גליל המניות של קרום ניילון לתוך הסדינים (7.5 x 10 אינץ ^'2), בעזרת סכין נייר השולחן. להקדיש תשומת לב רבה בטיפול הניילוןהממברנה כדי לשמור על שלמותה ולהגן מפני קריעה. אחסן כל חומר בשימוש בתוך ארון ייבוש, כמו ממברנות ניילון הן לחות רגישות.
   הערה: גיליונות חתוכים צרים מאשר נייר Letter ארה"ב. בגלל ממברנות ניילון דקות ושבריריים, הם לא יכולים להיות מעובד על ידי המדפסת ישירות ודורשים תמיכה. פרטים בהמשך.
2. שימוש במדפסת שעווה, להדפיס דפוס שכבת ללכוד על גבי פיסת נייר ההעתקה ואת קלטת אותו בקופסת אור לשרת כמדריך המיצוב של קרום ניילון. תיבת אור עזרי היישור של שכבות מרובות.
3. הנח גיליון נייר נקי עותק על הגיליון המודפס בעבר של נייר העתקה. סרט גיליון נייר הנקי אל תיבת האור, אבל לא קלט את יחד שני הגיליונות.
4. מניחים גיליון חתוך של קרום ניילון על פיסת נייר נקי עותק. ודא כי קרום מכסה את השטח המודפס של השכבה התחתונה של נייר העתקה. קלטתי את ארבעת הצדדים של הממברנה הניילון אל העבר הנקישל נייר ההעתקה.
   הערה: ודא כי קרום הניילון הוא שטוח וחלק, כך שאין בעיות עם הדפסה (למשל, חסימות נייר או הדפסה אחידה של שעווה). שעווה ניתן להדפיס על הסרט שבו קרום הניילון מצורף נייר ההעתקה. במקרה כזה, באזורים שבהם ניילון הוא בדוגמת באופן חלקי בשל כיסוי קלטת אמור להיות מושלך. תכשירים בעתיד, חתיכות גדולות של קרום ניילון יכולות לשמש כדי למנוע טעות דפוס זה.
5. טען גיליון של קרום ניילון (הנתמך על ידי נייר העותק המוצמד אליו) לתוך מגש מדפסת הזנה הידני. הדפס רק גיליון קרום ניילון בכל פעם.
   הערה: אין צעדי היערכות הנדרשים עבור השכבה כתם, כפי שהוא לא בדוגמת.

4. יצירת חסמים הידרופובי במסגרת הנדבך מודפס

1. סרט השכבות מודפסות על גבי מסגרת אקריליק אפילו חימום מעל ומתחת השכבה כאשר הניחו בתנור הסעה הכביד. שמור על קרום הניילון מודבקגיליון התמיכה של עותק נייר עד לאחר השעווה נמס ומחסומים הידרופובי נוצרים.
   הערה: מסגרת אקריליק היא פיסת מחוייט, לחתוך ליזר של 1/2 ".. פלסטיק אקרילי עבה שתי מסגרת גדלים בהתאם למספר של מכשירים הנמצאים מפוברקים שמשו הגבול החיצוני של המסגרת הקטנה מודד 11 5/8" x 2 3/4 ", ואת החור הפנימי של המסגרת מודד 10 3/8" x 1 3/4 ". הגבול החיצוני של המסגרת הגדולה מודד 11 5/8" x 8 7/8 ", ואת פנימיים החור של המסגרת מודדת 10 1/4 "x 7 7/8". החלל הפתוח, הפנימי מאפשר אפילו להתכה של שעווה דרך כל עובי הנייר.
2. מניח את השכבות בתנור ב 150 מעלות צלזיוס למשך 30 שניות עד השעווה נמסה לתוך לעובי הנייר. ודא השעווה שחדרה לעובי הנייר על ידי הפיכה אותו שוב בדיקת פגמים בתכנון.
   הערה: תנורי אוויר מאולץ או פלטות עשויים לשמש גם כדי להמס את דיו השעווה המוצק. פעמים התכהאו טמפרטורות עשויות להשתנות בהתאם לשיטת החימום.
3. הסר את נייר ניילון קרום ממסגרת אקריליק. כמו כן, להסיר קרום ניילון מתמיכת גיליון נייר העתקה.

5. הכנת שכבות דבקות

1. גיליונות דו צדדי תבנית של סרטי הדבקה באמצעות פלוטר סכין רובוטית, תוך שימוש בקבצי עיצוב שהוכנו קודם לכן (שלב 1.1). הגן על כל משטח דבק חשוף באמצעות גיליון של אוניית שעווה.
   הערה: דבק דו-צדדי צריך להיות בדוגמת עם חורים המאפשרים המדגם לזרום דרך שכבות כמסלול fluidic רציפה. אוניית שעוות מוסר בקלות מן הדבק, ומשמשת כדי להגן עליו מפני זיהום וקרע במהלך חיתוך. חותך ליזר או למות עיתונות עשויה לשמש גם לשכבות דפוס של סרטי הדבקה.

גיבוי 6. שכבות מכשיר עם דבק

1. רסס את תיבת אור עם תמיסה של 70% (V / V) אתנול ומים. נגב עם חולצת נייר נקיהowel.
2. סרט שכבה בדוגמת נייר או ניילון קרום שצריכה להיות מגובה עם דבק על תיבת אור עם הצד המודפס פונה כלפי מטה.
3. פיל צד אחד של אונייה מגנה מהגיליון בדוגמת של דבק להדביק אותה על השכבה של נייר או קרום ניילון. השתמש בתיבת האור להבטיח התאמה נכונה של תבניות. לחץ יחד. מניחים את המכשיר מפורק למחצה לתוך תלוש מגן.
   הערה: תגית המגן היא דף מקופל של גיבוי סרט למינציה מגן על המכשירים מפני זיהום או ניזק על ידי ההבטחה כי הם לא לפנות גלילי למינציה.
4. להעביר את ההרכבה דו שכבתית וכתוצאה מכך באמצעות למינציה אוטומטית ללחוץ על הדבק ונייר לגמרי ביחד, הסרת כל כיסי אוויר משכבות adjoined.
   הערה: כיסי אוויר בין השכבות של המכשיר יכולים להפריע שלמות מכשיר פתילה שחזור על ידי גרימת דליפות.

7. טיפול המצומד LAyer עם ריאגנטים Immunoassays לפני עצרת תקן

1. שכבת המצומד סרט על מסגרת אקריליק כך אזור הידרופילי שיתייחסו מושעה ולא במגע עם המסגרת.
2. להוסיף 2.5 μl של 100 מ"ג / מ"ל ​​אלבומין בסרום שור (BSA) ב בופר פוספט 1x (PBS) לאזור הידרופילי על השכבה המצומד. אפשר לו להתייבש בטמפרטורת החדר למשך 2 דקות ולאחר מכן ב 65 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות.
   הערה: נפח זה מספיק כדי להרטיב את האזור של נייר. הפתרון BSA מסייעת במניעת הצטברות של חלקיקים קולואידים במהלך תהליך הייבוש, אשר יקל על שחרורו של חלקיקים כאשר נייר ריאגנטים rehydrated ידי המדגם.
3. הוסף 5 μl של 5 OD ננו-חלקיקים מזהב קולואידים מצומדות כדי נוגדן אנטי β-hCG, וחזור על תהליך הייבוש.
   הערה: היחידות של ריכוז חלקיקי זהב colloidal באה לידי ביטוי לעתים קרובות ככל צפיפות אופטית (OD) כפי שהיא נמדדת על ידי absorbance ב λ = 540 ננומטר. אין טיפול נדרש עבור כרית הפתיל לפני ההרכבה מכשירה בסעיף 10.

טיפול 8. ערוץ לרוחב עם מגיב עבור Immunoassays לפני עצרת תקן

1. ערוץ שכבת סרט לרוחב על מסגרת אקריליק כך אזור הידרופילי שיתייחס מושעה ולא במגע עם המסגרת.
2. הוסף 10 μl של חסימת סוכן (5 מ"ג / חלב דל שומן מ"ל ו 0.1% (v / v) Tween 20 ב 1x PBS) לטיפול ערוץ לרוחב. חזור על אותו תהליך ייבוש (2 דקות בטמפרטורת החדר ולאחר מכן ב 65 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות) כשכבת המצומד.

טיפול 9. של שכבה לכידה עם ריאגנטים Immunoassays לפני עצרת תקן

1. שכבת לכידת סרט על מסגרת אקריליק כך אזור הידרופילי שיתייחסו מושעה ולא במגע עם המסגרת.
2. פנקו את שכבת ללכוד עם 5 μL של 1 מ"ג / נוגדן אנטי α-hCG מ"ל ולאחר מכן לאפשרמדגם להתייבש בטמפרטורת החדר למשך 2 דקות ואחריו 8 דקות ב 65 מעלות צלזיוס.
3. הוסף 2 μL של חסימת סוכן (5 מ"ג / חלב דל שומן מ"ל ו 0.1% (v / v) Tween 20 ב 1x PBS). חזור על תהליך הייבוש של השכבה ללכוד.
   הערה: סכום זה מן ראוי לצפות את הניירות בלי שאטם את הנקבוביות של קרום הניילון, אשר יכול לקרות כאשר יותר מדי סוכן חסימה משמש.

נייר מבוסס 10. עצרת של תלת ממד מכשירי microfluidic

1. קלטתי את השכבה לשטוף אל תיבת האור (צד מודפס כלפי מעלה). אם חורי יישור משמשים, להסיר אותם מן השכבות הבאות באמצעות כלי אגרוף גומות כף יד.
2. הסר את הסרט המגן על גב השכבה ללכוד לחשוף את הדבק. יישר את השכבה ללכוד מעל השכבה לשטוף באמצעות חורי יישור כמדריך. לחץ שתי השכבות יחד. אל תיגע באזורי הידרופילי למזער זיהום או נזק להתקן. מלקטת ניתן להשתמש כדי לסייע שנאספוly.
3. הסר את הסרט המגן על גב שכבת הדגירה לחשוף את הדבק. יישר את שכבת הדגירה מעל השכבה ללכוד ולחץ אותם יחד. ממשיך להוסיף שכבות בצורה זו עד שכל השכבות הפעילות מורכבות.
4. מניחים את המכשיר מפורק למחצה לתוך תלוש מגן ובתקיפות לצרף את השכבות יחד באמצעות מכשיר למינציה.
5. הסר את הסרט המגן על גב השכבה לשטוף ו להטביע את שכבת הכתם לתחתית המכשיר. צעד למינציה חזור 10.4 להשלמת ההרכבה של המכשיר microfluidic תלת מימדי המבוסס על נייר. Cut רצוי מספר ההתקנים מן הרצועות או גיליונות של התקנים המורכבים במלואו באמצעות מספריים.
   הערה: גיליונות מלאים של התקנים, רצועות של מכשירים, או התקנים בודדים עשויה להיות מוכנה להשתמש בגישה דומה.

11. ביצוע Immunoassay נייר מבוסס

1. הוסף 20 μl של מדגם לאזור הידרופילי על גבי המכשיר (כלומר, tהוא לדגום שכבה).
2. חכה מדגם פתיל לחלוטין לתוך המכשיר, ולאחר מכן להוסיף 15 μl של חיץ לשטוף (Tween 0.05% v / v 20 ב בופר פוספט 1x). לאחר חיץ aliquot של לשטוף הראשון רשע גמור לתוך המכשיר, להוסיף aliquot שני 15 μl של חיץ לשטוף.
   הערה: לשטוף החיץ יש רשע גמור לתוך המכשיר כאשר אגל הנוזל נעלם, לא מראה המניסקוס על פני השטח של נייר. Assay הוא להשלים כאשר aliquot השני של חיץ לשטוף נכנס לחלוטין את המכשיר.
3. כדי לחשוף את התוצאות של assay, לקלף שלוש השכבות החיצוניות של המכשיר באמצעות פינצטה כדי לחשוף את השכבה ללכוד.
   1. פענח את התוצאות של assay איכותית על ידי התבוננות קיומו או אי קיומו של צבע. לחלופין, תמונת שכבת ההודעה באמצעות סורק שולחני ותוכנה להשתמש בעיבוד תמונה או אלגוריתמים לכמת תוצאות ולאפיין את ההפצות של עוצמת בתוךאזור זיהוי. ²⁰

קבלת הופעות assay לשחזור מכשירי microfluidic מבוסס נייר תלת ממדי מסתמכת על שיטת ייצור המבטיח עקבי בין התקנים. לקראת מטרה זו, זיהינו מספר תהליכי ייצור שיקולים מהותיים, ולדון בהם כאן בהקשר של הוכחת immunoassay מבוסס-נייר. אנו משתמשים בשיטת הדפסת שעווה כדי ליצור מחסומים הידרופובי בתוך מכשירי microfluidic מבוסס נייר (איור 2 א). ² שיטה זו יעילה מכיוון שהוא מסתמך רק על ציוד משרדי נפוץ, דורשת צעדים פרוצדורליים מינימאליים כדי להשלים, ואינו דורשת שימוש בכימיקלים (למשל, photoresists) שעשוי להפריע ספיחת חלבון או לשנות את יכולת הרטיבות של סיבי נייר. יתר על כן, הדפסת שעווה מייצרת מסלולי fluidic עם ממדים לשחזור, שהוא קריטי עבור מבחנים עם הופעות דיר ti משךmes. אחרי המחסומים הידרופובי נוצרים, יריעות דבקות מוחלי שכבות כדי להקל על הרכבה של התקנים תלת ממדים (איור 2 ב). כל ריאגנטים נדרשים immunoassay ניתן ליישם לאחר הסרט הדבק מתווסף לחלק האחורי של שכבה (איור 2 ג). הליך זה שימושי תהליכי ייצור במעבדה אקדמית כי מכשירים רבים ניתן להכין במקביל. תהליך ההרכבה עבור מכשיר immunoassay הושלם לאחר כל השכבות של המכשיר נערמות עם למינציה יחד (איור 2 ד). אנו מוסיפים מדגם להתחיל assay. בדוגמא זו, אנו משתמשים פקד שתן להגדיר לבדיקות הריון, אשר מכיל דגימות שליליות וחיוביות של hCG במאגר, כמו דגימות כדי להדגים את הפעולה של המכשירים שלנו ואת השחזור של מבחנים שבוצע באמצעות אותם. שני aliquots של חיץ לשטוף מתווספים אז ברצף. לאחר aliquot הסופי של חיץ לשטוף נכנס לחלוטין את המכשיר,assay נחשבת מלאה. שלוש השכבות העליונות הם אז התקלפו כדי לחשוף את השכבה ללכוד (איור 3 א). צעד זה באופן בלתי הפיך נזקים המכשיר להבטיח כי זה לא יכול לשמש שוב. השלים תוצאות immunoassay מבוסס נייר בתוך הודעת צבע איכותית שיכול להצביע על תוצר שלילי או חיובי על בדיקה ויזואלית. האובייקטיביות של התוצאות הללו באה לידי ביטוי תמונות המתוקנות רכשו באמצעות וסורק (איור 3 ב).

ניסויים נכשלו לעתים קרובות יכולים לסמן צעדים פרוצדורליים מסוימים שחשיבותו עשוי להיות מורגש אחרת כאשר הניתוח של ניסוי מתמקד תוצאות מוצלחות. אנו מדגימים שלוש שגיאות בייצור והרכבה של מכשירים microfluidic תלת מימדי המבוסס על נייר כי לגרום לכשלים של immunoassay: (i) לפעמים, כשלים המכשיר אינם ברורים עד לאחר assay הושלמה. לדוגמה, מילsalignment בין שכבות המרכיבות את אזור הערוץ ללכוד דגירה יכול לגרום להתפתחות של דפוס חריג האיתות החיובית, אשר עלולים לגרום לפרשנות השגויה של האות האיכותי ידי (איור 4 א) משתמש. (Ii) אם השעווה לא מודפסת כמות מספקת או אסור נמסה לגמרי דרך בעובי המלא של נייר, אז על שלמות המחסומים הידרופובי וכתוצאה מכך עלולה להיות בסכנה. היווצרות מושלמת של חסמים אלה תגרום לאובדן שליטה הפתילה ולהוביל דליפות בתוך המכשיר. לדוגמא, במקום כליאת זרימה לערוץ בתוך שכבה, מחסום שעווה חדיר למחצה יאפשר נוזל פתיל במקום אחר במישור של נייר. בלי ערוצים מוגדרים, המדגם לא סביר להגיע שכבות ללכוד או לשטוף. המשתמש יתפוס טעויות מסוג זה כתקופת משך assay מקוצרת מאוד. אנו מדגימים כשל בהתקן זו על ידי החלת פתרון של צבע מאכל אדום א-להyer שאת דפוס השעווה לא הורש להמס עבור 30 שניות המלאות (איור 4 ב). Immunoassay באמצעות שכבה כזו "של" ב 6 דקות, שונה בבירור מאשר המשך הצפוי של 15 דק '. (Iii) מבחנים כי לוקחים זמן רב יותר מצפוי כדי להשלים עשויה להצביע על תקלה בייצור של מכשיר. לדוגמא, כראוי לחתוך הנקבוביות דבקות או occluded בשל היישום של כמות מוגזמת של חומרים כימיים (למשל, סוכני חסימה או זהב קולואידי) יכול לאסור חיץ מדגם או לשטוף מלהיכנס המכשיר (האיור 4C).

בסך הכל, פרוטוקול הייצור שלנו הוא שימושי לפברק מכשירי microfluidic רבים מבוסס נייר במקביל בסולם כי הוא שימושי עבור מעבדה אקדמית. אנו מדגימים את הביצועים של hCG immunoassay נייר המבוסס מוכנים בשיטה זו על ידי ביצוע 70 מבחנים במקביל: 35 משכפל שלילי ו -35 r חיוביתeplicates. למטרות הדגמה זו, הכנו סט של שכבות עם עיצובים של המכשיר שלנו, מודבקת שכבות של נייר עם דבק, ולאחר מכן לחתוך את הגיליונות לתוך שורות של התקנים. כל גליון היה וחותכים 7 שורות, שהכיל עשרה מכשירים. זה הקל על ההסדר של השכבות על גבי מסגרות אקריליק הקטנות שבו השכבות מוקלטות ולאחר מכן טופלו ריאגנטים הדרושים לביצוע המבחנים. שיטה זו של הכנת התקן הוא הציע בפתק בפרוטוקול. בעקבות הטיפול של שכבות, המכשירים רוכזו רצועות של עשר ולאחר מכן למינציה. לאחר צעדי ייצור מכשיר הסופיים הושלמו, המכשירים נשארו הרצועות של עשרה מדגם נוסף לכל התקן. צפינו שיעור כישלון 0% עבור מכשירים מפוברקים באמצעות הפרוטוקול שלנו. השתמשנו בתוכנה לעיבוד תמונות קוד פתוח ²⁰ לכמת את התוצאות של מבחנים אלה. בעוד מספר שיטות זמינים לנתח את distribut עוצמתיון במקומות עגולים (למשל, רדיאלי או הפצות ליניארי) ²¹ אנו מודדים את העוצמת מתכוון מהערוץ הירוק של בתמונת RGB של המכשיר באמצעות נקודת זיהוי כולו כאזור של עניין. ^{17, 18, 19} לאחר מכן, אנו לנרמל את המידות של מבחנים חיוביים ושליליים על ידי הפחתת הנתונים השליליים הגלם (איור 3 ב). אנחנו נקבע את המקדם שונה עבור כל נתונים מוגדרים להיות 1% עבור מבחנים שבוצעו באמצעות דגימות שליליות ו -3% עבור מבחנים שבוצעו באמצעות דגימות חיוביות.

איור 1: סכמטי של מכשיר המבוסס על נייר תלת ממדי. איור זה מציג את האזורים הידרופובי הידרופילי המגדירים את מסלול fluidic בתוך המכשיר, כמו גם את הפתשכבות erned של דבק קבוע נשלף אשר מחזיק שכבות יחד. כל שכבה מסומנת על ידי הפונקציה הוא מבצע ב assay. המתווה האדומה, כחולה, או ירוקה על כל שכבה מציינת את החומר המשמש לפברק כי שכבה מסוימת (אדום: כרומטוגרפיה נייר, כחול: קרום ניילון, ירוק: נייר כרומטוגרפיה עבה). מידות מקבלות עבור כל אזור בתוך המכשיר במ"מ. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 2: נוהל נהג לפברק immunoassays מתקני microfluidic מבוסס נייר תלת ממדי. תמונות (א) של החלק הקדמי והאחורי של גיליון נייר כרומטוגרפיה בדוגמת באמצעות הדפסת שעווה לפני ואחרי החימום. (ב) גיליון נייר כרומטוגרפיהמגובה עם סרט דבק בדוגמת. (C) טיפולים להחיל את אזורי הידרופילי של רצועה של קרום ניילון בדוגמת. (ד) הרכבה של רצועות של מכשיר multilayer באמצעות תיבת אור וחורים יישור כמדריך. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 3: פירוש תוצאות של immunoassay מבוסס נייר. (א) שלוש השכבות העליונות של המכשיר המבוסס על נייר הם קלופים לאחור כדי לחשוף את השכבה ללכוד לפרש את התוצאות של assay. (ב) ייצוג גרפי של הביצועים של immunoassay מבוסס-נייר hCG. התוצאות המתוארות הן הממוצע של 70 משכפל סימולטני שבו 35 משכפל כל שמש FOr דגימות חיוביות ושליליות של hCG. ברים שגיאה מייצגים את סטיית התקן של ערכת הנתונים. תמונות שלא תוקנו, נציג מתארים חיובי (צבע אדום) ושליליות (צבע לבן) תוצאות של immunoassay hCG מוצגות לעיל הנתונים היחסיים שלהם. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 4: דוגמאות לשגיאות ייצור. (א) בשל חוסר תיאום בין הערוץ לרוחב מעל השכבה ללכוד, האיתות החיובית מרוכזת באזור קטן של אזור ההודעה. A "רטוב" באזור עגול (מתאר מקווקו) ניתן לראות בצד הימין של אזור ההודעה כתוצאה ממגע בין הערוץ לרוחב המיושר עם השכבה ללכוד (משמאל). תמונה של הודעה חיובית עלשכבת לכידתו של מכשיר מיושר כראוי (מימין). (ב) התכה חלקית של שעווה ברחבי עובי שכבה יכולה להוביל דליפות בתוך המכשיר. צבע מאכל נוסף הפתרון לסייע להדמיה של מדגם בשכבות עם חסמי הידרופובי שלמים או מלא-נוצרים. (ג) אינו נאות דבק לחתוך יכול לחסום את הרשת fluidic בין שכבות של נייר, אשר מפסיק את זרימת מדגם. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 5: מכשירי microfluidic מבוסס נייר תלת ממד ייצור. סכמטית מתארת ​​את הרכבת למינציה של מספר שכבות של נייר בדוגמת לתוך התקנים תלת ממדים הושלמו. בדוגמה זו, 70 ג התקניםלהתבצע בו זמנית. השכבות של חורים דבקים ויישור הוסרו מן סכמטית לצורכי פישוט. לאחר הרכבה, מכשירים בודדים ניתן להסיר המשמשים מבחנים. קווי המתאר אדום, כחול וירוק על כל שכבה לציין את החומר המשמש לפברק כי שכבה מסוימת (אדום: נייר כרומטוגרפיה, כחול: קרום ניילון, ירוק: נייר כרומטוגרפיה עבה). הסולם הבר = 25 מ"מ למעט המכשיר הנפרד (מימין), אשר יש ממדים של 12 x 28 מ"מ ^2. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

זיהוי אסטרטגית ייצור לשחזור היא מרכיב חיוני של פיתוח assay. ²² אנו משתמשים בגישה סדרתית, שכבה אחר שכבה לייצר מכשירים microfluidic מבוססי נייר תלת ממדי. בניגוד לשיטות אלה החלים טכניקות קיפול או אוריגמי לייצר מכשירים multilayer מתוך גיליון נייר אחד ^{23, 24} ייצור כתוסף מציע מספר יתרונות: (i) חומרים מרובים יכול להיות משולב לתוך ארכיטקטורה במכשיר אחד, ללא שינוים דרכים וכלים ההדפסה, יישור, או ההרכבה של שכבות. (Ii) סרטי הדבקה בדוגמת ניתן לשלב בתהליך ההרכבה. סרטים אלה להדביק שכבות סמוכות, ועל סמך על כוחו של הדבק, יכולים להיות הפיך לאפשר קילוף והערכה בשכבות פנימיות. יתר על כן, דבקים לספק שלמות מבנית למכשיר תלת ממדי, אשר מונע את הצורךעבור קלסר ²⁵ קליפים או מתחמים במכונה. ²³ (iii) גיליונות נייר בודדים כרומטוגרפיה המכתב בארה"ב יכול להכיל מערך של משכפל, אשר יכול לשפר את התפוקה של מעבדה בהיקף ייצור (איור 5) מאוד. זה מועיל במיוחד כאשר אנו מעריכים תנאי ניסוי רבים הדורשים משכפל טכני. לפי גישה זו, 70 התקנים תלת ממדים המבוסס על נייר ניתן להכין בו זמנית. (iv) גישות דומה למינציה multilayer משמשות לייצור בנפח הגבוה של מוצרים מסחריים רבים בריאות (למשל, פצע תחבושות טיפול תיקוני דרך עור), אשר כתוצאה מכך מוריד את מחסום ייצור תרגום מכשירי microfluidic מבוסס נייר תלת ממדי אלה.

בנוסף להקל פילינג והרכבה, הבחירה של דבק הוא גם קריטי בעיצוב של רשת fluidic תלת ממדי. פרסומתהסרט hesive יכול לשמש מחסום נוסף בין שכבות של נייר, אשר יכול לאפשר מיסוך של אזורי הידרופילי על שכבות סמוכות. בפועל, השימוש של שכבות דקיקות של דבק רצוי. אם הדבק עבה מדי (למשל, קלטות דו צדדיות רבות), אזי הפער שנוצר בין השכבות של נייר יהיה גדול מדי כדי להקל פתילה וצריך מתמלא בחומר הידרופילי (למשל, אבקה תאית) להחזיר לעצמם פעולות. ¹² בעוד צעד נוסף זה מוסיף מורכבות לייצר ואת החומר המשמש עלול להפריע מבחנים מסוימים, הפערים אלה הופכים תכונה שימושית לייצור שסתום לשליטה, fluidic שכיבות למטה. ¹⁵ צורות אחרות של דבק שימשו בייצור של מכשירים microfluidic תלת מימדי המבוסס על נייר. תרסיסים דבקים להציע שיטה פשוטה להדביק שכבות זו לזו. ²⁶ באמצעות שיטה זו, החומר הדבק מוחל באופן אחיד על שני tהוא אזור הידרופובי הידרופילי של נייר. יתרון שיטה זו הוא כי ציוד נוסף (למשל, פלוטר סכין או חותך לייזר) אין צורך לעצב את התבנית עבור שכבת דבק. עם זאת, תנאי היישום האחיד של ספריי דבק חייבים להיקבע באופן ניסיוני עבור כל סוג של חומר המשמש. הטופוגרפיה של החומר עלולה להשפיע על הממשק מודבק חומר ושעות ספריי עוד עשויות להיות נחוצות עבור משטחים מחוספסים. בנוסף, ריסוס דבק על אזורי הידרופילי של מסלול fluidic עלול לגרום פתילה לקויה על ידי שינוי ביכולת הרטיבות של העיתון. לחלופין, את השימוש סטנסילים ²⁷ או מסך הדפסת ⁸ ניתן להשתמש כדי דבק דפוס ישירות על גבי שכבות של נייר בדוגמת.

שני שיקולים מרכזיים לפיתוח תלת ממד מכשירי microfluidic מבוסס נייר הם הבחירה של חומרים ואת העיצוב של fluiרשת דסק"ש. (I) אנחנו בוחרים חומרים ושילובים של חומרים המבוססים על שיעור הפתילה, כוח רטוב, עובי, וקיבולת מחייב חלבון. שיעור פתילה יכול להשפיע על המשך הזמן של assay והכמות ריאגנטים פעם יצטרך להגיב או לאגד בתוך שכבה. דרגות שונות של נייר מאופייני פתילת תעריפים על בסיס, למשל, הטיפול של נייר, הנקבובי שלו, והעובי שלה. אפשר להשתמש שכבות של נייר מרובים להגביר את קצב הפתילה היעיל של התקן. ²⁸ כוח להרטיב טוב רצוי עבור יישומים הדורשים טיפול (למשל, קולף immunoassay) לאחר שהמכשיר כבר רווי מדגם. חומרים כי הם עבים מדי או כי לא יכולים להיות מועברים באמצעות מדפסת מסחרית בשל שברירי ידרשו שיטה חלופית כדי לייצר ערוצים בדוגמת (למשל, photolithography). עם זאת, בניגוד, חומרים עבים הם אידיאליים עבור שכבות כתם (או כיורים) לצייר נוזלים דרך המכשיר ה. ציונים רבים של ממברנות ניילון זמינים מסחרית, אשר עשוי להיות שונה ביכולתם לקשור חלבונים בלתי הפיך לאזור הלכידה. החלפות חומר (למשל, nitrocellulose במקום קרום ניילון) יכולים גם להשפיע יכולת קשירה, אשר עשויים להשפיע על הרגישות של assay. (ii) שימוש סימטריה בעיצוב של רשתות fluidic מבטיח כי הערוצים הייחודיים בדוגמת לתוך התקנים תלת ממדים מתנהגים באופן זהה (למשל, מלא בו זמנית), שהוא קריטי עבור מבחנים מרובבים. ¹⁹ סימטריה נוספת מפשט עיצוב שכבה, מסייעת עם יישור שכבה כאשר הרכבת גיליונות של התקנים מלאים, והוא יכול לצמצם את הבזבוז. עשיית שינויים בעיצוב המכשיר יכול להשפיע על הביצועים של assay. לדוגמא, הגדלת האורך התעלה לרוחב בשכבת הדגירה תשפיע על משך הזמן של assay, כי הנוזל יהיה פתיל למרחק גדול יותר באופן יחסי לפני שהגיע outlet. ¹⁷ יישומים המסתמכים על הכריכה של biomolecule היעד, זמן assay עוד עשוי להיות יתרון משום שהוא יכול להגדיל את החלק היחסי של מינים כבול, שכותרתו לפני קיבוע על השכבה ללכוד.

לסיכום, הצגנו שיטה לפברק מכשירים microfluidic תלת מימדי המבוסס על נייר התומכים בפיתוח immunoassays. שיטה זו, אשר משתמשת בסוג של ייצור כתוסף לייצר מכשירים multilayer, הופך לפשוט את הייצור של המכשירים בקנה מידה כי הוא מתאים מחקר במעבדה. הפרוטוקול המתואר בכתב היד הזה הוא ספציפי עבור מכשירי immunoassay מבוסס נייר; עם זאת, אנו צופים כי הנהלים הקשורים למכלול של הדפסה immunoassays שעווה אלה, patterning דבק, יישור שכבות, רבוד-יהיה להארכה בקלות ארכיטקטורות תלת מימדי המבוסס על נייר microfluidic מכשיר רבים. הבנת המתודולוגיה ייצור יכול להוביללפיתוח מבחני נקודות של טיפול חדש עם מגוון רחב של יישומים בתחום שירותי בריאות, איכות סביבה וחקלאות.

The authors have nothing to disclose.

This work was supported by Tufts University and by a generous gift from Dr. James Kanagy. This material is based upon work supported by the National Science Foundation Graduate Research Fellowship Program under Grant No. (DGE-1325256) that was awarded to S.C.F. D.J.W. was supported by a U.S. Department of Education GAANN fellowship. We thank Dr. Jeremy Schonhorn (JanaCare), Dr. Jason Rolland (Carbon3D), and Rachel Deraney (Brown University) for helping develop the design of the three-dimensional paper-based microfluidic device and immunoassay.