Fabrication de dispositifs microfluidiques à base de papier en trois dimensions pour les immunoessais

Nous détaillons une méthode pour fabriquer des dispositifs microfluidiques à base de papier en trois dimensions pour une utilisation dans le développement de immunoessais. Notre approche à l'ensemble de dispositif est un type d'empilement, la fabrication additive. Nous démontrons un dosage immunologique en sandwich pour obtenir des résultats représentatifs de ces types de dispositifs à base de papier.

Papier évacue les fluides de manière autonome en raison de l'action capillaire. En papier motif avec des barrières hydrophobes, le transport des fluides peut être contrôlée et dirigée dans une couche de papier. En outre, l'empilement de plusieurs couches de papier à motifs crée des réseaux microfluidiques tridimensionnels sophistiqués qui peuvent soutenir le développement de tests analytiques et bioanalytiques. dispositifs microfluidiques sur support papier sont peu coûteux, portable, facile à utiliser et ne nécessitent aucun équipement externe pour fonctionner. En conséquence, ils sont très prometteurs comme plate-forme pour le diagnostic de point de soins. Afin d'évaluer correctement l'utilité et la performance analytique des dispositifs à base de papier, des méthodes appropriées doivent être développés pour assurer leur fabrication est reproductible et à une échelle qui est appropriée pour les paramètres de laboratoire. Dans ce manuscrit, un procédé de réalisation d'une architecture générale de l'appareil qui peut être utilisé pour des analyses immunologiques à base de papier est décrite. Nous utilisons une forme de manufacturin additifg (multi-couche lamination) pour préparer des dispositifs qui comprennent plusieurs couches de papier à motifs et de l'adhésif à motifs. En plus de démontrer la bonne utilisation de ces dispositifs microfluidiques sur support papier en trois dimensions avec un dosage immunologique pour la gonadotrophine chorionique humaine (hCG), des erreurs dans le processus de fabrication qui peuvent entraîner des défaillances de l'appareil sont discutées. Nous prévoyons que cette approche de la fabrication de dispositifs à base de papier trouveront une large utilité dans le développement d'applications analytiques conçues spécifiquement pour les paramètres à ressources limitées.

Le papier est largement disponible dans une gamme de formulations ou de classes, peuvent être fonctionnalisés pour régler ses propriétés, et peut transporter des fluides de manière autonome par action capillaire ou mèche. Si le papier est modelée avec une substance hydrophobe (par exemple, résine photosensible ou ^une cire ^2), l'effet de mèche des fluides peut être commandé dans l' espace intérieur d' une couche de papier. Par exemple, un échantillon aqueux appliqué peut être dirigé dans un certain nombre de zones différentes à réagir avec des réactifs chimiques et biochimiques stockées dans le papier. Ces dispositifs microfluidiques sur support papier ont été démontrés pour être une plate - forme utile pour le développement de tests portatifs et peu coûteux d' analyse ^{3, 4, 5, 6, 7.} Applications de dispositifs microfluidiques sur papier comprennent le diagnostic de point de soinsef "> 8, la surveillance des contaminants de l' environnement ^9, la détection des produits pharmaceutiques contrefaits ^10, et de la santé délocalisée (ou« télémédecine ») en ressources limitées réglages ^11.

Plusieurs couches de papier à motifs peuvent être assemblés en un dispositif intégré où les zones hydrophiles de couches voisines ( par exemple, au- dessus ou au- dessous) se connectent pour former des réseaux fluidiques continus dont les entrées et les sorties peuvent être couplés ou à gauche indépendant. ¹² Chaque couche peut comporter un motif unique, ce qui permet la séparation spatiale des réactifs et de multiples dosages à effectuer sur un dispositif unique. Le dispositif microfluidique résultant en trois dimensions est non seulement capable de mèche des fluides pour permettre des essais analytiques (par exemple, la fonction hépatique teste ¹³ et détection électrochimique de petites molécules ^14), mais elle peut aussi suple port d' un certain nombre de fonctions sophistiquées (par exemple, les vannes ¹⁵ et simples machines ¹⁶⁾ communes aux approches microfluidiques traditionnelles. Il est important, parce que le papier évacue les fluides par action capillaire, ces dispositifs peuvent fonctionner avec un minimum d'effort de l'utilisateur.

Etant donné que les réactifs peuvent être stockés au sein de l'architecture tridimensionnelle d'un dispositif à base de papier, des protocoles complexes peuvent être réduites à une seule addition d'un échantillon aqueux à un dispositif. Récemment, nous avons introduit une architecture de dispositif en trois dimensions général qui peut être utilisé pour le développement d'immuno-essais à base de papier en utilisant la technique de la cire d'impression pour créer des couches à motifs. ^{17, 18} Ces études ont porté sur la façon dont les aspects liés à la conception du dispositif nombre de couches empilées utilisées, la composition des couches, et le motif de la microfluidique réseau contrôlé par l'ensemble par trois dimensionsperformance du test immunologique. En fin de compte, nous avons pu utiliser ces règles de conception pour faciliter le développement rapide d'un dosage immunologique multiplexé ^19. Dans ce manuscrit, un dosage immunologique préalablement développé pour la gonadotrophine chorionique humaine (hCG, hormone de grossesse) ¹⁷ est utilisé comme un exemple pour illustrer les stratégies que nous avons mis au point pour l'assemblage et la fabrication des immunoessais à base de papier en trois dimensions. En conséquence, nous nous concentrons sur le montage et le fonctionnement d'un dispositif plutôt que le développement d'un test.

Dans un dosage immunologique en sandwich, qui est le format utilisé pour la détection de hCG, un anticorps de capture spécifique à une sous-unité de l'hormone est appliquée sur un substrat solide, qui est ensuite bloqué et pour limiter l'adsorption non spécifique d'un échantillon ou un réactif subséquent. Ce substrat est le plus souvent une plaque de micropuits de polystyrène (par exemple, pour un dosage immuno-enzymatique ou ELISA). L'échantillon est alorsajouté à un puits et on laisse incuber pendant une période de temps. Après un lavage rigoureux, un anticorps spécifique à l'autre sous-unité de hCG est ajoutée et laissée à incuber. Cet anticorps de détection peut être conjugué à une particule colloïdale, une enzyme ou un fluorophore en vue de produire un signal mesurable. Le puits est à nouveau lavé avant l' interprétation des résultats d'un essai (par exemple, en utilisant un lecteur de plaque). Alors que les kits commerciaux comptent sur ce processus en plusieurs étapes de temps, toutes ces étapes peuvent être effectuées rapidement dans des dispositifs microfluidiques à base de papier avec une intervention minimale de l'utilisateur.

Le dispositif utilisé pour le dosage immunologique de hCG comprend six couches actives, qui sont, de haut en bas, utilisés pour addition de l' échantillon, le stockage conjugué, incubation, capture, lavage et blot (Figure 1). La couche d'addition d'échantillon est réalisé à partir de papier filtre qualitatif. Il facilite l'introduction d'un échantillon liquide et protège les réactifs dans le conjugué layer de la contamination de l'environnement ou du contact accidentel par l'utilisateur. La couche de conjugué (papier filtre qualitatif) maintient le réactif de production de couleur (par exemple un anticorps marqué à l'or colloïdal) pour le dosage immunologique. La phase d'incubation (papier-filtre qualitatif) permet à l'échantillon de se déplacer latéralement dans le plan du papier afin de favoriser la liaison de l'analyte avec les réactifs avant d'atteindre la couche suivante, la couche de capture. La couche de capture (membrane de nylon) contient des ligands spécifiques de l'analyte adsorbé sur le matériau. Une fois le test terminé, cette couche est révélée pour permettre la visualisation du complexe immun terminée. La couche de lavage (papier filtre qualitatif) attire l'excès de fluides y compris les réactifs conjugués libres loin de la face de la couche de capture dans la couche de transfert (papier de chromatographie d'épaisseur). Le dispositif à six couches est maintenu par cinq couches de motifs, de l'adhésif double face: quatre couches d'adhésif permanent à maintenir l'intégrité de l'assemDispositif saignés et une couche d'adhésif amovible facilite le pelage de l'appareil pour inspecter les résultats de l'immuno-essai sur la couche de capture.

Aux fins de ce manuscrit, on utilise uniquement des échantillons témoins positifs et négatifs de la hCG (0 mUI / ml et 81 mIU / ml, respectivement) pour obtenir des résultats représentatifs d'un dosage immunologique à base de papier, ce qui permet une analyse dédiée de la relation entre des procédés de fabrication et les performances d'un dispositif. En plus de démontrer comment fabriquer des dispositifs avec succès, nous mettons en évidence plusieurs erreurs de fabrication qui pourraient conduire à l'échec d'un dispositif ou des résultats d'analyse reproductibles. Le protocole et la discussion détaillée dans ce manuscrit fourniront aux chercheurs des informations précieuses sur la façon dont immunoessais à base de papier sont conçus et fabriqués. Alors que nous nous concentrons notre démonstration sur immunoessais, nous nous attendons à ce que les lignes directrices présentées ici seront largement utiles pour la fabrication de trois dimensionnel papier à base de dispositifs microfluidiques.

1. Préparation de couches de dispositif microfluidique sur support papier

1. Préparer des modèles pour des couches de papier, le nylon, et de l'adhésif à l'aide d'un logiciel de conception graphique. ⁶ Chaque couche peut avoir un motif différent.
   NOTE: Le motif peut comprendre des trous d'alignement qui ne sont pas nécessaires pour un dosage immunologique à base de papier-fonctionnel, mais aider à la fabrication reproductible des dispositifs en trois dimensions. Le placement de ces trous sera différente si les appareils sont assemblés individuellement, en bandes ou en feuilles entières. Le programme de logiciel utilisé pour concevoir des modèles peut varier en fonction du choix de la technique de mise en forme (par exemple, la photolithographie, l' impression de cire, ou de coupe). ⁶
2. Vaporiser la zone de travail avec une solution de 70% (v / v) d'éthanol et d'eau. Essuyez la zone de travail avec une serviette en papier propre.

2. Préparation de couches de papier: Exemples Addition, Conjugate Stockage, incubation et Layers Wash

1. Préparer des couches de papier filtre qualitatif en utilisant un grand coupeur de papier de table. Coupez une feuille de stocks de papier dans un format de papier standard pour faciliter la structuration en utilisant une encre solide (cire) imprimante. Par exemple, un seul mm ² feuille 460 x 570 peut faire 4 feuilles de papier Lettre US (8,5 x 11 pouces ^2). Manipulez le papier avec des gants propres en tout temps afin de minimiser la contamination.
2. Chargez une feuille de papier de chromatographie coupée dans le bac de l'imprimante. Imprimer couches précédemment conçus (voir Figure 1).
   NOTE: Un motif peut être imprimé directement sur cette feuille en utilisant l'alimentation automatique. Une seule feuille de papier doit être imprimé à la fois pour éviter les bourrages papier. Pour toutes les couches, utilisez les paramètres d'impression "Enhanced".

3. Préparation de Nylon Membrane couche: Couche de capture

1. Couper le stock rouleau de membrane en nylon en feuilles (7,5 x 10 pouces ²⁾ à l' aide d' un coupe-papier de table. Prenez grand soin dans la manipulation du nylonmembrane pour maintenir son intégrité et la protection contre l'extraction. Rangez tout matériau utilisé dans une armoire dessiccateur, comme des membranes de nylon sont sensibles à l'humidité.
   NOTE: Couper les feuilles sont plus étroites que le papier US Letter. Parce que des membranes de nylon sont minces et fragiles, ils ne peuvent pas être traitées par l'imprimante directement et ont besoin de soutien. Les détails sont discutés ci-dessous.
2. Utilisation d'une imprimante à cire, imprimer un motif de couche de capture sur une feuille de papier de copie et de la coller sur une boîte à lumière pour servir de guide pour le positionnement de la membrane en nylon. La boîte à lumière facilite l'alignement des couches multiples.
3. Placez une feuille de papier de copie sur la feuille imprimée précédemment du papier de copie. Tape le feuille de papier propre à la boîte de lumière, mais ne tape les deux feuilles ensemble.
4. Placez une feuille de membrane en nylon de coupe sur le morceau de papier propre copie. Assurez-vous que la membrane couvre la zone imprimée de la couche inférieure du papier de copie. Collez les quatre côtés de la membrane en nylon à la feuille blanchede copier papier.
   REMARQUE: Assurez - vous que la membrane en nylon est plane et lisse afin qu'il n'y ait pas de problèmes avec l' impression (par exemple, des bourrages papier ou impression inégale de cire). La cire peut être imprimée sur la bande où la membrane en nylon est fixé sur le papier de copie. Si cela se produit, les zones où le nylon est incomplètement à motifs en raison de la couverture de la bande doivent être jetés. Pour les préparations à venir, les gros morceaux de membrane en nylon peuvent être utilisées pour éviter cette erreur d'impression.
5. Chargez une feuille de membrane de nylon (soutenu par le papier de copie apposé) dans le bac manuel de l'imprimante d'alimentation. Imprimer une seule feuille de membrane de nylon à la fois.
   NOTE: Il n'y a pas d'étapes de préparation requises pour la couche de transfert, car il n'a pas été modelée.

4. Création d'obstacles hydrophobes dans la couche imprimée

1. Collez les couches imprimées sur un cadre en acrylique, même pour le chauffage au-dessus et en dessous de la couche lorsqu'elle est placée dans un four à convection par gravité. Gardez la membrane en nylon collé surla feuille de support de papier de copie jusqu'à ce que la cire est fondue et les barrières hydrophobes sont formées.
   NOTE: Le cadre acrylique est un morceau découpé au laser sur mesure de 1/2 ".. Plastique acrylique épaisse Deux tailles d'image en fonction du nombre de dispositifs en cours de fabrication ont été utilisés La bordure extérieure du cadre plus petite mesure 11 5/8" x 2 3/4 ", et le trou intérieur du cadre mesure 10 3/8" x 1 3/4 ". la bordure extérieure du cadre plus large mesure 11 5/8" x 8 7/8 ", et l'intérieur trou du cadre mesure 10 1/4 "x 7 7/8". l'espace ouvert, intérieur permet même pour faire fondre de la cire à travers toute l'épaisseur du papier.
2. Placer les couches dans le four à 150 ° C pendant 30 secondes jusqu'à ce que la cire fond dans l'épaisseur du papier. Assurez-vous que la cire a imprégné l'épaisseur du papier en le retournant et la vérification des imperfections dans la conception.
   NOTE: Forced fours à air ou plaques peuvent également être utilisés pour faire fondre la cire d'encre solide. temps de fusionou les températures peuvent varier en fonction du procédé de chauffage.
3. Retirez le papier et membrane en nylon du cadre acrylique. En outre, retirer la membrane en nylon de feuille de support de papier de copie.

5. Préparation de couches adhésives

1. feuilles recto-verso Motif de films adhésifs en utilisant un couteau traceur robotique, à l'aide des fichiers de conception préalablement préparés (étape 1.1). Protéger toute surface adhésive exposée en utilisant une feuille de cire liner.
   NOTE: L'adhésif double face doit être modelée avec des trous qui permettent à l'échantillon de circuler à travers les couches comme une voie fluidique continue. Le revêtement de cire est facilement retiré de l'adhésif, et qui sert à le protéger contre toute contamination et de déchirement lors de la coupe. Un dispositif de coupe au laser ou meurent presse peut également être utilisé pour les couches de motif de films adhésifs.

6. Sauvegarde des couches de l'appareil avec l'adhésif

1. Vaporiser la boîte à lumière avec une solution de 70% (v / v) d'éthanol et d'eau. Essuyer avec un papier propre towel.
2. Ruban une couche à motif de papier ou d'une membrane en nylon qui doit être soutenu par un adhésif sur la boîte à lumière avec le côté imprimé vers le bas.
3. Peel un côté de la pellicule protectrice de la feuille d'adhésif à motifs et l'apposer sur la couche de papier ou d'une membrane en nylon. Utilisez la boîte de lumière pour assurer un bon alignement des motifs. Appuyez ensemble. Placez l'appareil partiellement assemblé dans un glissement de protection.
   NOTE: Le glissement de protection est une pièce de film pliée lamination support qui protège les dispositifs de contamination ou des dommages en veillant à ce qu'ils ne touchent pas les rouleaux de plastifier.
4. Passez l'assemblage à deux couches résultant à travers un lamineur automatisé pour appuyer complètement l'adhésif et du papier ainsi que, en supprimant les poches d'air dans les couches accolées.
   NOTE: Les poches d'air entre les couches du dispositif peuvent interférer avec l'intégrité de l'appareil et évacue la reproductibilité en provoquant des fuites.

7. Traitement de la L Conjuguéayer avec Réactifs pour immunoessais Avant Assemblée Device

1. Ruban couche de conjugué sur une trame acrylique de telle sorte que la zone hydrophile à traiter est suspendue et non en contact avec le cadre.
2. Ajouter 2,5 ul de 100 mg / ml de sérum-albumine bovine (SAB) dans 1 x tampon phosphate salin (PBS) à la zone hydrophile sur la couche de conjugué. Laisser sécher à la température ambiante pendant 2 minutes et ensuite à 65 ° C pendant 5 min.
   NOTE: Ce volume est juste assez pour mouiller la zone du papier. La solution de BSA aide à empêcher l'agrégation des nanoparticules colloïdales lors du processus de séchage, ce qui facilite la libération des nanoparticules lorsque le papier et les réactifs sont réhydratées par l'échantillon.
3. Ajouter 5 pi 5 OD colloïdale nanoparticule d'or conjugué à l'anticorps anti-β-hCG, et répéter le processus de séchage.
   Remarque: les unités de concentration de nanoparticules d'or colloïdal sont souvent exprimés en densité optique (DO) mesurée par absorbance à λ = 540 nm. Aucun traitement est nécessaire pour le pad de mèche avant l'assemblage de l'appareil à la section 10.

8. Traitement des Lateral Canal avec le réactif pour immunoessais Avant Assemblée Device

1. couche de canal latéral de la bande sur un châssis acrylique de telle sorte que la zone hydrophile à traiter est suspendue et non en contact avec le cadre.
2. Ajouter 10 ul d'agent de blocage (5 mg / ml de lait écrémé et 0,1% (v / v) de Tween 20 dans du PBS 1X) pour traiter le canal latéral. Répéter la même opération de séchage (2 min à température ambiante puis à 65 ° C pendant 5 min) en tant que couche de conjugué.

9. Le traitement de la couche de capture avec Réactifs pour immunoessais Avant Assemblée Device

1. Ruban couche de capture sur un châssis acrylique de telle sorte que la zone hydrophile à traiter est suspendue et non en contact avec le cadre.
2. Traiter la couche de capture avec 5 pi de 1 mg / ml d'anticorps anti-α-hCG, puis laisser laéchantillon à sécher à la température ambiante pendant 2 min, suivie de 8 min à 65 ° C.
3. Ajouter 2 ul d'agent de blocage (5 mg / ml de lait écrémé et 0,1% (v / v) de Tween 20 dans du PBS 1X). Répéter le processus de séchage de la couche de capture.
   NOTE: Ce montant est approprié pour enrober les papiers sans obstruer les pores de la membrane en nylon, qui peut se produire lorsque trop l'agent beaucoup de blocage est utilisé.

Dispositifs microfluidiques sur support papier 10. Ensemble de trois dimensions

1. Cassette la couche de lavage à la boîte de lumière (côté imprimé vers le haut). Si les trous d'alignement sont utilisés, retirez-les couches suivantes à l'aide d'un outil de perforation de poche.
2. Retirez le film protecteur sur le dos de la couche de capture pour exposer l'adhésif. Aligner la couche de capture ci-dessus la couche de lavage en utilisant les trous d'alignement comme guide. Appuyez sur les deux couches ensemble. Évitez de toucher des zones hydrophiles pour minimiser la contamination ou des dommages à l'appareil. Brucelles peuvent être utilisés pour aider les assembly.
3. Retirer le film de protection sur le dos de la couche d'incubation pour exposer l'adhésif. Alignez la couche d'incubation dessus de la couche de capture et les presser ensemble. Continuez à ajouter des couches de cette manière jusqu'à ce que toutes les couches actives sont assemblés.
4. Placez l'appareil partiellement assemblé dans un glissement de protection et apposer fermement les couches ensemble en utilisant une plastifieuse.
5. Retirez le film protecteur sur le dos de la couche de lavage et fixer la couche de transfert vers le bas de l'appareil. étape de lamination Repeat 10,4 pour compléter l'ensemble du dispositif microfluidique à base de papier en trois dimensions. Cut désiré nombre de périphériques à partir de bandes ou de feuilles de dispositifs entièrement assemblés à l'aide de ciseaux.
   NOTE: Feuilles complètes des appareils, des bandes de dispositifs ou appareils individuels peuvent être préparés en utilisant une approche similaire.

11. Exécution d'une Immunoassay à base de papier

1. Ajouter 20 ul d'un échantillon à la zone hydrophile sur la partie supérieure du dispositif ( par exemple, le til échantillonner couche).
2. Attendez que l'échantillon à évacuer complètement dans l'appareil, puis ajouter 15 pi de tampon de lavage (0,05% v / v de Tween 20 dans 1x tampon phosphate salin). Après la première aliquote de tampon de lavage a Wicked complètement dans le dispositif, ajouter une seconde partie aliquote de 15 pi de tampon de lavage.
   REMARQUE: Le tampon de lavage a complètement méchant dans l'appareil lorsque la gouttelette de liquide a disparu, ne montrant aucun ménisque sur la surface du papier. Le test est terminé lorsque la seconde partie aliquote de tampon de lavage a complètement pénétré dans l'appareil.
3. Pour révéler les résultats de l'essai, décoller les trois couches supérieures de l'appareil en utilisant des pinces pour exposer la couche de capture.
   1. Interpréter les résultats de l'analyse qualitativement en observant la présence ou l'absence de couleur. Sinon, l'image de la couche de lecture à l'aide d'un scanner de bureau et utiliser un logiciel de traitement d'image ou des algorithmes pour quantifier les résultats et caractériser les distributions d'intensité dans unzone de détection. ²⁰

L'obtention des performances d'essai reproductibles dans des dispositifs microfluidiques à base de papier en trois dimensions repose sur un procédé de fabrication qui assure la cohérence entre les dispositifs. Pour atteindre cet objectif, nous avons identifié un certain nombre de procédés de fabrication et des considérations matérielles, et d'en discuter ici dans le cadre de la démonstration d'un test immunologique à base de papier. Nous utilisons une méthode d'impression de cire pour former des barrières hydrophobes au sein des dispositifs microfluidiques à base de papier (Figure 2A). ² Cette méthode est idéale car elle repose uniquement sur largement disponible le matériel de bureau, nécessite des étapes procédurales minimales à remplir, et ne nécessite pas l'utilisation de produits chimiques (par exemple, les photoréserves) qui pourraient interférer avec l' absorption de protéines ou de modifier la mouillabilité des fibres de papier. En outre, l'impression de cire produit voies fluidiques avec des dimensions reproductibles, ce qui est essentiel pour les essais avec des performances reproductibles et la durée times. Une fois que les barrières hydrophobes sont formées, des feuilles adhésives sont appliquées à des couches pour faciliter le montage des dispositifs à trois dimensions (figure 2B). Tous les réactifs nécessaires à l'analyse immunologique peut être appliqué après que le film adhésif est ajouté à l'arrière d'une couche (figure 2C). Cette procédure est utile pour des procédés de fabrication à un laboratoire académique, car de nombreux dispositifs peuvent être préparés en parallèle. Le procédé d'assemblage d'un dispositif d'immuno - essai est terminée après que toutes les couches du dispositif sont empilées et stratifiées ensemble (figure 2D). Nous ajoutons échantillon pour commencer le test. Dans cet exemple, nous utilisons un contrôle d'urine fixée pour les tests de grossesse, qui contient des échantillons négatifs et positifs de hCG dans un tampon, comme échantillons pour démontrer le fonctionnement de nos appareils et la reproductibilité des tests effectués à les utiliser. Deux aliquotes de tampon de lavage sont ensuite ajoutés séquentiellement. Une fois que la dernière aliquote de tampon de lavage est complètement entré dans le dispositif, letest est considéré comme complet. Les trois premières couches sont ensuite pelées pour révéler la couche de capture (figure 3A). Cette étape irréversible endommage le dispositif assurant qu'il ne peut pas être utilisé à nouveau. La réalisation d'un résultat de dosage immunologique à base de papier dans une lecture de couleur qualitative qui peuvent indiquer une sortie positive ou négative lors de l'inspection visuelle. L'objectivité de ces résultats est apparent dans les images non corrigées acquises au moyen d' un scanner à plat (figure 3B).

Les expériences ratées peuvent souvent mettre en évidence certaines étapes de la procédure dont l'importance peut être autrement imperceptible lorsque l'analyse d'une expérience est axée sur des résultats positifs. Nous démontrons trois erreurs dans la fabrication et l'assemblage des dispositifs en trois dimensions sur papier microfluidiques qui aboutissent à des échecs de l'analyse immunologique: (i) De temps en temps, les défaillances de l'appareil ne sont pas apparents qu'après un essai est terminé. Par exemple, une misalignment entre les couches constituant la zone de canal et la capture d'incubation peut provoquer le développement d'un motif irrégulier dans le signal positif, ce qui peut conduire à une interprétation erronée du signal de qualité par l'utilisateur (figure 4A). (Ii) Si la cire est pas imprimé en quantité suffisante ou non autorisé à fondre complètement à travers toute l'épaisseur du papier, l'intégrité des barrières hydrophobes résultant peut être compromise. formation incomplète de ces obstacles entraînera une perte de contrôle sur l'effet de mèche et conduire à des fuites au sein de l'appareil. Par exemple, au lieu de confiner l'écoulement vers un canal à l'intérieur d'une couche, une barrière de cire semi-perméable permet au fluide de mèche ailleurs dans le plan du papier. Sans canaux définis, l'échantillon est peu probable d'atteindre les couches de capture ou de lavage. L'utilisateur percevra ce genre d'erreur comme un temps de durée d'essai grandement raccourci. Nous démontrons cette défaillance du dispositif en appliquant une solution de colorant alimentaire rouge à layer dont le motif cire n'a pas été autorisé à fondre pour la pleine 30 sec (figure 4B). Un dosage immunologique utilisant une telle couche a été "complété" à 6 min, ce qui est nettement différente de la durée prévue de 15 min. (Iii) Les essais qui prennent plus de temps que prévu pour terminer peut indiquer un dysfonctionnement dans la fabrication d'un dispositif. Par exemple, mal découpé pores adhésives ou occlus en raison de l'application d'une quantité excessive de réactifs (par exemple, des agents de blocage ou de l' or colloïdal) pourrait interdire à un tampon d'échantillon ou de lavage de pénétrer dans le dispositif (figure 4C).

Dans l'ensemble, notre protocole de fabrication est utile pour fabriquer de nombreux dispositifs microfluidiques sur support papier en parallèle sur une échelle qui est utile pour un laboratoire académique. Nous démontrons la performance du dosage immunologique à base de papier hCG préparé en utilisant cette méthode en effectuant 70 essais en parallèle: 35 répétitions négatives et 35 positives replicates. Pour les besoins de cette démonstration, nous avons préparé un ensemble de couches avec les dessins de notre dispositif, apposé les couches de papier avec de la colle, puis couper les feuilles en rangées de dispositifs. Chaque feuille a été découpée en 7 rangées, qui contenait dix appareils. Ceci a facilité la disposition des couches sur les cadres acryliques petites où les couches sont collées et ensuite traité avec des réactifs nécessaires pour réaliser les essais. Ce procédé de préparation de l'appareil est proposé dans une note dans le protocole. Après le traitement de couches, les dispositifs ont été assemblés en bandes de dix et ensuite laminé. Après les étapes finales de fabrication du dispositif ont été achevées, les dispositifs sont restés dans les bandes de dix et l'échantillon a été ajouté à chaque appareil. Nous avons observé un taux d'échec de 0% pour les appareils fabriqués en utilisant notre protocole. Nous avons utilisé un logiciel de traitement d'image open-source ²⁰ pour quantifier les résultats de ces essais. Bien qu'un certain nombre de méthodes sont disponibles pour analyser les distribut d'intensitéion dans les taches circulaires (par exemple, radial ou distributions linéaires) ²¹ nous mesurons l'intensité moyenne de la voie verte d'une image RVB de l'appareil en utilisant le point de détection entier comme une région d'intérêt. ^{17, 18, 19} Nous normalisons ensuite les mesures de tests positifs et négatifs en soustrayant les données négatives brutes (figure 3B). On a déterminé le coefficient de variation pour chaque ensemble de données de 1% pour des essais effectués en utilisant des échantillons négatifs et 3% pour des essais effectués en utilisant des échantillons positifs.

Figure 1: Schéma du dispositif à base de papier en trois dimensions. Cette illustration montre les régions hydrophobes et hydrophiles qui définissent la voie fluidique au sein du dispositif, ainsi que le pattcouches erned d'adhésif permanent et amovible qui détiennent couches ensemble. Chaque couche est marqué par la fonction qu'il exerce dans le dosage. Le contour rouge, bleu ou vert sur chaque couche indique le matériau utilisé pour fabriquer cette couche spécifique (rouge: papier chromatographique, bleu: membrane en nylon, vert: papier chromatographique d'épaisseur). Les dimensions sont données pour chaque zone dans le dispositif en mm. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 2: Mode opératoire utilisé pour fabriquer des immunoessais de dispositifs microfluidiques à base de papier à trois dimensions. (A) Des images du recto et verso d'une feuille de papier de chromatographie à motifs en utilisant l' impression de cire avant et après chauffage. (B) Une feuille de papier de chromatographiesoutenu par un film d'adhésif à motifs. (C) Les traitements appliqués aux zones hydrophiles d'une bande de membrane en nylon à motif. (D) Assemblée de bandes d'un dispositif multicouche en utilisant une boîte de lumière et des trous d'alignement comme guide. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 3: Interprétation des résultats d'un test immunologique à base de papier. (A) Les trois premières couches du dispositif à base de papier sont épluchés pour exposer la couche de capture et d' interpréter les résultats de l'essai. (B) Représentation graphique de la performance d'un immuno - essai à base de papier pour l' hCG. Les résultats représentés sont les moyennes de 70 répétitions effectuées simultanément où 35 répétitions chacune sont utilisées for échantillons positifs et négatifs de la hCG. Les barres d'erreur représentent l'écart-type de l'ensemble de données. , des images représentatives non corrigées représentant positif (couleur rouge) et (couleur blanche) des résultats négatifs d'un test immunologique de hCG sont présentés ci-dessus leurs données respectives. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 4: Exemples d'erreurs de fabrication. (A) En raison d' un défaut d' alignement du canal latéral au- dessus de la couche de capture, le signal positif est concentré dans une petite zone de la zone de lecture. Une zone circulaire "humide" (en pointillés) peut être observé à la droite de la zone de lecture résultant du contact entre le canal latéral désaligné avec la couche de capture (à gauche). Image d'une lecture positive surla couche de capture d'un dispositif correctement aligné (à droite). (B) de fusion incomplète de la cire sur toute l'épaisseur d'une couche peut conduire à des fuites dans l'appareil. Colorant alimentaire a été ajouté à la solution pour faciliter la visualisation de l'échantillon en couches avec des barrières hydrophobes incomplètes ou complètement formées. (C) adhésif mal coupé peut bloquer le réseau fluidique entre les couches de papier, ce qui arrête l'écoulement d'un échantillon. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 5: Fabrication de dispositifs microfluidiques à base de papier en trois dimensions. Le schéma représente l'assemblage et la stratification de plusieurs couches de papier à motifs dans des dispositifs tridimensionnels terminés. Dans cet exemple, 70 des appareils cun être faites simultanément. Les couches d'adhésif et d'alignement des trous ont été retirés du schéma pour des raisons de simplification. Après le montage, les dispositifs individuels peuvent être retirés et utilisés dans des essais. Les contours rouges, bleues et vertes sur chaque couche indiquent le matériau utilisé pour fabriquer cette couche spécifique (rouge: papier chromatographique, bleu: membrane en nylon, vert: papier chromatographique d'épaisseur). La barre d' échelle = 25 mm à l' exception du dispositif séparé ( à droite), qui a des dimensions de 12 x 28 mm ^2. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

L'identification d'une stratégie de fabrication reproductible est une composante essentielle du développement de l'essai. ²² Nous utilisons une approche séquentielle, couche par couche pour la fabrication de dispositifs microfluidiques à base de papier en trois dimensions. Contrairement à ces méthodes qui appliquent pliage ou origami techniques pour produire des dispositifs multicouches à partir d' une seule feuille de papier ^{23, 24} fabrication additive offre un certain nombre d'avantages: (i) des matériaux multiples peuvent être incorporés dans une architecture de dispositif unique sans modification des procédés de l'impression, l'alignement ou l'assemblage des couches. (Ii) des films adhésifs Patterned peuvent être intégrés dans le processus d'assemblage. Ces films apposent couches adjacentes, et, en fonction de la force de l'adhésif, peut être réversible afin de permettre l'épluchage et l'évaluation des couches internes. En outre, les adhésifs assurent l'intégrité structurelle du dispositif en trois dimensions, ce qui exclut la nécessitépour reliure ²⁵ clips ou boîtiers usinés. ²³ (iii) des feuilles individuelles de papier chromatographique US Letter peut accueillir un ensemble de répétitions, ce qui peut grandement améliorer le débit de la fabrication en laboratoire (Figure 5). Cela est particulièrement utile lors de l'évaluation de nombreuses conditions expérimentales qui nécessitent répétitions techniques. Par cette approche, 70 dispositifs à base de papier en trois dimensions peuvent être préparés simultanément. (iv) les approches multicouches similaires de stratification sont utilisés pour la fabrication de grands volumes de nombreux produits commerciaux dans les soins de santé (par exemple, des pansements de soins et les timbres transdermiques), ce qui réduit par conséquent la barrière de production pour la conversion de ces dispositifs microfluidiques à base de papier à trois dimensions.

En plus de faciliter le pelage et le montage, le choix de l'adhésif est également critique pour la conception du réseau fluidique en trois dimensions. Une puble film adhésif peut servir une barrière supplémentaire entre les couches de papier, ce qui peut permettre le masquage des zones hydrophiles sur des couches adjacentes. Dans la pratique, l'utilisation de couches minces d'adhésif est souhaitable. Si l'adhésif est trop épais (par exemple, beaucoup de rubans double face), l'écart formé entre les couches de papier sera trop grand pour faciliter la transpiration et doit être rempli d'une substance hydrophile (par exemple, la cellulose en poudre) pour retrouver la fonction. ¹² Bien que cette étape supplémentaire ajoute à la complexité de la fabrication et la substance utilisée peut interférer avec certains dosages, ces lacunes deviennent une caractéristique utile pour la production de valves contrôlables, fluidiques push-down. ¹⁵ D' autres formes d'adhésif ont été utilisés dans la fabrication de dispositifs microfluidiques à base de papier à trois dimensions. sprays adhésifs offrent une méthode simple pour fixer les couches les unes aux autres. ²⁶ En utilisant cette méthode, le matériau adhésif est appliqué de manière uniforme sur les deux til zone hydrophobe et hydrophile du papier. Un avantage de cette méthode est que l' équipement supplémentaire (par exemple, un traceur de couteau ou coupe au laser) ne sont pas nécessaires à la conception du motif de la couche adhésive. Cependant, les conditions pour l'application uniforme de la pulvérisation d'adhésif doivent être déterminées expérimentalement pour chaque type de matériau utilisé. La topographie de la matière peut affecter l'interface adhésif-matériel et de plus longues durées de pulvérisation peut être nécessaire pour les surfaces rugueuses. En outre, la pulvérisation d'adhésif sur les zones hydrophiles de la voie fluidique peut entraîner une altération de l'effet de mèche en modifiant la mouillabilité du papier. Alternativement, l'utilisation de pochoirs ²⁷ ou sérigraphie ⁸ peut être utilisé pour adhésif motif directement sur des couches de papier à motifs.

Deux considérations majeures pour le développement de dispositifs microfluidiques à base de papier en trois dimensions sont le choix des matériaux et la conception du fluiréseau dic. (I) Nous sélectionnons les matériaux et combinaisons de matériaux à base de mèche taux, résistance à l'humidité, l'épaisseur et la capacité de liaison de protéine. taux Wicking peut influencer la durée d'un dosage et la quantité de réactifs de temps doivent réagir ou se lier à l'intérieur d'une couche. Différentes qualités de papier sont caractérisés par effet de mèche sur la base des taux, par exemple, le traitement du papier, sa porosité et son épaisseur. Il est possible d'utiliser plusieurs couches de papier pour augmenter la vitesse d'effet de mèche efficace d'un périphérique. ²⁸ Une bonne résistance à l' humidité est souhaitable pour les applications nécessitant un traitement (par exemple, peeling un dosage immunologique) après que le dispositif a été saturé avec un échantillon. Les matériaux qui sont trop épais ou qui ne peuvent pas être passés à travers imprimeur commercial en raison de la fragilité , il faudra une méthode alternative pour produire des canaux à motifs (par exemple, photolithographie). Cependant, en revanche, des matériaux plus épais sont idéales pour les couches blot (ou puits) pour dessiner des fluides à travers ièmedispositif de e. De nombreuses qualités de membranes de nylon sont disponibles dans le commerce, qui peuvent différer par leur aptitude à se lier de façon irréversible des protéines à la zone de capture. Substitutions de matériaux (par exemple, nitrocellulose au lieu d'une membrane en nylon) peuvent également influer sur la capacité, ce qui peut affecter la sensibilité de l'essai de liaison. (ii) L'utilisation de la symétrie dans la conception des réseaux fluidiques assure que les canaux uniques modelées dans des dispositifs en trois dimensions comportent de façon identique (par exemple, remplis en même temps), ce qui est essentiel pour les essais multiplexes. ¹⁹ Symétrie simplifie encore la conception de la couche, aide à l' alignement de la couche lors de l' assemblage des feuilles entières de dispositifs, et peut minimiser les déchets. Les modifications apportées à la conception de l'appareil peuvent influer sur la performance du test. Par exemple, en augmentant la longueur du canal latéral dans la couche d'incubation aura une incidence sur la durée de l'essai, parce que le liquide de mèche à une distance proportionnellement plus longtemps avant d'atteindre l'outlet. ¹⁷ Dans les applications qui reposent sur la liaison d'une biomolécule cible, un temps plus long dosage peut être avantageux car il peut augmenter la fraction des espèces liées, étiquetées avant immobilisation sur la couche de capture.

En conclusion, nous avons présenté une méthode pour fabriquer des dispositifs microfluidiques en trois dimensions sur papier qui soutiennent le développement des immunoessais. Cette méthode, qui utilise un type de fabrication d'additifs pour produire des dispositifs multicouches, facilite la fabrication de dispositifs à l'échelle qui convient pour la recherche en laboratoire. Le protocole décrit dans ce manuscrit est spécifique pour les appareils de dosage immunologique à base de papier; Cependant, nous prévoyons que les procédures relatives à l'ensemble de ces immunoessais impression à la cire, motif adhésif, en alignant les couches, et le laminage-sera facilement extensible à de nombreuses architectures de dispositifs microfluidique à base de papier en trois dimensions. Une compréhension de la méthodologie de fabrication peut conduireau développement de nouveaux tests de point de soins avec un large éventail d'applications dans la santé, l'environnement et l'agriculture.

The authors have nothing to disclose.

This work was supported by Tufts University and by a generous gift from Dr. James Kanagy. This material is based upon work supported by the National Science Foundation Graduate Research Fellowship Program under Grant No. (DGE-1325256) that was awarded to S.C.F. D.J.W. was supported by a U.S. Department of Education GAANN fellowship. We thank Dr. Jeremy Schonhorn (JanaCare), Dr. Jason Rolland (Carbon3D), and Rachel Deraney (Brown University) for helping develop the design of the three-dimensional paper-based microfluidic device and immunoassay.