שיטה להערכת יעילות הדברה נגד פשפש מיטה,

ערכות דברה לעתים קרובות ממוקדות נגד חרקים בוגרים, ולא בשלבים בשלים. כאן, אנו מציגים פרוטוקול להערכת הדברה נגד ביצי פשפש מיטה עם השוואה לשלב פשפש מיטת nymphal הראשון. פרוטוקולים אלה יכולים להיות מותאמים עבור וחרקים אחרים להעריך יעילות דברה בשלבי חיים לא למבוגרים.

הערכות רעילות תקן של חומרי הדברה נגד חרקים מזיקים נערכות בעיקר מחרקים מבוגרים. הערכות מבוססות על מנה-תגובה או עקום ריכוז תגובה, שבו עליות תמותת המינון או הריכוז של חרקים הוא גדלה. ריכוז קטלני רגיל (LC ₅₀₎ מנה קטלנית (LD ₅₀₎ בדיקות שתוצאתן תמותת 50% מהון מניות של אוכלוסיית בדיקה יכולים להיות אתגר עבור הערכה רעילה של חומרי הדברה נגד שלבי חי חרק לא למבוגרים, כגון ביצי instar מוקדם או בשלבי nymphal . עם זאת, מידע זה חיוני להבנת יעילות דברה בכל שלבי חייהם פשפש המיטה, אשר משפיעה המאמצים לבקרה וטיפול. פרוטוקול זה השתמש מבדק טבילת תקן שונה ביצי באג המיטה assay חרקי קשר לטיפול instars הראשון nymphal. מבחנים אלו לייצר עקומת ריכוז תגובת לכמת נוסף LC ₅₀ ערכים עבור הערכות דברה.

באגים מיטה הם מזיקים אורבאניים משמעותיים שיכול לגרום לאובדן דם, גירויים בעור, נדודי שינה, דיכאון, וחרדת מארחי האדם שלהם ^{1, 2, 3, 4, 5, 6.} העלויות של ביטול ושליטת פשפשים הן גבוהות ולעתים קרובות פעמים מצריכות ביקורים מרובים לבית על ידי חברת דברת ^7. ביקורים מרובים בדרך כלל נדרשים בגלל ההתנהגות הנסתרת של פשפשים ואת הקשיים הקשורים להרוג אותם. בפרט, ביצי פשפש מיטה קשות לשלוט בגלל גודלם הקטן ואת ההגנה על העובר על ידי קליפת הביצה.

נכון לעכשיו, מנהג נפוץ עבור חברות הדברה רבות ברחבי ארצות הברית הוא לטפל בית פשפשים באמצעות הדברה כימית. זה ידועכי הביצים קשות לשלוט, כל כך הרבה חברות יישמו מסגרת הזמן של שבועות מחדש טיפולים ^8. זה מאפשר ביצי פשפש מיטה מספיק זמן כדי לבקוע, כך instar הראשונה תצא ו כביכול להיות קל להרוג עם חומרי הדברה. עם זאת, יש מחסור במחקרים להערכת היעילות של חומרי הדברה נוזלי נגד ביצים באג המיטה instars הראשון.

ביצי חרקים תועדו אמור להיות שלב החיים הכי קשה לשלוט ב חרקים מזיקים עירוני, למעט פשפשים, בנוסף מזיקי חקלאות רבים. רוב הקשיים הללו יוחסו קליפת הביצה, בעוד כמה מחקרים דיווחו התנגדות חרקים. ההתנגדות בשלב הביצה תועד Triatoma infestans ^9, Pediculus humanus capitis ^10, Plutella xylostella ^11, Rhyzopertha דומיניקה ^12, Cimex lectularius ^13, וחיפושיות מוצר מרובים מאוחסנים (כלומר Oryzaephilus surinamensis, Tribolium castaneum, Cryptolestes ferrugineus ו Rhyzopertha דומיניקה). ¹⁴ פיתוח העמידות בשלב הביצה בשלבים בשלים, כמו גם סיבוכים הקשורים חדיר דברה דרך קליפת הביצה, מחייב את הצורך bioassays היעיל דברה נגד שלבי החיים האלה.

פרוטוקול זה מספק הליך צעד-אחר-צעד לקביעת היעילות של חומרי הדברה בשלב הביצה instar הראשון של פשפשים משותפים, Cimex lectularius. שני פרוטוקולים אלה הם מבחני ריכוז בתגובה לאפשר כימות של ערכים ₅₀ LC. מבחני ריכוז תגובה משמשים ללימודי טוקסיקולוגית, אולם פרוטוקול זה הותאם לטיפול בקבוצות בקלות ביצים באג מיטת instars הראשון. מבחנים אלה יכולים להיות מותאמיםביצים 'מינים שונים של חרקים ונמצאים בשלבים שונים בחיים לא בשלה.

הערה: פרוטוקול זה כולל שני מבחני הדברה בנפרד בטיפול ביצים באג המיטה instars הראשון. פרוטוקולי שניהם נערכו באמצעות אותו הדברה, לעומת זאת, הפרוטוקולים היו צריך להיות מותאמים על מנת להבטיח חשיפת חרקים כדי לתפעל את הדגימות בקלות.

1. Assay הדברה לטבול ביצה

1. משוך הזדווגו וניזון-היטב פשפשים נקבה בוגר ממושבה ומניח נקבות (5-10) לתוך צלחת פטרי עם נייר סינון. יש לפחות עשרה משכפל כדי להבטיח שלא יהיו ביצים מספיק עבור assay הדברה. בדקו אם הנקבות הטילו ביצים כל יום.
   1. ברגע שהם מטילים ביצים, לקחת הנקבות מתוך צלחת פטרי (6 ס"מ × 5 ס"מ) ולשים אותם לתוך מנות חדשות פטרי עם נייר סינון חדשים מדי יום ולהקליט את התאריך על צלחות פטרי ישנים וחדשים.
   2. אפשר את הביצים גיל 4 עד 5 ימים לפני תחילת assay. רגישות לשינויי דברה במהלך התפתחות עוברית, so חשוב לשלוט לגיל ביצה. עכב את כל שלבי החיים בשעה 12:12 L: photoperiod D, 60% לחות יחסית, ו -27 מעלות צלזיוס.
2. לאחר הביצים הזדקנו כראוי, להסיר את ביצי פשפש המיטה בעדינות ניירות לסנן באמצעות מלקחיים רך-קצה. בעדינות לגרד את תחתית הביצה המצורפת נייר הסינון באמצעות המלקחיים ואז בעדינות לתפוס ללא הפעלת לחץ רב על הביצה להגביל ביצי פשפש מיטה לזרוק.
3. מניח את ביצי פשפש מיטת סיר לקבוצות שלהם בתוך צלחות פטרי פלסטיק. הגבל את החשמל הסטטי משליך ביצים פשפש מיטה ידי שפשוף בתחתית כל צלחת פטרי בצד החיצוני בסדין מרכך כביסה. התייחסו לקבוצות של ביצי פשפש מיטה (5-10 ביצים לכל קבוצה) בבת אחת. קחו קבוצה אחת לשכפל ולהשתמש לפחות חמש (או יותר) משכפל עבור assay זה.
4. הכן דילולים סדרתי של חומרי הדברה כדי לקבל מגוון של 5 ריכוזים שונים (0.21-21 μL / מ"ל ​​עבור imidacloprid (0.1%) / β-Cyfluthrin (0.5%) ו שליטהפתרון עם (מי ברז) ממס בלבד. הפוך 20 מ"ל של כל ריכוז שיהיה מספיק נפח עבור assay טבילה.
5. צינורות צנטריפוגה Cut (50 מיליליטר) ב -35 לקו המ"ל מדיאלית באמצעות כלי סיבובי עם אבזר גלגל חתוך ולאחר מכן לחתוך חור לתוך הכובע של צינור צנטריפוגה (קוטר = 2.54 סנטימטרים) באמצעות אותו הכלי סיבובי עם אלומיניום תחמוצת שחיקה אבן אביזר. השאיר 5 סנטימטרים על קצה הכובע בעת החיתוך, כך הכובע ידפוק מאובטח לתוך הצינור (איור 1).
6. חותכים רשת בסדר לריבועים גדולים מספיק כדי להתאים לתוך כובע (~ 5 ס"מ ^2). הבריגו את רשת בחוזקה, ביטול כל בליטות, לתוך צינורות צנטריפוגה באמצעות כובע צינור צנטריפוגות.
7. מניח קבוצת ביצי פשפש מיטה (לשכפל אחד) בעזרת מברשת צבע על הרשת הפנימית של צינור צנטריפוגות. טובלים את קבוצת פשפשים הפנימי של צינור צנטריפוגות לחתוך לתוך ריכוז הדברה למשך 5 שניות.
8. הסר את צינור צנטריפוגות מתוך הפתרון הדברת דואר. לייבש את הרשת עם הביצים בתוך ידי נחת צינור צנטריפוגות ישירות על גבי רקמה במעבדה.
9. הסר את הקבוצה של ביצים מתוך הצינור צנטריפוגות בעזרת מברשת צבע קטנה, בסדר-זיפים ולהכניס אותם לתוך צלחת נקייה פטרי עם נייר סינון נקי.
10. שיא תמותת ביצה (כישלון לבקוע) למשך 14 יום על מנת להבטיח את כל הביצים הייתה מספיק זמן כדי לבקוע.
11. נכון לתמותה בטיפול השליטה באמצעות הנוסחא של אבוט (תמותת בדיקת% -% שליטת תמותה / 100 - תמותה מלאה x 100).
12. כנס תמותה קליט עם הריכוזים המקביל לתוך תוכנת ניתוח ¹⁵ לחשב LC ₅₀ ערכים.

2. Assay הדברה ראשית Instar

1. הפרד קבוצת פשפשים שניזון היטב (5 זכרים בוגרים ו -5 נשים בוגרות), רצוי נמאס 1 יום לפני, ולהכניס אותם לתוך צלחת פטרי (6 ס"מ × 5 ס"מ) עם נייר סינון מסופקים mating ו- הטלה. אפשר הפשפשים המבוגרים כדי להזדווג ולהטיל ביצים עבור כ 7-9 ימים. האכלה, להשתמש במערכת האכלה מלאכותית כי מפיצת מים חמים צינורות זכוכית סביב דם ^16. לצורך המחקר, להשתמש בדם ארנב defibronated.
2. הסר את המבוגרים מן צלחות פטרי (6 ס"מ × 5 ס"מ) ולאפשר את הביצים בוקעות והופכות instars הראשון בתוך צלחות פטרי. זה לוקח בערך 7-9 ימים לביצי פשפש המיטה לבקוע בטמפרטורת חדר.
3. אסוף את instars הראשון יאכיל אותם באותו הגיל באמצעות מברשת צבע. גיל יכול להיקבע על ידי הסרת instars הראשון יומי והקלטה היום הם בקעו. מניחים אותם מנות חדשות, נקיות פטרי עד assay הדברה. נימפות instar ראשית הם לא מאוד יבושו עמידים, ולכן assay הדברה אמור להסתיים בהקדם האפשרי.
4. עבור assay, להכין דילולים סידוריים של imidacloprid / β-Cyfluthrin כדי לקבל מגוון של 5 ריכוזים שונים וכן solu מלאtion עם ממס בלבד. מוצרים בנוסחאות שכותרתו לבקרה פשפש מיטה בארצות הברית שימשו במחקרים אלה, ולכן הממס היה מים (על פי התווית).
5. פיפטה 150 aliquots μL של כל ריכוז הדברה ומים עבור קבוצת הביקורת על ניירות מסנן הפרט (# 1; 4.2 ס"מ קוטר). הפץ את החרקים על נייר הסינון כולו באמצעות pipetter ידי החלת טיפות מסביב לקצה ומרכז שלם של נייר הסינון.
6. מניח את הניירות לסנן מטופל באופן אישי על גבי לוחות עץ כבדים פרט (7 סנטימטר ^2).
7. קבוצות שחרור instars הראשון (5 עד 10 בכל קבוצה) על ניירות לסנן פרט ועדיין רטובים עם קוטל חרקים ולכסות את instars הראשון עם התחתון הפוך של צלחת פטרי.
8. מניחי משקל על גבי צלחת פטרי למנוע פשפשי instar הראשונים לברוח פני שטח המטופל.
9. תמותת שיא של פשפשי instar הראשונים לאחר חשיפה של 24 שעות לכלריכוזי דברה.
10. נכון לתמותה בטיפול השליטה באמצעות הנוסחא של אבוט (תמותת בדיקת% -% שליטת תמותה / 100 - תמותה מלאה x 100).
11. כנס נרשמה תמותה וריכוזית לתוך תוכנת ניתוח ¹⁵ לחשב LC ₅₀ ערכים.

הביצים היו טבלו 5 ריכוזים שונים של imidacloprid / β-Cyfluthrin (μL / מיליליטר). Instars הראשון הונחו על גבי משטחי מטופלים של חמישה ריכוזים שונים של imidacloprid / β-Cyfluthrin (איור 2).

השתמשנו בשלוש אוכלוסיות שונות של ג lectularius: הרלן, ריצ'מונד, אפי מרכז (טבלה 1). זן הרלן רגיש דברת pyrethroid ונרכש בשנת 2005 מד"ר הרולד הרלן. זני ריצ'מונד Epic מרכז שניהם עמידים deltamethrin. זן ריצ'מונד נאסף מבית קבוצת קשישים בריצ'מונד, וירג'יניה בשנת 2008. זן Epic מרכז נאסף בשנת 2008 בסינסינטי, אוהיו.

LC הגבוהה ₅₀ ערכים מצוינים כי ריכוז גבוה נדרש להרוג 50%ביצי אוכלוסיית בדיקה מתוך ריצ'מונד Epic מרכז זנים. בדומה הביצים, instars הראשון מתוך אוכלוסיות ריצ'מונד Epic המרכז נדרש ריכוזים גבוהים של חומרי הדברה להרוג 50% מאוכלוסיית הבדיקה. ערכי ₅₀ LC ואחריו אותיות שונות שונים באופן משמעותי.

איור 1. תצלום של הצינור צנטריפוגות השונה. חור נחתך בכובע, כך פיסת רשת הריבוע יכול להיות מוברג לתוך הכובע. חתיכות הרשת יכולות להיות מושלכות והוחלפו בעת שימוש חומרי הדברה שונה. ביצי פשפש המיטה ממוקמות ישירות על גבי הרשת באמצעות מברשת צבע ולאחר מכן שקועה לתוך פתרונות ההדברה עבור assay הטבילה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של Figur זהדואר.

איור 2. ייצוג גרף מנה-תגובה. תגובת האחוזים (התמותה) של ביצי פשפש מיטה הרלן להתאמץ כדי imidacloprid / β-Cyfluthrin היא זממה על ציר y ואת ריכוז היומן כי הפשפשים נחשפו מיוצג על ציר ה- x. תמותת ביצה גדלה במינון גבוה יותר ותמותה הגיעה ל -100% בריכוז הגבוה ביותר נבדק.

A critical step in this assay is to ensure that no eggs that are removed from a surface are damaged prior to the assay. Many insects cement their eggs to a substrate, therefore, a preliminary test may be needed to ensure that removal does not cause mortality. This test can be conducted with several replications of a treated group (bed bugs removed from filter paper) compared to a control group (bed bugs not removed). Similar low rates of mortality (or no mortality) between the treated and control group will ensure that removal did not cause egg mortality. Thus, any mortality recorded for the insecticide assay should be due to the insecticide treatment. The same preliminary experiment can be conducted using first instars to ensure that methods for collecting do not kill the experimental insects. All experiments conducted later should include control replications that do not receive insecticide but are treated with the solvent (for these experiments, tap water was the solvent).

Preliminary experiments should be conducted with the recommended label rate for formulated products and then serially diluted to determine the correct concentrations to produce a concentration response curve of mortality ranging from 20-80%. Previous insecticide studies on the same insects or compounds may also be insightful when trying to determine the appropriate concentration. Concentrations will need to be modified dependent upon the insect, life stage, and compound used. New solutions should be made each time an experiment is conducted.

The exposure of first instars to wet residues was necessary to get high mortality. Although this life stage is considered more susceptible to insecticides than older nymphs and adults, high mortality was still difficult to obtain with formulated products. Submerging the first instars into insecticides similar to the eggs was not plausible because of the resultant high mortality, thus this was a limitation to the study. The alternative first instar bioassay was manipulated to maintain first instars on surfaces to force constant contact with the treatment.

Dry residue assays and bottle assays commonly used for insecticide efficacy and resistance studies do not provide methodology for testing against multiple insect life stages¹⁷. These assays are often used to determine resistance in insects, and not to test insecticide efficacy. There are limited studies on egg dipping toxicological studies and none that have reported a standard methodology previously that can be repeated for multiple insect species.

This study provides a protocol for testing insecticide efficacy against bed bug eggs and first instars. Efficacy should be evaluated in different life stages, if not all, for a more holistic view of the efficacy of a treatment program. This consideration is important because an insect's susceptibility to insecticides changes with age and development ¹⁸. While age is an important factor in insecticide susceptibility, a factor in egg insecticide susceptibility is the eggshell. The eggshell provides a barrier to insecticides and makes insect eggs particularly difficult to control¹⁹.

These toxicological assays provide researchers a way to evaluate insecticide toxicity against various life stages of insects. Insecticidal solutions are prepared to evaluate mortality and to determine LC₅₀ concentrations. While this protocol was used for formulated products, the steps can be manipulated for technical grade compounds and for a variety of insects and life stages to evaluate toxicity.

החוקרים אין לי מה לחשוף.

אנו מודים מולי Stedfast לסיוע ניסוח דילול הדברה. אנו מודים גם טרוי אנדרסון להדרכה ניתוח probit ואת זכריה אדלמן לקבלת סיוע בתכנון הניסוי. מחקר זה מומן בחלקו על ידי פרס קרן האנטומולוגי ועל ידי קרנות מלגת ממשק הדברת וירג'יניה.