Un método para evaluar la eficacia insecticida contra las chinches,

evaluaciones insecticidas a menudo se dirigen a los insectos adultos, en lugar de estadios inmaduros. A continuación, se presenta un protocolo para la evaluación de insecticidas contra los huevos de insectos de la cama con una comparación a la primera etapa de ninfa chinches. Estos protocolos podrían ajustarse para otros insectos para evaluar la eficacia insecticida en etapas de la vida no adultos.

Las evaluaciones de toxicidad estándar de insecticidas contra plagas de insectos se llevan a cabo principalmente en insectos adultos. Las evaluaciones se basan en una relación dosis-respuesta o curva de concentración-respuesta, cuando se incrementa la mortalidad aumenta a medida que la dosis o concentración de un insecticida. Concentración estándar letal _(LC50) y la dosis letal _(DL50) pruebas que resultan en un 50% la mortalidad de una población de prueba puede ser un reto para la evaluación de la toxicidad de los insecticidas contra los estadios de vida de insectos no adultos, tales como los huevos y el estadio temprano o estadios ninfales . Sin embargo, esta información es esencial para la comprensión de la eficacia insecticida en todas las etapas de la vida de chinches, que afecta a los esfuerzos de control y tratamiento. Este protocolo utiliza un bioensayo de inmersión estándar modificado para los huevos de chinches y un ensayo de insecticida de contacto para el tratamiento de primeros estadios ninfales. Estos ensayos producen una curva de concentración-respuesta para cuantificar más LC ₅₀ valores para las evaluaciones insecticidas.

Las chinches son una plaga urbana significativo que puede causar la pérdida de sangre, irritaciones de la piel, el insomnio, la depresión y la ansiedad en sus huéspedes humanos ^{1, 2, 3, 4, 5, 6.} Los gastos de eliminación y el control de insectos de la cama son altos y muchas veces requieren varias visitas a un hogar por una empresa de control de plagas ^7. Múltiples visitas suelen ser necesarios debido al comportamiento críptico de las chinches y las dificultades asociadas con matarlos. En particular, los huevos de chinches son difíciles de controlar debido a su pequeño tamaño y la protección del embrión de la cáscara del huevo.

En la actualidad, una práctica común para muchas empresas de control de plagas en los Estados Unidos es tratar a un hogar para las chinches utilizando un insecticida químico. Es bién sabidoque los huevos son difíciles de controlar, por lo que muchas empresas han implementado un plazo de dos semanas para re-tratamientos ^8. Esto permite que los huevos de chinches tiempo suficiente para salir del cascarón, de modo que el primer instar emergerá y supuestamente más fácil de matar con insecticidas. Sin embargo, hay una escasez de estudios que evalúan la eficacia de insecticidas líquidos contra la cama huevos de errores y primeros estadios.

huevos de insectos se han documentado que la etapa de la vida más difícil de controlar en las plagas de insectos urbanas, aparte de insectos de la cama, además de muchas plagas agrícolas. La mayor parte de estas dificultades se han atribuido a la cáscara del huevo, mientras que algunos estudios han reportado resistencia a los insecticidas. Resistencia en estado de huevo se ha documentado en Triatoma infestans ^9, Pediculus humanus capitis ^10, Plutella xylostella ^{11, 12} RHYZOPERTHA dominica, Cimex lectularius ^13, y varios escarabajos de productos almacenados (es decir, Oryzaephilus surinamensis, Tribolium castaneum, Cryptolestes ferrugineus y dominica RHYZOPERTHA). ¹⁴ El desarrollo de resistencia en la fase de huevo y etapas inmaduras, así como las complicaciones asociadas con la penetración de insecticidas a través de la cáscara de huevo, requiere la necesidad de bioensayos de eficacia insecticida contra estas etapas de la vida.

Este protocolo proporciona un procedimiento paso a paso para determinar la eficacia de los insecticidas en la etapa de huevo y el primer estadio de las chinches comunes, Cimex lectularius. Ambos de estos protocolos son ensayos de concentración-respuesta para permitir la cuantificación de los valores de _LC50. Los ensayos de concentración-respuesta se utilizan comúnmente para estudios toxicológicos, sin embargo, este protocolo ha sido adaptado para tratar fácilmente los grupos de cama huevos de errores y primeros estadios. Estos ensayos pueden adaptarsepara los huevos de varias especies de insectos 'y etapas de la vida inmaduros.

NOTA: Este protocolo incluye dos ensayos de insecticidas para tratar por separado los huevos de chinches y los primeros estadíos. Ambos protocolos se realizaron utilizando los mismos insecticidas, sin embargo, los protocolos tuvieron que ser adaptado para asegurar una exposición insecticida y manipular fácilmente los especímenes.

1. Ensayo de huevo inmersión Insecticida

1. Tire montadas, bien alimentados adultos chinches hembras de una colonia y colocar las hembras (5-10) en una placa de Petri con papel de filtro. Tener al menos diez repeticiones para asegurar que habrá suficientes huevos para el ensayo de insecticida. Compruebe si las hembras han puesto huevos todos los días.
   1. Una vez que ponen huevos, tome las hembras de la placa de Petri (6 cm x 5 cm) y ponerlas en nuevas placas de Petri con un nuevo filtro de papel diario y registrar la fecha en las viejas y nuevas placas de Petri.
   2. Permitir que los huevos a la edad de 4 a 5 días antes de comenzar el ensayo. La susceptibilidad a los insecticidas cambios durante el desarrollo embrionario, so es importante para el control de la edad del huevo. Mantenga todas las etapas de la vida a las 12:12 L: D fotoperíodo, 60% de humedad relativa y 27 ° C.
2. Una vez que los huevos han envejecido apropiadamente, eliminar los huevos de chinches suavemente de papeles de filtro con unas pinzas de punta blanda. raspar suavemente la parte inferior del huevo unida al papel de filtro con la pinza y luego agarrar suavemente sin aplicar mucha presión sobre el huevo para limitar lanzan cama huevos de insectos.
3. Coloque los huevos de chinches retirados en sus respectivos grupos en el interior de placas Petri de plástico. Limitar la electricidad estática de arrojar huevos de chinches por el roce de la parte inferior de cada placa de Petri en el exterior con una hoja de suavizante de telas. Tratar a los grupos de huevos de chinches (5-10 huevos por grupo) a la vez. Considere un grupo un duplicado y el uso de al menos cinco (o más) se replica para este ensayo.
4. Preparar diluciones seriadas de insecticidas para obtener una gama de 5 concentraciones diferentes (0,21 a 21 l / ml de imidacloprid (0,1%) / β-ciflutrina (0,5%) y un controlsolución con (agua del grifo) disolvente solamente. Hacer 20 ml de cada concentración para tener suficiente volumen para el ensayo de inmersión.
5. tubos cortados de centrífuga (50 ml) a la línea 35 ml medial usando una herramienta rotativa con un accesorio de la rueda de corte y luego se corta un agujero en la tapa del tubo de centrífuga (diámetro = 2,54 cm) usando el mismo herramienta rotativa con un aluminio óxido de molienda accesorio piedra. Deja 5 cm en el borde de la tapa durante el corte, por lo que la tapa será firmemente el tornillo en el tubo (Figura 1).
6. Cortar en cuadrados de malla fina lo suficientemente grandes como para caber en la tapa ⁽² ~ 5 cm). Tornillo de la malla firmemente, eliminando las irregularidades, en los tubos de centrifugación utilizando el tapón del tubo de centrífuga.
7. Colocar un grupo de huevos de la cama de errores (un replicado) utilizando un pincel sobre la malla en el interior del tubo de centrífuga. Sumergir el grupo de insectos de la cama en el interior del tubo de centrífuga de corte en una concentración de insecticida durante 5 segundos.
8. Retire el tubo de centrífuga de THsolución de insecticida e. Secar la malla con los huevos en el interior, colocando el tubo de centrífuga directamente sobre un tejido de laboratorio.
9. Retire el grupo de huevos fuera del tubo de centrífuga utilizando un pequeño, fino pincel de cerdas y colocarlos en una placa de Petri limpia con un papel de filtro limpio.
10. Registro de mortalidad de los huevos (falta de eclosionar) durante 14 días para asegurar que todos los huevos han tenido tiempo suficiente para salir del cascarón.
11. Correcta para la mortalidad en el tratamiento de control utilizando la fórmula de Abbott (mortalidad prueba% - Control% de mortalidad / 100 - mortalidad del control x 100).
12. Inserte mortalidad registrada con las concentraciones correspondientes en el software de análisis ¹⁵ para calcular valores de _LC50.

2. Ensayo de primer instar Insecticida

1. Separar un grupo de insectos de la cama bien alimentados (5 machos y 5 hembras adultas adultos), preferentemente alimentado 1 día antes, y colocarlos en una placa de Petri (6 cm x 5 cm) con papel de filtro prevista mating y la puesta de huevos. Permitir que los chinches de cama adulto para aparearse y poner huevos durante aproximadamente 7-9 días. Para la alimentación, utilice un sistema de alimentación artificial que hace circular el agua caliente en tubos de vidrio que rodean la sangre ^16. Para este estudio, el uso de sangre de conejo defibronated.
2. Retire los adultos a partir de los platos de Petri (6 cm x 5 cm) y permita que los huevos eclosionan en la primera estadios en las placas de Petri. Se tarda aproximadamente 7-9 días para los huevos de chinches que eclosionan a temperatura ambiente.
3. Recoge los primeros estadios sin alimentar de la misma edad utilizando un pincel. La edad puede ser determinada mediante la eliminación de los primeros estadios diaria y registro de la día que eclosionaron. Colocarlos en platos nuevos, limpios de Petri hasta el ensayo insecticida. ninfas de la primera fase larval no son muy resistentes desecante, por lo que el ensayo de insecticidas debe ser completado tan pronto como sea posible.
4. Para el ensayo, preparar diluciones en serie de imidacloprid / β-ciflutrina para obtener una gama de 5 concentraciones diferentes y unos Solu de controlción con único disolvente. Los productos formulados etiquetados para el control de chinches de cama en los Estados Unidos fueron utilizados para estos estudios, por lo tanto, el disolvente era agua (según la etiqueta).
5. Pipeta alícuotas de 150 l de cada concentración de insecticida y el agua para el grupo de control sobre papeles de filtro individuales (# 1; 4,2 cm de diámetro). Distribuir el insecticida en toda el papel de filtro usando la pipeta mediante la aplicación de las gotitas de alrededor de todo el borde y el centro del papel de filtro.
6. Coloque los papeles de filtro tratados de forma individual en la parte superior de los paneles de aglomerado individuales (7 cm ^2).
7. grupos de liberación de primer estadio (5 a 10 por grupo) en los papeles de filtro individuales mientras aún esté húmedo con insecticida y cubrir el primer estado con un fondo invertido de una placa de Petri.
8. Coloque un peso en la parte superior de la placa de Petri para evitar que los primeros chinches instar se escape de la superficie tratada.
9. registrar datos de mortalidad de los primeros chinches estadio después de 24 h de exposición a todosconcentraciones de insecticidas.
10. Correcta para la mortalidad en el tratamiento de control utilizando la fórmula de Abbott (mortalidad prueba% - Control% de mortalidad / 100 - mortalidad del control x 100).
11. Insertar la mortalidad y las concentraciones de grabado en el software de análisis ¹⁵ para calcular valores de _LC50.

Los huevos se sumergieron en 5 concentraciones diferentes de imidacloprid / β-ciflutrina (mu l / ml). Los primeros estadios se colocaron sobre las superficies tratadas de cinco concentraciones diferentes de imidacloprid / β-ciflutrina (Figura 2).

Se han utilizado tres poblaciones diferentes de C. lectularius: Harlan, Richmond, y Epic Center (Tabla 1). La cepa Harlan es susceptible a los insecticidas piretroides y fue adquirida en 2005 por el Dr. Harold Harlan. Las cepas de Richmond y de Epic Center, poseen una resistencia a deltametrina. La cepa de Richmond se recogió de un hogar de grupo de ancianos en Richmond, VA en 2008. cepa The Epic Center se recogió en 2008 en Cincinnati, OH.

Superior LC ₅₀ valores indicaron que se requería una mayor concentración para matar el 50% de lahuevos población de prueba a partir de cepas de Richmond y de Epic Center. Al igual que en los huevos, los primeros estadios de las poblaciones Richmond y Epic Center requieren concentraciones más altas de insecticida para matar el 50% de la población de prueba. Los valores de _LC50 seguidos por letras diferentes son significativamente diferentes.

Figura 1. Fotografía del tubo de centrífuga modificada. Un agujero se ha reducido a la tapa, de manera que un trozo cuadrado de malla puede ser atornillado en el casquillo. Las piezas de malla pueden ser desechados y reemplazados cuando se utilizan diferentes insecticidas. Los huevos de chinches de cama se colocan directamente sobre la malla con un cepillo de pintura y luego se sumergieron en las soluciones de insecticidas para el ensayo de inmersión. Haga clic aquí para ver una versión más grande de este figurmi.

Figura 2. Representación de un gráfico de dosis-respuesta. La respuesta ciento (mortalidad) de la cepa Harlan huevos de chinches de imidacloprid / β-ciflutrina se representa en el eje de ordenadas y la concentración de registro que las chinches se expusieron a se representa en el eje x. mortalidad de los huevos aumentó a medida que aumentó la dosis y la mortalidad alcanzó el 100% a la concentración más alta probada.

A critical step in this assay is to ensure that no eggs that are removed from a surface are damaged prior to the assay. Many insects cement their eggs to a substrate, therefore, a preliminary test may be needed to ensure that removal does not cause mortality. This test can be conducted with several replications of a treated group (bed bugs removed from filter paper) compared to a control group (bed bugs not removed). Similar low rates of mortality (or no mortality) between the treated and control group will ensure that removal did not cause egg mortality. Thus, any mortality recorded for the insecticide assay should be due to the insecticide treatment. The same preliminary experiment can be conducted using first instars to ensure that methods for collecting do not kill the experimental insects. All experiments conducted later should include control replications that do not receive insecticide but are treated with the solvent (for these experiments, tap water was the solvent).

Preliminary experiments should be conducted with the recommended label rate for formulated products and then serially diluted to determine the correct concentrations to produce a concentration response curve of mortality ranging from 20-80%. Previous insecticide studies on the same insects or compounds may also be insightful when trying to determine the appropriate concentration. Concentrations will need to be modified dependent upon the insect, life stage, and compound used. New solutions should be made each time an experiment is conducted.

The exposure of first instars to wet residues was necessary to get high mortality. Although this life stage is considered more susceptible to insecticides than older nymphs and adults, high mortality was still difficult to obtain with formulated products. Submerging the first instars into insecticides similar to the eggs was not plausible because of the resultant high mortality, thus this was a limitation to the study. The alternative first instar bioassay was manipulated to maintain first instars on surfaces to force constant contact with the treatment.

Dry residue assays and bottle assays commonly used for insecticide efficacy and resistance studies do not provide methodology for testing against multiple insect life stages¹⁷. These assays are often used to determine resistance in insects, and not to test insecticide efficacy. There are limited studies on egg dipping toxicological studies and none that have reported a standard methodology previously that can be repeated for multiple insect species.

This study provides a protocol for testing insecticide efficacy against bed bug eggs and first instars. Efficacy should be evaluated in different life stages, if not all, for a more holistic view of the efficacy of a treatment program. This consideration is important because an insect's susceptibility to insecticides changes with age and development ¹⁸. While age is an important factor in insecticide susceptibility, a factor in egg insecticide susceptibility is the eggshell. The eggshell provides a barrier to insecticides and makes insect eggs particularly difficult to control¹⁹.

These toxicological assays provide researchers a way to evaluate insecticide toxicity against various life stages of insects. Insecticidal solutions are prepared to evaluate mortality and to determine LC₅₀ concentrations. While this protocol was used for formulated products, the steps can be manipulated for technical grade compounds and for a variety of insects and life stages to evaluate toxicity.

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecemos a Molly firme para la asistencia formulación de dilución y pesticidas. Agradecemos también a Troy Anderson por análisis probit orientación y Zachary Adelman para obtener ayuda con el diseño experimental. Esta investigación fue apoyada en parte por un premio de la Fundación Entomológica y por fondos de la beca Virginia manejo de plagas.