Ein Verfahren zur Bewertung Insecticide Wirksamkeit gegen Bettwanzen,

Insecticide Evaluierungen werden häufig gegen erwachsenen Insekten gezielt, anstatt unreifen Stadien. Hier präsentieren wir ein Protokoll für Insektizide gegen Bettwanzen Eier mit einem Vergleich zum ersten nymphal Bett Bug Bühne zu bewerten. Diese Protokolle könnten für andere Insekten angepasst werden, um Insektizid Wirksamkeit bei Non-Adult Lebensphasen zu bewerten.

Standard-Toxizität Auswertungen von Insektiziden gegen Insektenschädlinge sind auf erwachsene Insekten in erster Linie durchgeführt. Auswertungen basieren auf einer Dosis-Wirkungs-oder Konzentrations-Wirkungs-Kurve, wo die Mortalität erhöht, wenn die Dosis oder Konzentration eines Insektizids erhöht wird. Standard - letale Konzentration (LC ₅₀₎ und letale Dosis (LD ₅₀₎ Tests , die in 50% Sterblichkeit einer Testpopulation führen kann zur Auswertung Toxizität von Insektiziden gegen nicht ausgewachsene Tier Lebensphasen eine Herausforderung sein, wie Eier und frühen Larvenstadium oder Nymphenstadien . Allerdings ist diese Information für das Verständnis Insektizid Wirksamkeit in allen Bettwanze Lebensphasen, die die Bemühungen um Kontrolle und Behandlung betrifft. Dieses Protokoll verwendet ein Standard-Bioassay Tauchen für Bettwanzen Eier modifiziert und einen Kontakt insektizide Assay für nymphal erste instars Behandlung. Diese Assays erzeugen eine Konzentrations-Wirkungs - Kurve zu weiteren LC ₅₀ -Werte für Insektizid Auswertungen zu quantifizieren.

Bettwanzen sind eine bedeutende städtische Schädlingsbekämpfung , die Blutverlust verursachen können, Hautreizungen, Schlaflosigkeit, Depression und Angst in ihren menschlichen Wirten ^{1, 2, 3, 4, 5, 6.} Die Kosten für die Beseitigung und Kontrolle Bettwanzen sind hoch und oft erfordern mehrere Besuche in einem Haus von einem Schädlingsbekämpfung Unternehmen ^7. Mehrere Besuche sind in der Regel wegen des kryptischen Verhalten von Bettwanzen erforderlich und die Schwierigkeiten, die mit ihnen zu töten. Insbesondere sind Bettwanzen Eier schwierig wegen ihrer geringen Größe zu kontrollieren und den Schutz des Embryos durch die Eischale.

Derzeit ist eine gängige Praxis für viele Schädlingsbekämpfung Unternehmen in den Vereinigten Staaten ein Haus für Bettwanzen zu behandeln, ein chemisches Insektizid verwendet wird. Es ist allgemein Bekanntdass die Eier schwer zu kontrollieren sind, haben so viele Unternehmen ⁸ einen zweiwöchigen Zeitrahmen für die Wieder Behandlungen umgesetzt. Auf diese Weise können Bettwanzen Eier genug Zeit zu schlüpfen, so dass das erste Larvenstadium entstehen und angeblich leichter sein, mit Insektiziden zu töten. Allerdings gibt es einen Mangel an Studien, die die Wirksamkeit von flüssigen Insektiziden gegen Bettwanzen Eier und erste instars Auswertung.

Insekteneier wurden die schwierigsten Lebensphase zu steuern, in städtischen Schadinsekten, andere als Bettwanzen, zusätzlich zu den vielen landwirtschaftlichen Schädlingen zu dokumentieren. Die meisten dieser Schwierigkeiten wurden in der Eierschale zurückgeführt, während einige Studien Insektizidresistenz berichteten. Der Widerstand im Ei - Stadium hat in Triatoma infestans ^9, Pediculus humanus capitis ¹⁰ dokumentiert, Plutella xylostella ^11, Rhyzopertha dominica ^12, Cimex lectularius ¹³ und mehrere gespeicherte Produkt Käfer (dh Getreideplattkäfer, Tribolium castaneum, Cryptolestes ferrugineus und Rhyzopertha dominica). ¹⁴ Die Entwicklung des Widerstandes im Ei - Stadium und unreifen Stadien sowie mit Insektizid Penetration durch die Eischale verbundenen Komplikationen, erfordert die Notwendigkeit Insektizid Wirksamkeit Biotests gegen diese Lebensphasen.

Dieses Protokoll ein Verfahren Schritt- für -Schritt stellt die Wirksamkeit von Insektiziden im Ei und erste Larvenstadium Stadium der gemeinsamen Bettwanzen zur Bestimmung, Cimex lectularius. Beide Protokolle sind Konzentrations-Wirkungs - Assays Quantifizierung der LC ₅₀ -Werte zu ermöglichen. Konzentrations-Wirkungs-Assays sind für toxikologische Studien häufig verwendet, aber dieses Protokoll für die einfache Behandlung von Gruppen von Bettwanzen Eier und erste instars angepasst wurde. Diese Assays können angepasst werden,für verschiedene Insektenarten Eier und unreifen Lebensphasen.

HINWEIS: Dieses Protokoll enthält zwei Insektizid-Assays für separat Bettwanze Eier und erste instars behandeln. Beide Protokolle wurden die gleichen Insektiziden durchgeführt unter Verwendung von, jedoch mussten die Protokolle angepasst werden Insektizid Exposition und zu leicht, die Proben zu manipulieren.

1. Egg Dipping Insecticide Assay

1. Ziehen gepaart, gut gefütterten erwachsenen weiblichen Bettwanzen aus einer Kolonie, und legen die Weibchen (5-10) in eine Petrischale mit Filterpapier. Mindestens zehn Replikaten, um sicherzustellen, dass es genug Eier für das Insektizid-Test sein. Überprüfen Sie, ob die Weibchen jeden Tag Eier gelegt haben.
   1. Sobald sie Eier legen, nehmen die Weibchen aus der Petrischale (6 cm x 5 cm) und sie in neue Petrischalen mit einem neuen Filterpapier täglich und das Datum, an dem alten und neuen Petrischalen aufnehmen.
   2. Lassen Sie die Eier im Alter von 4 bis 5 Tage vor Beginn des Tests. Die Empfindlichkeit gegenüber Insektiziden Veränderungen während der embryonalen Entwicklung, so ist es wichtig, für die Eier Alter zu steuern. Halten Sie alle Lebensphasen um 12:12 L: D-Photoperiode, 60% relativer Luftfeuchtigkeit und 27 ° C.
2. Sobald die Eier entsprechend gealtert sind, entfernen Sie die Bettwanze Eier vorsichtig von Filterpapiere Soft-Spitze Pinzette. Vorsichtig kratzen den Boden des Ei auf das Filterpapier angebracht mit der Pinzette und dann ohne Anwendung viel Druck auf das Ei zu werfen Bettwanzen Eier zu begrenzen sanft greifen.
3. Die ausgebaute Bettwanzen Eier in ihren jeweiligen Gruppen innerhalb von Petrischalen aus Kunststoff. Begrenzen Sie die statische Elektrizität von Bettwanzen Eier schleudert durch den Boden jeder Petrischale reiben auf der Außenseite mit einem Weichspüler Blatt. Treat Gruppen von Bettwanzen Eier (5-10 Eier pro Gruppe) alle auf einmal. Betrachten wir eine Gruppe, die eine Replikation und verwenden mindestens fünf (oder mehr) repliziert für diesen Test.
4. Bereiten Reihenverdünnungen von Insektiziden eine Reihe von 5 verschiedenen Konzentrationen zu erhalten (0,21 bis 21 & mgr; l / ml für Imidacloprid (0,1%) / β-Cyfluthrin (0,5%) und eine SteuerLösung mit Lösungsmittel (Leitungswasser) nur. Machen Sie 20 ml jeder Konzentration genügend Volumen für den Tauch Test zu haben.
5. Cut-Zentrifugenröhrchen (50 ml) in der 35 ml Linie median mit einem Drehwerkzeug mit einer Trennscheibe Zubehör und dann ein Loch in den Deckel des Zentrifugenrohr (Durchmesser = 2,54 cm) mit dem gleichen Drehwerkzeug mit einem Aluminium geschnitten Oxid Schleifstein Zubehör. Lassen Sie 5 cm am Rand der Kappe beim Schneiden, so dass die Kappe fest in dem Rohr (Abbildung 1) Schraube wird.
6. Schneiden Sie feinmaschigen in Quadrate groß genug , um in die Kappe zu passen (~ 5 cm ^2). Schrauben Sie das Gitter fest, alle Unebenheiten zu beseitigen, in die Zentrifugenröhrchen Zentrifugenröhrchen Kappe mit.
7. Legen Sie eine Gruppe von Bettwanzen Eier (eine Wiederholung) einen Pinsel auf das Netz innerhalb des Zentrifugenröhrchen verwenden. Tauchen Sie die Gruppe von Bettwanzen im Inneren des geschnittenen Zentrifugenröhrchen in eine Insektizidkonzentration für 5 Sekunden.
8. Entfernen Sie die Zentrifugenröhrchen aus the Insektizidlösung. Trocknen Sie das Gitter mit den Eiern im Inneren durch das Zentrifugenröhrchen direkt auf ein Labor Gewebe platzieren.
9. Entfernen Sie die Gruppe von Eiern aus dem Zentrifugenröhrchen einen kleinen, fein Borste Pinsel und legen Sie sie in eine saubere Petrischale mit einem sauberen Filterpapier.
10. Nehmen Sie Ei-Sterblichkeit (Ausfall zu schlüpfen) für 14 Tage alle Eier, um sicherzustellen, haben genügend Zeit zu schlüpfen musste.
11. Richtige für die Mortalität in der Kontrollbehandlung Abbott-Formel (% Test Mortalität -% Kontrollmortalität / 100 - Kontrollmortalität x 100).
12. Legen Sie aufgezeichnet Mortalität im Zusammenhang mit den entsprechenden Konzentrationen in die Analysesoftware ¹⁵ LC ₅₀ Werte zu berechnen.

2. Erste Instar Insecticide Assay

1. Trennen Sie eine Gruppe von gut genährten Bettwanzen (5 erwachsene Männer und 5 erwachsene Frauen), vorzugsweise 1 Tag vor gefüttert, und legen Sie sie in eine Petrischale (6 cm x 5 cm) mit Filterpapier für matin vorgeseheng und Eiablage. Lassen Sie die erwachsenen Bettwanzen Eier zu paaren und legen für etwa 7-9 Tage. Zur Fütterung verwenden , um eine künstliche Ernährung System , das Warmwasser in Glasröhrchen umgebenden Blut ¹⁶ zirkuliert. Für diese Studie verwenden defibronated Kaninchenblut.
2. Entfernen Sie die Erwachsenen von den Petrischalen (6 cm x 5 cm) und lassen Sie die Eier in die erste instars in den Petrischalen zu schlüpfen. Es dauert ungefähr 7-9 Tage für Eier Bettwanze bei Raumtemperatur zu schlüpfen.
3. Sammeln Sie die unfed ersten instars des gleichen Alters mit einem Pinsel. Das Alter kann durch Entfernen der ersten instars täglich bestimmt werden und die Aufzeichnung der Tag sie ausgebrütet. Legen Sie sie in neue, saubere Petrischalen bis zum Insektizid-Test. Erste instar Nymphen sind nicht sehr Trocknungs resistent, so sollte das Insektizid-Test so schnell wie möglich abgeschlossen werden.
4. Für den Test vorbereiten Reihenverdünnungen von Imidacloprid / β-Cyfluthrin eine Reihe von 5 verschiedenen Konzentrationen und eine Steuer solu zu bekommention nur mit Lösungsmittel. Formulierte Produkte für Bettwanze Kontrolle in den Vereinigten Staaten markiert wurden für diese Untersuchungen verwendet daher das Lösungsmittel Wasser (nach dem Etikett).
5. Pipette 150 ul Aliquots jeder Insektizidkonzentration und Wasser für die Kontrollgruppe auf einzelnen Filterpapiere (# 1; 4,2 cm Durchmesser). das Insektizid über das gesamte Filterpapier verteilen sich um den gesamten Rand und in der Mitte des Filterpapiers mit der Pipettiervorrichtung Tröpfchen durch Anwendung.
6. Legen Sie die behandelten Filterpapiere individuell auf einzelne Hartfaserplatten (7 cm ^2).
7. Veröffentlichung Gruppen erster instars (5 bis 10 pro Gruppe) auf die einzelnen Filterpapiere, während noch nass mit Insektizid und decken die erste instars mit einem umgekehrten Boden einer Petrischale.
8. Legen Sie ein Gewicht auf der Petrischale, die ersten instar Bettwanzen zu verhindern, dass die behandelte Oberfläche zu entkommen.
9. Die Mortalität der ersten instar Bettwanzen nach 24 h Exposition gegenüber allenInsektizid-Konzentrationen.
10. Richtige für die Mortalität in der Kontrollbehandlung Abbott-Formel (% Test Mortalität -% Kontrollmortalität / 100 - Kontrollmortalität x 100).
11. Legen Sie aufgezeichnet Mortalität und Konzentrationen in die Analysesoftware ¹⁵ LC ₅₀ Werte zu berechnen.

Die Eier wurden eingetaucht in 5 verschiedenen Konzentrationen von Imidacloprid / β-Cyfluthrin (ul / ml). Die ersten instars wurden auf behandelten Oberflächen von fünf verschiedenen Konzentrationen von Imidacloprid / β-Cyfluthrin (Figur 2) plaziert.

Wir haben drei verschiedene Populationen von C. lectularius: Harlan, Richmond, und epische Center (Tabelle 1). Die Harlan Stamm ist anfällig für Pyrethroid-Insektizide und wurde im Jahr 2005 von Dr. Harold Harlan übernommen. Die Richmond und epische-Center-Stämme sind sowohl resistent gegen Deltamethrin. Der Richmond-Stamm wurde von einer älteren Gruppe zu Hause in Richmond, VA im Jahr 2008. The Epic-Center-Stamm gesammelt wurde 2008 in Cincinnati gesammelt, OH.

Höhere LC ₅₀ Werte zeigten , dass eine höhere Konzentration erforderlich war , 50% der zu tötenTestpopulation Eier von Richmond und Epische-Center-Stämme. Ähnlich wie bei den Eiern, benötigt die ersten instars von den Richmond und epische Zentrum Populationen höhere Konzentrationen des Insektizids 50% der Testpopulation zu töten. Die LC ₅₀ Werte , gefolgt von verschiedenen Buchstaben sind signifikant verschieden.

Abbildung 1. Foto des modifizierten Zentrifugenröhrchen. Ein Loch wurde in der Kappe ausgeschnitten, so dass ein quadratisches Stück Netz kann in die Kappe eingeschraubt werden. Die Maschenstücke können entfernt und ersetzt werden, wenn verschiedene Insektizide verwenden. Die Bettwanze Eier werden direkt auf das Netz mit einem Pinsel und dann unter Wasser in die Insektizid-Lösungen für den Tauchtest gegeben. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieses figur anzuzeigene.

Abbildung 2. Darstellung einer Dosis-Wirkungs-Diagramm. Die prozentuale Reaktion (Mortalität) von Harlan Stamm Bettwanze Eier zu Imidacloprid / β-Cyfluthrin ist auf der y-Achse und die Log-Konzentration aufgetragen, dass die Bettwanzen ausgesetzt waren auf der x-Achse dargestellt wird. Ei Mortalität erhöht, wie die Dosis erhöht und Mortalität erreichte 100% bei der höchsten getesteten Konzentration.

A critical step in this assay is to ensure that no eggs that are removed from a surface are damaged prior to the assay. Many insects cement their eggs to a substrate, therefore, a preliminary test may be needed to ensure that removal does not cause mortality. This test can be conducted with several replications of a treated group (bed bugs removed from filter paper) compared to a control group (bed bugs not removed). Similar low rates of mortality (or no mortality) between the treated and control group will ensure that removal did not cause egg mortality. Thus, any mortality recorded for the insecticide assay should be due to the insecticide treatment. The same preliminary experiment can be conducted using first instars to ensure that methods for collecting do not kill the experimental insects. All experiments conducted later should include control replications that do not receive insecticide but are treated with the solvent (for these experiments, tap water was the solvent).

Preliminary experiments should be conducted with the recommended label rate for formulated products and then serially diluted to determine the correct concentrations to produce a concentration response curve of mortality ranging from 20-80%. Previous insecticide studies on the same insects or compounds may also be insightful when trying to determine the appropriate concentration. Concentrations will need to be modified dependent upon the insect, life stage, and compound used. New solutions should be made each time an experiment is conducted.

The exposure of first instars to wet residues was necessary to get high mortality. Although this life stage is considered more susceptible to insecticides than older nymphs and adults, high mortality was still difficult to obtain with formulated products. Submerging the first instars into insecticides similar to the eggs was not plausible because of the resultant high mortality, thus this was a limitation to the study. The alternative first instar bioassay was manipulated to maintain first instars on surfaces to force constant contact with the treatment.

Dry residue assays and bottle assays commonly used for insecticide efficacy and resistance studies do not provide methodology for testing against multiple insect life stages¹⁷. These assays are often used to determine resistance in insects, and not to test insecticide efficacy. There are limited studies on egg dipping toxicological studies and none that have reported a standard methodology previously that can be repeated for multiple insect species.

This study provides a protocol for testing insecticide efficacy against bed bug eggs and first instars. Efficacy should be evaluated in different life stages, if not all, for a more holistic view of the efficacy of a treatment program. This consideration is important because an insect's susceptibility to insecticides changes with age and development ¹⁸. While age is an important factor in insecticide susceptibility, a factor in egg insecticide susceptibility is the eggshell. The eggshell provides a barrier to insecticides and makes insect eggs particularly difficult to control¹⁹.

These toxicological assays provide researchers a way to evaluate insecticide toxicity against various life stages of insects. Insecticidal solutions are prepared to evaluate mortality and to determine LC₅₀ concentrations. While this protocol was used for formulated products, the steps can be manipulated for technical grade compounds and for a variety of insects and life stages to evaluate toxicity.

Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Wir danken Molly Stedfast zur Verdünnung und Pestizid-Formulierung Unterstützung. Wir danken auch Troy Anderson für Probit-Analyse Führung und Zachary Adelman für die Unterstützung bei experimentellen Design. Diese Forschung wurde teilweise durch eine Entomologischen Foundation Award und von Virginia Pest Management Stipendienfonds unterstützt.