Method Article
ACT-פרסטו (הקשורים בלחץ טכניקת בהירות פעיל העברה יעילה ויציבה של מקרומולקולות לאיברים) מאפשרת סליקת רקמות מהירה, יעילה, אבל לא יקרה וחדירת נוגדן מהירה לרקמות מסומנות על ידי דיפוזיה פסיבית או מסירה סייע בלחץ. באמצעות שיטה זו, מגוון רחב של רקמות יכול להיות מסומן, immunolabeled ידי נוגדנים מרובים, ו-צלם נפח.
זיהוי והחקירה של הארגון המפורט של איברים או של כל הגוף ברמה התאית הם אתגרי יסוד בביולוגיה. שיטות מעברות דורשות כמות משמעותית של זמן ומאמץ כדי לקבל תמונת 3D וכולל חתך ברקמה ללא פגע, immunolabeling, והדמית רקמות מחולקות סדרתי, אשר מייצרת הפסד של מידע בכל שלב של התהליך. בגישות שפותחו לאחרונה עבור הדמיה ברזולוציה גבוהה בתוך רקמה שלמה, אפיון מולקולרי הוגבל על התיוג של חלבונים. עם זאת, פרוטוקולים הקיימים כיום לסליקת איבר דורשים זמן תהליך ארוך באופן משמעותי, מה שהופך אותו קשה ליישם טכניקות סליקת רקמות במעבדה. הקמנו לאחרונה פרוטוקול מהיר הפערים לשחזור כינה ACT-פרסטו (א r ressure p echnique- t larity ג ctive במצב רוח מרומם fficient דואר ו- s השולחן t ransferשל מקרומולקולות לתוך rgans o), המאפשר פינוי רקמות בתוך מספר שעות. יתר על כן, ACT-PRESTO מאפשר immunolabeling המהירה עם שיטות קונבנציונליות ומאיץ חדירת נוגדן לתוך השכבה העמוקה של בנוי בצפיפות, דגימות עבות על ידי יישום זרימת לחץ או הסעה. אנו מתארים כיצד להכין רקמות, כיצד לנקות ע"י הסרת שומנים באמצעות אלקטרופורזה, וכיצד חיסוניים להכתים ידי משלוח לחץ בסיוע. המהירות והעקביות של פרוטוקול יזרז את ביצוע מחקר היסטולוגית 3D ואבחנות מבוססי נפח.
אחד האתגרים במדעי המוח הוא להדמיה של חיווט מעגלים עצביים ועל תאים בודדים בתוך רקמת המוח ללא פגע. עד לאחרונה, הוכיח את הקשרים בין הנוירונים בדרך זו נדרש 1) חתך סדרה של רקמות; 2) תיוג מולקולרי של מטרות ספציפיות, כגון אקסונים או חלבונים; ו -3) להדמיה באמצעות שחזור 3D של המוח כולו באמצעות רישום או יישור חישובית של תמונות סדרתי 2D 1. צעדים אלה הם מייגעים, דורשים מידה רבה של זמן, והם עלולים לאבד מידע במהלך חתך וסימון, מה שהופך מיפוי רשת עצבי קשה ביותר. עם זאת, שיטות רבות המאפשרות הדמיה של רקמות שלמות בלי חתך פותחו. רקמות ביולוגיות יכולות להתבצע שקופות אופטי ידי טכניקות סליקת רקמה 2-10. אחת השיטות העיקריות הוא להפחית הבדלים מקדמים שבירים בין הרקמות השלמות פתרון הטבילה כדיכדי לצמצם פיזור אור בתוך הרקמה ללא פגע, ובכך הופך את הרקמה שקופה המאפשרת התצפית של מבנים עמוקים. סוגים מסוימים של פתרונות טבילה יש תכונות הידרופוביות, אשר תוצאה מרווה פלורסנט מהר במהלך הליך ההתייבשות. לכן, שיטות אלה אינן תואמות דימות פלואורסצנטי על פני תקופה ארוכה של זמן 11,12. במקום ריאגנטים הידרופובי, שיטות אחרות להשתמש ריאגנטים הידרופילי לניקוי רקמות, כגון SeeDB 4 ו Sca l e 6, המקיימים את המידע המבני הקרינה של 4,6,8 הרקמה הביולוגית. עם זאת, מקרומולקולות, כולל נוגדנים, לא יכול להגיע הליבה של רקמות ללא פגע על ידי דיפוזיה לבד. לפיכך, התיוג מראש של מולקולות מטרה באזורים עמוקים של רקמות בצפיפות וגדושות הוא מאתגר מהבחינה טכנית.
בשיטת רקמת סליקה לאחרונה מפותחת, CLARITY 3, אני רקמה ביולוגי-מוטבע הידרוג'לs נוצר עם acrylamide, ושומנים יוסרו על ידי אלקטרופורזה תחת סולפט dodecyl נתרן (SDS) פתרון המכילים. המדגם הוא שקוע אז בתמיסה עם אינדקס התאמה רעיוני להפחית אור פיזור 3. מערכת הסרת שומנים שונה מאוחר יותר בבהירות מתקדמת 13 ו PACT (טכניקת בהירות פסיבית) 10. לאחר פילמור, שרשראות acrylamide crosslink עם חלבונים, יוצרי רקמות הידרוג'ל. רכיבי שומנים לא יכול crosslink עם acrylamide; ובכך, ניתן לבטל שומנים ידי אלקטרופורזה תחת חיץ SDS המכיל. באמצעות החיסול הפעיל של שומנים, רקמות המוח עולות באופן ניכר בשקיפות 9. עם זאת, שיטות אלו אינן מטפלות האפשרות של תיוג עמוק על ידי דיפוזיה חופשית. כדי להתגבר על מגבלה זו, טכניקות להובלה הפעילה של ריאגנטים לחלקים העמוקים של רקמות עבות נדרשות.
למרות CLARITY מאפשר סליקת רקמות-רקמות עמוקותלהדמיה, זה לא הליך קל או מהיר. זה יכול לקחת כמה שבועות כדי לנקות 7,14 במוח העכבר כולו. התבהרות מהירה של רקמות חיונית עבור היישום של שיטות כאלה להגדרות מעבדה בסיסיות או קליניות למחקר מדעי חיים או אבחנת נפח. הפרוטוקול הנוכחי מספק תהליך פשוט לקבלת אישור רקמה ביולוגית וזיהוי חלבון לאחר מכן על ידי מכתים חיסוני משלוח בסיוע לחץ. היא מתאימה הדמיה נפח ברזולוציה גבוהה של מערכות עיבוד נתונים גדולות הגיש ו 3D באמצעות שילוב עם שיטות הדמיה.
ניסויים בבעלי החיים חייבים לעמוד בכל התקנות הממשלתיות ומוסדיות הרלוונטיות.
1. הכנת ריאגנטים
2. הכנת דוגמאות & קיבוע
3. עירוי מונומר הידרוג'ל ו Polymerization
4. ניקוי רקמות Electrophoretic (ETC)
5. immunolabeling של רקמות ACT-מעובד
6. immunolabeling של רקמות דחוסות (פרסטו)
7. אניmaging
סליקת ACT-רקמה
אחד שיקולים חשובים המשפיעים סליקת רקמות הם קיבעון רקמות. קיבעון עירוי acrylamide PFA הם שלבים נפרדים בפרוטוקול זה. לאחר שלב פילמור הידרוג'ל-רקמה, פתרון A4P0 חינם אינו polymerized, למרות הידרוג חדורים רקמות הם צולבים עם מקרומולקולות אנדוגני. לפיכך, לא ג'ל צריך טופס מחוץ הרקמות (איור 2 א). תוצאות ההליך ACT בפחות cross-linking בין חלבונים acrylamide לעומת פרוטוקול CLARITY. בהתאם לכך, מדגם הידרוג'ל הרקמות הוא נקבובי יותר. תכונה זו מאפשרת מיצוי מהיר של ליפידים ואת דיפוזיה של מולקולות. קטעי עכבר המוח 1- עד 2 מ"מ עבה פונו מספקת בתוך 1 - 2 h (תרשים 2B), ו 5 - 6 שעות של ETC הספיקה גlearance של מוח עכבר השלם (איור 2 ג). סליקת רקמות בתיווך הידרוג'ל מושרה הרחבת הרקמות לאחר שלב ETC, אך הרקמה חזרה לגודלו המקורי בתמיסת מדד בהתאמה רעיונית. מדגם הידרוג'ל הרקמות נוצר בהליך ACT הוא נקבובי ביותר, וכך, תרכובות קטנות מקרומולקולות יכולים לחדור ביעילות לנטרל בקלות (איור 3). לאחר דגירה 2-h של פרוסות המוח 1 מ"מ עם hydroxylase טירוזין (TH) נוגדנים מסוג IV קולגן, דגירה 2-h לאחר מכן עם נוגדנים משני הספיק לתייג נוירונים דופאמינרגיים בעומק 500 מיקרומטר (איור 3) .
Presto-רקמות immunolabeling
יש איברים צפופים בדרך כלל בריכוזים גבוהים של סיבי ECM, אשר משפיע על החדירה של נוגדנים לתוך הרקמות. לפיכך, נוגדנים penetמדורג עד לעומק של רק 20-30 מיקרומטר ברקמות צפופות, כגון רקמת כליה, לאחר 12 שעות של דגירה. כדי להתגבר על מגבלה זו, עצבנו שיטות חדירות מקרומולקולה פעילות המאפשרות המשלוח של חומרים כימיים לתוך רקמות עמוקות, כלומר PRESTO (לחץ קשור העברה יעילה ויציבה של מקרומולקולות לתוך האיברים) (איור 4). לעומת הדגירה סטטי של רקמת כליה-מעובד ACT עם פתרונות נוגדנים, היישום של כוחות צנטריפוגליים (600 XG) עם צנטריפוגות בטבלה עליונה (פרסטו, ג-PRESTO צנטריפוגלי) משלוח הנוגדן השתפר מאוד לתוך רקמות עמוקות (איור 5). כאשר אנו להחיל את הליך ג-PRESTO לרקמות צפופות, 3 שעות של אינקובציה היו מספיק לתייג 250 עד 300 מיקרומטר מבנים עמוקים. כדי לשפר את עיוות רקמות ללא נזק לרקמות משמעותי, גם עיצבנו מכונת המספק תזרים הסעה עם משאבת מזרק (מזרק PRESTO, s-פרסטו). תהליך זה PE נוגדן השתפר באופן דומה netration לעומת דיפוזיה פסיבית (איור 5).
הכנה איור 1. של מנגנון s-פרסטו. א מזרק (30 מ"ל) ו שסתום משולשת. .ב שסתום המשולש מחובר ומודבק המזרק. ג מזרק המכיל את הפתרון מדגם נוגדנים, ואת מזרק דגש על משאבת מזרק. ד משאבת מזרק התקנת תנאי עבודה. .ה משאבת ממלאה תמיסה המכילה חומרים כימיים התיוג לתוך הדגימה. כאשר הנפח המיועד הוא הגיע, שינוי כיוון שאיבה ייסוג הפתרון לאחר פרק זמן מוגדר של זמן. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
EP-together.within-page = "1">
איור 2. סליקת רקמות ACT של מוח עכבר. א לאחר פילמור, פתרונות A4P0 חינמיים לא polymerized; הידרוג חדורים רקמות gelated ידי cross-linking עם מקרומולקולות אנדוגני. ב 1- פרוסות מוח עבות מ"מ 2 פוניו 1 - 2 שעות, ואת היקף ההרחבה והתאוששות גודל באינדקס רעיוני (RI) פתרון -matching נרשם. העובי ג במוח העכבר כולו הוא כ -0.8 ס"מ, ו 5 - 6 שעות של ETC היה מספיק כדי לנקות לחלוטין את המוח. אחרי 3 שעות של ETC, הייתה כמות משמעותית של רקמה שאינן נמחק. על ידי 6 שעות של ETC, לעומת זאת, סליקה של המוח כולו התרחשה. הצבע של רקמות לאחר ACT למאגר ETC הוא לבן או אטום. על ידי התאמת RI, הרקמות להיות שקופות. אנא לחץ אותהדואר כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 3. immunolabeling עם רקמת מוח עכבר פינת ACT. תמונות של פרוסות מוח עכבר ACT-מעובד 1 מ"מ מראות קליפת עכבר מוח מוכתמת נוגדן מסוג IV קולגן חלק של המוח התיכון מוכתם נוגדן כדי טירוזין hydroxylase (TH). סרגל קנה מידה, 100 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 4. PRESTO שיטות immunolabeling. נוגדנים אינם יכולים לחדור לרקמות צפופות על ידי דיפוזיה. שיטות immunolabeling PRESTO נועדו להחדיר מקרומולקולות לספק ריאגנטים אקטיבייםרקמות צפופות. היישום של כוחות צנטריפוגליים באמצעות צנטריפוגות בטבלה העליונה סטנדרטי (צנטריפוגלי PRESTO, ג-פרסטו) ניכרת הקל על משלוח של נוגדנים. Appling זרימת הסעה עם משאבת מזרק (מזרק PRESTO, s-פרסטו) השתפרה חדירת נוגדן. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 5. PRESTO immunolabeling של רקמה צפופה פינת ACT. עבור C-פרסטו, רקמות היו centrifuged ב 600 XG למשך 3 שעות באמצעות צנטריפוגות בטבלה עליונה סטנדרטית כדי להאיץ את החדירה של נוגדנים ראשוניים ומשניים. עבור s-פרסטו, משאבת מזרק היה בשימוש בכדי לשלוח את הנוגדנים. איברי עכבר, כגון כליות והכבדות, תויגו עם IV סוג קולגן. בהשוואה לשיטות קונבנציונליות, 3 שעות שלC- או s-PRESTO משפר את עומק התיוג ניכר. בכליות ובכבד, עומק הציר-Z מגיע 300 - 350 מיקרומטר או עמוקים בדגימות PRESTO (מימין), בעוד דגימות בקרה מסומנות בעומק של רק 40 - 50 מיקרומטר (משמאל). תמונה משוחזרת 3D הושגה עם מיקרוסקופ confocal. סרגל קנה מידה, 100 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
קיבעון או טבילת הידרוג'ל מסכן לרקמות יכול לגרום לאובדן של חלבונים ואת העיוות של רקמות במהלך תהליך ניקוי רקמות. מוח עכבר הבוגר כולה צריך להיות וטופחיו paraformaldehyde 4% בין לילה, ואחריו טבילת נפח מינימאלי של 20 מיליליטר של תמיסת מונומר הידרוג'ל במשך 12 - 18 שעות עם רעד עדין. עבור רקמות גדולות, כולל רקמה אנושית כגון פרוסות המוח וחוט השדרה, הוארך השריה זמן בפתרון מונומר הידרוג'ל נדרש. פרוטוקול ACT ישימה בקלות פעולות הסליקה של רקמות קבועות משום ששלבי עירוי פולימר קיבעון רקמות מופרדים. לאחר ניקוי רקמות, רקמות אנושיות היו היטב מוכתם כמה נוגדנים. ראוי לציין, כי טכניקת סליקת ACT אינה תואמת fixatives אלכוהול, כגון אתנול, מתנול.
צעד פילמור הידרוג'ל הרקמות חיוני גם כדי לייצר רקמות באיכות טובה לאחר תהליך הסליקה. כיחמצן מעכב את פילמור של acrylamide, יש להסירו ידי degassing הפתרון המכילים הרקמה תחת מערכת עירוי גז חנקן. לחלופין, דה-חמצון ניתן לבצע באמצעות תא ואקום עם גוש חום במשך 23 שעות.
שיעור הסליקה תלוי בגורמים רבים, כולל גודל האיבר, את התוכן של שומנים או חלבונים סיביים ECM, התנאי של קיבעון, וכו רקמות עכבר רוב הבוגרים ניתן לסליקה על ידי ETC הלילה. עם זאת, קיים סיכון של מיותר על סליקה ונפיחות רקמות; וכך, ההבדלים בזמן סליקה של שיקול חשוב. תנאי רקמות סליקה יש לקבוע באופן אמפירי. חשוב לציין, את התוכן של ECM עשוי להשפיע על המראה של רקמת הפינה. הצבע של הרקמות נשאר לבן או אטום, גם לאחר ACT במאגר וכו ', כי אין דבר לנקות סיבי חלבון צפופים. עם זאת, כאשר גופים אלה היו שקועים פתרון התאמת RI, אתy הפך שקוף.
שיעור נפיחות רקמה שנראה תלוי תוכן ECM של הרקמות, ואיברים רכים, כמו המוח, להפגין יחס נפיחות גדול יותר איברים צפופים. בגלל רקמה עלתה נפיחות תעזור ההליך לסליקת רקמות, ACT שגרתי מנצל מזוקק חיץ על בסיס מים ברוב המקרים. במקרים מסוימים, כאשר נפיחות רקמות או עיוות חולפת אינן רצויות, כגון בעוברים, PBS 0.1x מאגר המכיל ניתן ליישם הדמיה ברזולוציה גבוהה. כמו כן יש לציין כי ריכוז מלח גבוה למאגר עלול לגרום ההתכווצות של רקמות.
שיטת ACT יכולה להבהיר איברים שלמים ואפילו כל הגוף של עכבר 14. עם זאת, הדמית רקמות עמוקות של רקמה שקופה דורשת מיקרוסקופים ויעדים מיוחדים. לכן, מוח רקמות 1 עד 2 מ"מ עבה הוא יעיל ביותר עבור הדמיה באמצעות מיקרוסקופ confocal קונבנציונלי. בידיים שלנו, הסרת תוויתנוגדני ed מרקמות מעובד ACT הוא נוגדן תלוי, ופגזים של תיוג נוגדן שונה אינם מומלצים. נוגדנים אחדים, כגון TH ו GFAP, עבדו טוב במיוחד עבור המוח כולו immunolabeling 14. מצד שני, כמה נוגדנים, כגון Tuj1 או MAP2, לעתים קרובות שכותרתו רק את פני השטח של הרקמות. זה עשוי להשתפר על ידי שיטות אחרות, כגון מתג 15. הגבלת פוטנציאל נוספת היא שזה עלול להיות קשה לשמר מבנים חלבוניים בסדר ברקמת ACT-מעובד בגלל רקמת נפיחות התכווצות במהלך שלב ניקוי הרקמות.
טכניקת PRESTO ישימה למגוון רחב של טכניקות תיוג רקמות. לדוגמא, בשיטות רקמה שקופה בעזרת רקמות מראש שכותרתו, כגון SeeDB 4 ו iDISCO 7, immunolabeling של רקמה צפופה דורש תקופות דגירה ארוכות יותר בכמה ימים עד שבועות. עם זאת, PRESTO יכול לקצר את זמן הדגירה לכמה שעות, דוארnabling השלמת התהליך כולו תוך יום עם רקמה צפופה בעובי 1 מ"מ. PRESTO יכול לשפר את היעילות של תיוג עמוק עבה, רקמות צפופות, או אפילו רקמות עבות un-פינה. בגלל PRESTO משתמשת צנטריפוגות בטבלה העליונה או משאבת מזרק ואינו דורש שום ציוד מיוחד, קל יחסית ליישום הטכניקה הזו לנהלים מעבדה שגרתיות.
החוקרים מצהירים כי אין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.
This research was supported by the Brain Research Program through the National Research Foundation (NRF) funded by the Korean Ministry of Science, ICT, and Future Planning (NRF-2015M3C7A1028790).
Name | Company | Catalog Number | Comments |
4% Paraformaldehyde | Lugen SCI | LGB-1175-4B | sample fixation |
Acrylamide | Affymetrix | 75820 | Hydrogel monomer solution |
2,2’-Azobis[2-(2-imidazolin-2-yl) propane] dihydrochloride | Wako Pure Chemical Industries | VA-044 | Hydrogel monomer solution |
Boric acid | Affymetrix | 76324 | ETC buffer |
Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) | Affymetrix | 18220 | ETC buffer |
Sodium hydroxide pellets | Junsei chemical | 1310-73-2 | ETC buffer |
Bovine Serum Albumin (BSA) | Santa Cruz Biotechnology | sc-2323A | Immunolabeling |
Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | Immunolabeling |
Sodium azide | Sigma-Aldrich | S2002 | Immunolabeling |
Tyrosine hydroxylase (TH) | Millipore | AB152 | Antibody/immunolabeling |
Alexa Fluor Cy3 Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 711-165-152 | Secondary antibody/ immunolabeling |
Alexa Fluor 488 Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) | Life Technologies - Molecular Probes | A21206 | Secondary antibody/ immunolabeling |
Confocal dish | SPL lifesciences | 101350 | Imaging |
Confocal microscope | Leica | SP8 | Imaging |
Sucrose | Junsei chemical | 31365-0301 | CUBIC-mount solution |
Urea | Affymetrix | 23036 | CUBIC-mount solution |
N,N,N’,N’-tetrakis(2-hydroxypropyl)ethylenediamine | Sigma-Aldrich | 122262 | CUBIC-mount solution |
ECT chamber | Logos Biosystems, Inc. | C10101 | ETC system |
ECT chamber controller | Logos Biosystems, Inc. | C10201 | ETC system |
Temperature probe | Logos Biosystems, Inc. | C12101 | ETC system |
Peristatic pump | Baoding longer precision pump Co., Ltd | YZ1515X | ETC system |
Buffer reservoir | Logos Biosystems, Inc. | C10401 | ETC system |
Tissue container | Logos Biosystems, Inc. | C12001 | ETC system |
Container holder for 1 tissue container | Logos Biosystems, Inc. | C12002 | ETC system |
Mouse brain slice holder | Logos Biosystems, Inc. | C12004 | ETC system |
Whole rat brain holder | Logos Biosystems, Inc. | C12007 | ETC system |
Peristaltic pump tubing | Logos Biosystems, Inc. | C12104 | ETC system |
Tabletop-centrifuge | Hanil science industrial Co., Ltd | MICRO 12 | c-PRESTO |
Syringe pump | Baoding longer precision pump Co., Ltd | LSP02-1B | s-PRESTO |
Syringe (30 mL) | Korea vaccine Co., Ltd. | KV-S30 | s-PRESTO |
3-way stopcock | Hyupsung medical Co.,Ltd. | HS-T-01N | s-PRESTO |
Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article
Request PermissionThis article has been published
Video Coming Soon
Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved