סינתזה של חלבון Bioconjugates

פרוטוקול זה מפרט את הצעדים החשובים הנדרשים bioconjugation של ציסטאין המכיל חלבון על maleimide, כוללים טיהור מגיבה, תנאי תגובה, טיהור bioconjugate ואפיון bioconjugate.

The chemical linking or bioconjugation of proteins to fluorescent dyes, drugs, polymers and other proteins has a broad range of applications, such as the development of antibody drug conjugates (ADCs) and nanomedicine, fluorescent microscopy and systems chemistry. For many of these applications, specificity of the bioconjugation method used is of prime concern. The Michael addition of maleimides with cysteine(s) on the target proteins is highly selective and proceeds rapidly under mild conditions, making it one of the most popular methods for protein bioconjugation.

We demonstrate here the modification of the only surface-accessible cysteine residue on yeast cytochrome c with a ruthenium(II) bisterpyridine maleimide. The protein bioconjugation is verified by gel electrophoresis and purified by aqueous-based fast protein liquid chromatography in 27% yield of isolated protein material. Structural characterization with MALDI-TOF MS and UV-Vis is then used to verify that the bioconjugation is successful. The protocol shown here is easily applicable to other cysteine - maleimide coupling of proteins to other proteins, dyes, drugs or polymers.

Bioconjugation עוסק בחיבור קוולנטית biomolecule אחד עם השני או עם מולקולה סינתטית כגון צבע, סמים או פולימר. שיטות bioconjugation חלבון נמצאות כיום בשימוש נרחב קבוצות מחקר כימיה, ביולוגיה וננוטכנולוגיה רבות עם יישומים החל תיוג פלורסנט לצבוע ^1,2, מה שהופך של חלבון (נוגדן) -prodrugs ³ (conjugates תרופת נוגדן - ADC) סינתזה של הדימרים חלבון ^4,5 , ועד כלאי חלבון-פולימר הרכבה עצמית ^6,7 המשמשים כימיה nanomedicine ⁸ ומערכות ^9.

ספציפית של הכימיה המשמש bioconjugation, בעוד לא תמיד קריטי, הוא בעל חשיבות עליונה עבור bioconjugates חלבון הפונקציונלי ביותר, כדי לא להפריע את האתר הפעיל של חלבון המטרה. תגובת bioconjugation האידיאלית צריכה לקיים מספר קריטריונים, כולל: i) מיקוד אתרים נדירים או ייחודיים על החלבון של עניין,ii) להיות סלקטיבית כלפי יעד זה, iii) להמשיך בתנאים שאינם denaturing להימנע חלבון התגלגלות iv) להיות גבוה מניב כמו חלבון המטרה הוא בדרך כלל זמין רק בריכוז תת-millimolar. Maleimide - ציסטאין מיכאל בנוסף מתקרב להגשמת כל הקריטריונים הללו, ויש לו מסיבה זו טענה ארוכה מעמד מיוחד בתחום כימית bioconjugate ^10. הסיבה לכך היא כי אני) חלבונים רבים המכילים שאריות ציסטאין היחיד על פני השטח שלהם יכול להיות מהונדסים גנטית שם, ב) על pH הנכון התגובה היא מאוד סלקטיבית כלפי ציסטאין, iii) זה יתנהל למישרין מאגרים מימיים iv) זה מהר מאוד עם קבוע של maleimides שיעור מסדר שני חלבונים המכילים ציסטאין דיווחו יעלה 5,000 M ^-1 שניות ^-1 ובמקרים מסוימים ^11. ספקו את החלבון של עניין יכול לסבול קטנה (≈ 5-10%) כמות אורגן שיתוף ממסים ^12, כמעט כל צבען פונקציונלי maleimide, פוlymer ומשטחים או חלבון אחר יכול להיות קשור חלבונים. בנוסף, maleimides הם ספציפי יותר עבור cysteines על חלבונים מאשר iodoacetamides, אשר נוטה יותר להגיב עם נוקלאופיל אחר ב- pH הגבוהה; ויציבה יותר מאשר גזרה בבניינים מבוססי דיסולפיד אשר צריך להישמר ב- pH חומצי כדי למנוע חילופי דיסולפיד ^13.

כאן אנו מדווחים פרוטוקול גנרי הנטייה של מולקולות פונקציונלי maleimide לחלבון המכיל שאריות ציסטאין יחידות באמצעות התגובה בין Ru (II) כרומופור מבוסס ואת ציטוכרום C חלבון חיזור כדוגמא. פרוטוקול זה הוא החלים באופן שווה על רוב החלבונים אחרים המכילים שאריות ציסטאין משטח נגישות ויעד maleimide הפונקציונלית המקביל, בין אם הוא חלבון אחר, צבע ניאון, כרומופור או פולימר סינטטי.

הערה: הפרוטוקול הבא מיועד הסינתזה של bioconjugate חלבון-צבען כפי שמוצג באיור 1 זהו פרוטוקול כללי עבור התגובה של maleimide עם חלבונים המכילים ציסטאין משטח בחינם, עם הערות מוכנסות ישים לסייע עם חלבון הממברנה. bioconjugates, bioconjugates חלבון-פולימר, ו דימר חלבון סינתטי (חלבונים) bioconjugates. במקרה המסוים הזה, ציטוכרום C חלבון iso-1 יש שאריות ציסטאין משטח אחד זמינות להגיב המאפשרות תיוג מאוד ספציפי להתרחש. אם חלבון של עניין יש שאריות ציסטאין מרובות, באותו הפרוטוקול חל, אמנם עם הפסד של סגוליות והומוגניות מוצר. כימיה מיקוד שאריות ליזין פני השטח, באמצעות אסטרים -hydroxysuccinimidyl N או isothiocyanates, עשויה להיות גישה יותר פשוט אם סגוליות אינו נדרש.

תכנית תגובה באיור 1. Bioconjugation. כמקרה לדוגמא, קציר אור, מולקולת אנטנה מבוססת רותניום תצורף ציטוכרום C באמצעות מיכאל תוספת של תליון maleimide על מולקולת האנטנה מבוססת רותניום שאריות ציסטאין החשוף (CYS102) על החלבון. האזור האדום של משטח ג CYT מציין את קבוצת heme. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

טיהור 1. של ציטוכרום C

הערה: שלב זה אינו חל על כל החלבונים. עם זאת, חשוב לדעת כי חלבון המתקבל מן ספק מסחרי יכול להכיל isoforms חלבון אחר, רצוי אשר ייתכן שיהיה הצורך להסירו באמצעות טיהור נוספת ^13.

1. ממיסים 2.4 גרם של פוספט dihydrogen נתרן (M _w = 120 גרם mol ^-1) ב 1 ליטר של מים ultrapure כדי prepare פתרון מאגר המכיל 20 מ"מ לאא ₂ PO _4. התאם את ה- pH עם 1 M NaOH ל- pH 7.
   הערה: מאגרים פוספט משמש פרוטוקול זה צריך להיות מוכן טרי על בסיס יומי, ולסנן דרך פילטר ממברנה תאית 0.2 מיקרומטר לפני השימוש.
2. ממיסים 29.22 גרם של נתרן כלורי (M _w = 58.44 גרם mol ^-1) ב 500 מ"ל של חיץ 20 מ"מ לאא ₂ PO ₄ לעשות 20 מ"מ לאא ₂ PO ₄ ו -1 חיץ M NaCl. זהו חיץ elution לטיהור בשלב 1.6).
3. ממיסים 12.0 מ"ג של ציטוכרום C lyophilized (ג CYT) ב 6 מ"ל של pH 7 חיץ פוספט 20 מ"מ.
4. בנפרד לפזר 14.7 מ"ג של dithiothreitol (DTT, M _w = 154.25 g / mol) ב 95.3 μl של מים ultrapure להכין פתרון המניה 1 M.
   הערה: פתרון מניות DTT אמור להיות מוכן טרי, כמו מגיב זה רגיש שחרור משרות חמצונים בתמיסה מימית.
5. צִפצוּףette 60 μl של פתרון M DTT 1 לתוך תמיסת החלבון להפחית את ג CYT. הצבע של הפתרון ישתנה מאדום כהה לאדום אור על ערבוב.
6. סנן את פתרון החלבון המופחת דרך פילטר מזרק 0.22 מיקרומטר נמוך חלבון מחייב PVDF לפני ההזרקה גבי כל מדיה chromatographic.
7. צרף עמודת קטיוני 3.3 מיליליטר חזקה בין לולאת הזרקת הגלאי-Vis UV של מכשיר כרומטוגרפיה נוזלית מהיר חלבון (FPLC).
8. לאזן את העמודה עם 3 כרכים עמוד מים ultrapure, ואחריו 3 כרכים הטור של חיץ פוספט 20 מ"מ pH 7, באמצעות קצב הזרימה של 1 מ"ל / דקה.
9. טען 1 מ"ל של ג CYT גולמי מופחת לתוך הלולאה זריקה, ולהתחיל שיטה שיפוע 328 - 450 מ"מ NaCl, מעל 5 כרכים עמודה. לפקח על ערוצי 280 ננומטר ו 410 ננומטר של גלאי UV-Vis, לאסוף את השיא הגדול.
10. להגדיל את ריכוז מלח 1 M עבור 2 כרכים עמודה כדי elute ציטוכרום iso-2דואר ג, ואחרי הטור כבר סמוק, מחדש לאזן את העמודה עם 2 כרכי עמודה של 20 מ"מ חיץ פוספט לפני הזרקת aliquot הגולמי הבא.
11. חזור על שלבי 1.9-1.10 עד שכל החלבון הגולמי טוהר.
12. פינת שברים המכיל 1 iso ולרכזם באמצעות מסנן ספין 3.5 kDa מולקולרית משקל קטעון (MWCO) ו centrifuging ב 3,000 x גרם.
13. טען את חלבון מרוכז לתוך 3.5 קלטות דיאליזה kDa MWCO ו dialyze נגד במים למשך הלילה ultrapure, עם 2 שינויים של מים.
14. קבע את הריכוז של הפתרון חלבון טהור, מרוכז על ידי לקיחת 10 μl, דילול אותו ל -100 μl עם מים ultrapure, ובנטילת ספקטרום ספיגת. השתמש בנפח נמוך, 100 קובט קוורץ μl להשיג ספקטרום ספיגת החלבון. בדרך כלל, ריכוז החלבון החי הוא בסדר גודל של 50 - 100 מיקרומטר.
    1. השתמש שיא 410 ננומטר האופייניים ג CYT לכמת את concentration באמצעות החוק בר-למברט עם ערך ספיג טוחן של 97.6 סנטימטר ^-1 מ"מ ^-1:
       A = ε × ג × ι
       כאשר A הוא ספיג, ε הוא הספיגות הטוחנת, c הוא ריכוז מ"מ, ו ι הוא הנתיב אורך קובט בסנטימטר ^13.
15. בשלב זה, לחלק את החלבון לתוך 1 aliquots מ"ל ולשמור קפוא ב -20 ° C עד שהם נחוצים. ג CYT אפשר להקפיא מופשר ללא אובדן של מבנה או תפקוד, אך מחזורים חוזרים יתחילו לפגל החלבון.
    הערה: חלבונים לסבול הקפאה בדרגות שונות. לדוגמא, חלבוני ניאון ירוקים ^5,9 לא צריך להיות קפוא, מאוחסנים במקום במקרר.

סינתזה 2. של ציטוכרום C Bioconjugates

1. ממיסים 0.9 מ"ג של רותניום (II) bisterpyridine maleimIDE (Ru (II) (tpy) ₂ -maleimide, 0.975 μmol, 6 ושווי) ב 600 μl של אצטוניטריל.
   הערה: אם maleimide בשימוש הוא מסיס במים, להכין פתרון מניות במים במקום אצטוניטריל. חשוב עבור maleimide להיות מסיס למאגר התגובה. Dimethylsulfoxide, N, N -dimethylformamide, ו אצטוניטריל כולם נפוץ adjuvants כדי לסייע בפירוק של משקל מולקולרי נמוך ^12, לעתים קרובות המגיב maleimide הידרופובי.
2. הכן פתרון מאגר המכיל 100 מ"מ חיץ פוספט 100 מ"מ חומצה ethylenediaminetetraacetic (EDTA, M _w = 292.24 g / mol), אשר כאשר מדולל ל 20 מ"מ הוא ב- pH 7. להוסיף נתרן הידרוקסידי מוצק עד EDTA נמס (כמה גרם בדרך כלל ) ולהתאים ל -7 pH.
3. ממיסים 2.87 מ"ג של טריס (2-carboxyethyl) hydrochloride phosphine ⁽¹⁵ TCEP, M _w = 286.65 g / mol) ב 1 מ"ל של מים ultrapure להכין פתרון המניה 10 מ"מ. שלב זה הוא יבואנמלה על מנת להבטיח כי ציסטאין על החלבון מצטמצם לפני ומזומן maleimide צימוד ^15.
   הערה: פתרון מניות TCEP צריך להיות מוכן טרי עבור כל תגובה, כפי מגיבים זה רגיש שחרור משרות חמצונים בתמיסה מימית.
4. שלב 11.4 מ"ל מים ultrapure עם 3 מ"ל של 100 מ"מ פתרון פוספט / EDTA המניות צינור פלסטיק 50 מ"ל. כאשר מדולל יותר עם פתרונות מניות חלבון maleimide ריכוז החיץ יהיה 20 מ"מ.
   הערה: אם החלבון מתיוג הוא חלבון הטרנסממברני, להבטיח כי חומר ניקוי מתאים מתווסף למאגר כדי solubilize חלבון. אם חומר ניקוי אינו משמש החלבון הקרומי עלול לעורר לאט, אשר תשפיע באופן שלילי על תשואות תגובה. השתמש דטרגנט בכל השלבים לטיהור שלאחר מכן.
5. להוסיף 0.15 μmol (3 מ"ל של פתרון 50 מיקרומטר, 1 שווה ערך) של ג CYT מטוהרים למאגר פוספט-EDTA.
6. להוסיף 7.5 μl של solut המניות TCEPיון (0.075 μmol, 0.5 ושווי) לפתרון חלבון ולהשאיר ערבוב במשך 5 דקות כדי להפחית חלבון כלשהו שייתכן dimerized עקב חמצון ציסטאין.
   הערה: אל תוסיף TCEP אם החלבון של עניין לא dimerize בקלות. בדוק זאת על ידי הפעלת ג'ל חלבון בתנאים שאינם צמצום.
7. להוסיף 600 μl של פתרון אצטוניטריל של Ru (II) (tpy) ₂ -maleimide לפתרון מופחת, שנאגרו של ג CYT, ולהשאיר את ערבוב תערובת התגובה, בחושך, ב RT, למשך 24 שעות.
8. לרכז את תערובת התגובה באמצעות 3.5 מסננים ספין kDa MWCO, centrifuging ב 3,000 XG, לחזור 2-3 פעמים עם חיץ פוספט 20 מ"מ טריים עד תסנין פועל ברורה. סר כמו maleimide unreacted מתערובת התגובה ככל האפשר לפני השלב הבא של טיהור.
   הערה: בשלב זה, את תערובת bioconjugation הגולמית ניתן לאחסן במקרר, בחושך. חשוב להסיר צבע maleimide unreacted ידי centrifuge דיאליזה לפני אחסון כמו maleimide יכול לאט nonspecifically להגיב עם שאריות ליזין על פני השטח של החלבון.

טיהור 3. Bioconjugates ציטוכרום C

1. ממיסים 2.4 גרם של פוספט dihydrogen נתרן 29.22 גרם של נתרן כלורי ב 1 ליטר של מים ultrapure להכין פתרון מאגר המכיל 20 מ"מ לאא ₂ PO ₄ ו 0.5 M NaCl. זהו למאגר פועל עבור כרומטוגרפיה מתכת-זיקה משותקת (IMAC) טיהור.
2. ממיסים 17 גרם של imidazole (M _w = 68.077 גרם mol ^-1) ב 500 מ"ל של 20 מ"מ לאא ₂ PO ₄ ו 0.5 חיץ M NaCl. זהו חיץ elution לטיהור IMAC.
3. התאם את ה- pH של שני מאגרי pH 7 באמצעות 1 M NaOH או HCl, ולסנן אותם דרך 0.22 מיקרומטר ממברנות תאית מחדש לפני השימוש ב FPLC.
4. כמו העמודות IMAC שנרכשו נשלחות ללא יונים של מתכות הועמסו על colטור ה, להכין את העמודה במשך טיהור Ni ^{2 +} מבוססת ידי שטיפת הטור עם 3 מיליליטר מי ultrapure, 3 מיליליטר של תמיסה יצטט ניקל 100 מ"מימ, ו -6 מיליליטר מי ultrapure. אם העמודה אינה לשמש מיד לשטוף באמצעות 3 מ"ל של 20% אתנול ו לאחסן בעמודה במקרר כדי למנוע התפתחות חיידקים.
5. צרף Ni ^{2 +} -loaded 1 מיליליטר טור IMAC אל FPLC בין לולאת הזרקת גלאי Vis-UV.
6. לאזן את העמודה עם 3 כרכים הטור של פוספט 20 מ"מ, 0.5 חיץ M NaCl באמצעות קצב הזרימה של 0.5 mL / min.
7. טען 100 μl של תערובת התגובה גולמי (מסוננים דרך פילטר מזרק 0.22 מיקרומטר) על הטור Ni ^{2 +} IMAC. לשטוף את העמודה עם 3 כרכים הטור של הפעלת המאגר כדי elute ג CYT הלא הגיבו, ואחריו שיפוע imidazole מן 0 ל 125 מ"מ מעל 3 כרכים עמודה כדי elute את bioconjugate ג bisterpyridine-ציטוכרום רותניום (Ru (II) -cyt ג) .
8. שטפו את גolumn עם חיץ imidazole 250 מ"מ עבור 5 כרכי עמודה, ולאחר מכן מחדש לאזן את העמודה עם 20 פוספט מ"מ, 0.5 M NaCl וחזרו על שלב 3.7 עד שכל bioconjugate הגולמי טוהר.
9. פינת שברי bioconjugate ולרכזם באמצעות מסנן ספין 3.5 kDa MWCO, centrifuging ב 3,000 x ז.
10. טען את bioconjugate מרוכז לתוך 3.5 קלטות דיאליזה kDa MWCO ו dialyze נגד במים למשך הלילה ultrapure, עם 2 שינויים של מים.
11. קבע את הריכוז של פתרון bioconjugate הטהור, מרוכז על ידי UV-Vis, באמצעות אותו ערך ספיג טוחן כמו ציטוכרום C iso-1 (97.6 מ"מ ^{-1 -1} סנטימטר) ב -410 ננומטר. בדרך כלל, ריכוז bioconjugate הוא בסדר גודל של 50 - 100 מיקרומטר.
12. מחלקים את bioconjugate לתוך 25 aliquots μl ולשמור קפוא ב -20 ° C עד שהם נחוצים.

אפיון 4. Bioconjugates ציטוכרום C

1. להרתיעmination המסה bioconjugate ידי MALDI-TOF MS
   1. ממיסים 10 מ"ג של חומצה caffeic ב 1 מ"ל של פתרון חומצה אצטוניטריל / מים / trifluoroacetic (80: 20: 0.1, נ / V / V).
   2. לדלל 5 μl של פתרון חלבון מרוכז עם 5 μl של פתרון חומצה caffeic.
   3. ספוט 0.5 μl של פתרון חומצה caffeic על הצלחת היעד MALDI ולאפשר פתרון להתייבש.
   4. ספוט 0.5 μl הפתרון מדגם / מטריקס על גבי כתם חומצה caffeic זה, לאפשר במקום להתייבש. ספוט אחר 0.5 μl של מטריקס מדגם על גבי זה כדי "כריך" המדגם בין שכבות של מטריקס, ולאפשר לו להתייבש.
   5. רוכשת ספקטרה המונית במצב ליניארי באמצעות גדרות מכשיר מתאימות חלבונים ^16.
2. חקירת bioconjugates ידי ג'ל אלקטרופורזה
   1. כן 10 μl של כל דגימת חלבון שיופעלו על ידי דילול דגימות חלבון עם סולפט dodecyl ליתיום premixed (LDS, pH 8.4) חיץ (4x) tOA ריכוז סופי של כ 20 מיקרוגרם לכל טוב. עבור בארות הדורשים הפחתת התנאים, להוסיף 1 μl של 500 מ"מ dithiothreitol (DTT) צמצום סוכן (10x).
   2. דגימות מחממים על 70 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות.
   3. הוסף 50 מ"ל של מעורבבים מראש 1 M MES, 1 בסיס M טריס, 2% SDS, 20 mM EDTA (pH 7.7) פועל תערובת חיץ (20x) ממקור מסחרי עד 950 מ"ל מים ultrapure להכין למאגר פועל ג'ל.
   4. הסר את מסרק פלסטיק מן הג'ל ומניחים את הג'ל בתוך הטנק פועל ג'ל. מלא את המכל עם חיץ ריצת ג'ל כך הבארות מכוסות חיץ.
   5. דגימות טענו בזהירות על טרומיים 12% Bis-טריס, 1 מ"מ, 10-גם ג'ל באמצעות טיפי פיפטה ארוכים כדי לסייע טעינה. טען את סמן משקל מולקולרי 10 חלבון prestained (3-188 KDA) לתוך באר באמצע ג'ל לסייע ניתוח.
   6. הפעל את הג'ל על 200 V מתח קבוע במשך 35 דקות.
   7. הכתם ג'ל עם פתרון כחול מסחרי Coomassie עבור שעה 2, ולשטוף עם ultrapמים יור במשך 48 שעות.
3. קביעת טוהר bioconjugate ידי ספקטרוסקופיה UV-Vis
   1. הכן 120 μl של 5 מיקרומטר פתרונות של Ru (II) (tpy) ₂ -maleimide, ג CYT iso-1, ו Ru (II) ג -cyt.
   2. מדוד את ספקטרום הבסיס של קובט קוורץ המכיל מים ultrapure רק, החל מ -250 ננומטר ל -650 ננומטר.
   3. מדוד את הספקטרום של כל רכיב, הבטחת קובט היא שטף מיובשת בין כל מדידה.
   4. מגרש את הספיגה של כל רכיב כפונקציה של אורך גל, ולהשוות את הסכום ליניארי של חומרים המוצא עם המוצר הסופי כדי לקבוע אם יחס של 1: 1 של Ru (II) (tpy) ₂ -maleimide ג CYT הגיב.

הסינתזה של bioconjugates אושר על ידי שלוש שיטות עיקריות: זמן יינון Desorption לייזר בסיוע מטריקס של ספקטרומטריית מסה טיסה (MALDI-TOF MS), ג'ל אלקטרופורזה polyacrylamide, ו-סגול-גלוי (UV-Vis) ספקטרוסקופיה, כפי שמוצג איורים 2, 3 ו -4. עלייה מונית המתאימה המסה של המולקולה הקטנה צרפה, וחוסר חלבון unreacted מדגימים את ההצמדה קוולנטיים המוצלחת של Ru (II) (tpy) ₂ -maleimide ג CYT והטיהור הבאה של bioconjugate. ספקטרום UV-Vis של bioconjugate מאפשר התשואה תחושב עם הספיגה ב 410 ננומטר, ועל ידי השוואת הספקטרום על חזה 1: ספקטרום 1 תוספת של חומרי מוצא רכב bioconjugate ניתן להסיק אותו. בדוגמה לעיל, תשואה משתנה במקצת מן אצווה ל-אצווה אבל זה בדרך כלל בין 15-27% לאחר FPLC purification ^15.

בנוסף, הופעת שיא חדש הכרומתוגרמה במהלך הטיהור מאשרת את הסינתזה של מינים חדשים. זה מודגם באיור 5, שבו ניתוח של עקבות UV-Vis שונים יכולים לציין אם או לא זן מכיל את Ru (II) (tpy) רכיב -maleimide _2.

איור 2. MALDI-TOF המוני ספקטרה של חלבונים. ספקטרה המונית של ציטוכרום C טהור ISO-1 (שחור) Ru (II) -cyt ג ​​(אדום). פיקס ניתן לצפות כי מתאים להמונים המחושבים של ג CYT iso-1 (12,706 Da) ו Ru (II) -cyt ג ​​(13,559 Da) עם adduct חומצת caffeic גלוי 179 Da. Adduct הדבר בא לידי ביטוי כמויות גדולות יותר בשנות ה ג CYT unreactedpectra עקב תגובה בין α, β קרבוניל-בלתי רווי של חומצת caffeic ואת תיאול חינם של החלבון בתנאי MALDI אנרגיה גבוהה. adducts מטריקס נראה לרוב ב MALDI-MS והוא יכול להיות גם קוולנטיים ו-קוולנטיים שאינם בטבע. ספקטרה מתוקנת בסיס, רעש מסונן מנורמל להשוואה. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 3. SDS-PAGE של חלבונים. 12% Bis-טריס ג'ל של ג CYT מופחת ולא מופחת Ru (II) ג -cyt. ליין 3 מכיל תקן חלבון מראש מוכתם, עם המוני פוליפפטיד המבואר בצד ימין של כל הלהקה (KDA). אנא לחץ כאן כדי להציג versio גדולn של נתון זה.

איור 4. UV-Vis ספקטרה של חלבונים: ספקטרום ספיגת Ru (II) -cyt ג ​​(ירוק) מתאים מאוד תוספת ליניארי (מקווקו כחול) של ג CYT טהור, unreacted (אדום) ו Ru unreacted (II) ( tpy) ₂ -maleimide (שחור). מכך ניתן להסיק כי bioconjugate מורכב 1:. מצורף 1 של maleimide לחלבון אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 5. הכרומתוגרמה טיהור bioconjugates Ni-IMAC: IMAC זכר Ru (II) -cyt ג ​​טיהור. UV-Vis עקבות: 410 ננומטר תואמת את הלהקה Soret של CYc t, 280 ננומטר מתאים הן ג CYT ו Ru (II) (tpy) ₂ -maleimide, ו 475 ננומטר תואמת את להקת מטאל-אל-ליגנד תשלום העברה של רותניום (II) מורכבות. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.

טיהור של חומרים החל לפני bioconjugation הוא בעל חשיבות עליונה. חלבונים שהושגו ממקורות מסחריים רקומביננטי בדרך כלל מכילים isoforms אחר של החלבון של עניין, אשר יכולה להיות כימית תגובתיות משטח שונה. לדוגמא, ב bioconjugation המתואר, ג CYT הזמין המסחרי מכיל תערובת של שניהם ^12,14,17 ג iso-1 ו- ISO-2 CYT. Iso-2 ו- ISO-1 טפסים של ציטוכרום C הם בעיקר הומולוגי, עם ההבדל העיקרי הוא הנוכחות של שאריות ציסטאין חינם ליד הסופית- C של ציטוכרום C iso-1. בדוגמא שלפנינו, טיהור מושגת עם מימייה חזקה קטיון חילופי FPLC, לעומת זאת, צורות אחרות של FPLC כגון אניוני, זיקה, הידרופובי או בגודל הדרה כרומטוגרפיה עשויות להיות רלוונטיות יותר. החלבון מצטמצם גם בשלב זה על מנת להבטיח כי שאריות ציסטאין על החלבון של עניין (כאן ציטוכרום C) הוא פוlly מופחת לפני bioconjugation עם היעד צמוד maleimide. בנוסף, כדאי לבדוק אם המולקולה הקטנה-צרף maleimide לשמש עם ציסטאין המכיל חלבון טהור וכי maleimide שלא עבר לתגובת אחסון, כמו maleimides הוא אור רגיש לטמפרטורה. זה יכול להיות בקלות ובמהירות נבדק על ידי ¹ H NMR, כמו פרוטונים ויניל של maleimide שלם יופיעו כמו גופיה ב 6-6.5 עמודים לדקה, ואילו פרוטונים של maleimide פתוח יעבור upfield; וגם ספקטרומטריית מסה, עם טבעת פתוחה maleimide מתאים לעלייה המונית 18 Da.

מאגר הבחירה, pH, והכללה של adjuvants כגון חומרי ניקוי, ממיסים אורגניים, וסוכני צמצום תהיה השפעה עמוקה על תשואות bioconjugation ^5-15. במקרה של תוספת מיכאל של maleimide וכן תיאול, ה- pH חייב להיות מעל 6 עדיין מתחת ל -8 לתגובה מהירה, ספציפית להתרחש. להלן pH 6, סגולי גבוה כמוmaleimide לא תוכל להגיב עם כל אמינים, אבל תיאול הוא protonated ובכך הוא נוקלאופיל עלוב בנוסף מייקל מוביל תגובה איטית. מעל pH 8, שאריות ליזין המשטח יכול להיות deprotonated ומגיבים עם maleimides זמין, שמוביל מצורף קוולנטיים שאינם ספציפיים של הרכיב maleimide לחלבון. חיץ פוספט משמש bioconjugation זה כי זה חיץ חזק בטווח pH זה ואינו אינטראקציה עם כל אחד ריאגנטים. טריס (hydroxymethyl) aminomethane (טריס) חיץ, למשל, יהיה בחירה גרועה כמו הקבוצה אמינית במאגר זה עלול להגיב עם maleimide, מה שיוביל תשואות עניות. מסיסות של כל ריאגנטים היא גם מפתח תשואות גבוהות. תוספת של כמויות קטנות (<10% v / v) של ממיס אורגני יכול לסייע בפירוק של רכיבים קוטבי, בעוד pH נכונה וריכוז מלח חיוניים לשמירה על חלבונים בתמיסה ושילב ^12. לקבלת protei קרום הגדולns עם שאריות משטח הידרופובי משמעותיות, פעיל שטח יהיה צורך למנוע את החלבון מן המזרז ^18.

אם החלבון bioconjugation נוטה חמצון dimerization, תוספת של סוכן צמצום כגון TCEP הוכח לשפר את התשואות bioconjugation ^15. באתרו ההפחתה של החלבון לצורתו monomeric ונטולת תיאול שלה מאפשרת חלק גדול יותר של אתרי תיאול פעילים לעיין בספרי maleimide. עם זאת, הסדר של תוספת והרכב הוא המפתח עלייה מוצלחת בתשואה כמו TCEP יהיה גם להגיב עם maleimide. על ידי הוספת maleimide לאחר TCEP, את TCEP יהיה נצרך על ידי הפחתת החלבון הראשונה. חצי מקביל של TCEP לחלבון משמש מאותה הסיבה, כך העודף TCEP אינו זמין להגיב לרעה עם maleimide בחינם. גשרים דיסולפיד מבניים על הפנים של החלבון אינם צפויים להיות מושפע על ידי התוספת של TCEPאו סוכני הפחתת אחרים כגון DTT, ובלבד החלבון שאינו מוחזק בתנאי denaturing כגון טמפרטורה גבוהה או ריכוז גבוה של אוריאה. לדוגמה, תוספת של עודף גדול של DTT כדי CYT ג לפני FPLC טיהור אין השפעה משמעותית על כמות החלבון התאושש לאחר טיהור. אם הפחתת גשרים ציסטאין מבניים ידי TCEP חשוד, זה יכול להיות מאושר על ידי מפעיל ג'ל חלבון בתנאים מקומיים, שאינו denaturing.

Ru (II) ציטוכרום C שכותרתו bisterpyridine מסונתז שיטה זו היא מטוהרים באמצעות Ni ^{2 +} משותקת מתכת זיקה כרומטוגרפיה ^14. שיטות טיהור אחרות קיימות, כגון כרומטוגרפיה הדרה גודל, אניון / כרומטוגרפיה קטיוני, ו כרומטוגרפיה זיקה ספציפית כגון שלב נייח נוגדן. באופן כללי, השיטה נשארת זהה כפי שתואר לעיל, עם צעדי ריכוז ודיאליזת followinטיהור chromatographic גרם להחזיר את מוצר bioconjugate כדי חיץ מתאים לאחסון.

השיטה העיקרית של קביעה אם bioconjugation הוא מוצלח היא באמצעות MALDI-TOF MS. זוהי הדרך המדויקת ביותר כדי לברר את ההבדל הקטן המוני בין חלבון יליד חלבון הנקרא קוולנטית עם מולקולה קטנה, הבדל בדרך כלל פחות מ -1,000 Da. החלק הקשה ביותר של ניהול ניסוי MALDI-TOF MS הוא בחירת מטריקס ואיתור טכניקה; עם זאת חומצת caffeic כבר מצאה להיות מטריצת מטרה אמינה, כללית לניתוח של החלבונים bioconjugates המשמשים בעבודה זו. כחלופה פוטנציאל, חומצה sinapinic הוא נפוץ אחר מטריקס MALDI המשמשת לניתוח של חלבונים. ניתוח של נתוני MALDI-TOF MS הוא פשוט יחסית. תרשים 2 מציג את ספקטרום MALDI-TOF MS המאפיין את שני ג CYT הטהור iso-1 (M _w = 12,706 Da) ו Ru הטהור (II) -cyt ג ​​(Mw = 13,559 Da), אשר שניהם מקרוב מתאים המסה המולקולרית מחושבת. טוהר יכול להיות גם ציין, וציין את חוסר שיא ציטוכרום C iso-2 (M _w = 12,532 Da) בספקטרום unreacted וחוסר שיא ציטוכרום C iso-1 בספקטרום bioconjugate. המסה bioconjugate יכול גם להעריך באמצעות ג'ל אלקטרופורזה. איור 3, ג'ל חלבון 12% Bis-טריס, מספק שתי ראיות עבור bioconjugation. ראשית, בהעדר להקה דימר בתנאים שאינם הפחתה עבור Ru (II) -cyt ג ​​עולה כי כבר לא קיים ציסטאין חינם, ושנית, בתזוזה הקלה של להקת bioconjugate כלפי מעלה מתרגמת לעליית משקל מולקולרי. ג'ל חלבון הם לא יסולא בפז ואת סופי יכול לספק הוכחה של bioconjugation מוצלח לא רק עבור קבצים מצורפים מולקולה קטנה, אבל גם לסינתזה של הדימרים חלבון ⁵ או-פולימר חלבון bioconjugates ^9.

עבור חלבוניםchromophores המכיל כגון חלבון פלואורסצנטי ירוק או cytochromes המכילים heme, ספקטרוסקופיה UV-Vis משמש כדי לקבוע את ההרכב ואת התשואה של bioconjugate. 1: 1 בנוסף ליניארי של ספקטרה חומרי המוצא מאפשרת בנייה של ספקטרום UV-Vis היפותטי של bioconjugate, כפי שמוצג באיור 4 על ידי השוואת ספקטרום bioconjugate בפועל עד 1 זה:. ספקטרום בנוסף 1, הרכב יכול להיות מוסק . לדוגמא, אם שתיים או יותר Ru (II) (tpy) ₂ -maleimides צרף nonspecifically לחלבון, להקת 480 ננומטר של bioconjugate תהיה גבוהה יותר מאשר ספקטרום החזה. בנוסף, הריכוז של bioconjugate יכול להיות מקורב באמצעות 410 הערך הספיג טוחן ננומטר של 97.6 סנטימטר ^-1 מ"מ ^-1. זה ההנחה היא להיות זהה עבור bioconjugate משום Ru (II) (tpy) ₂ יש -maleimide ספיגת מינימלי באזור זה.

יצוין thabioconjugation t באמצעות כימיה ציסטאין-maleimide יש מספר מגבלות. ראשית, החלבון של עניין צריך להיות שאריות ציסטאין יחידה, נגישות, או הנדסת חלבון אחרת חייבת להתבצע להציג אחד. שנית, קשר ציסטאין-maleimide רגיש להחליף עם thiols חינם אחר, כגון אלבומין וגלוטתיון בהקשר של יישומי פלזמה ^19. משא ומתן כזה תלוי מאוד את הנגישות ממיס ולחייב מקומיים על פני השטח של החלבון. Maleimide-תיאול קשרים עשויים עדיין להיות מתאים ליישומים פלזמה, אבל יציבות לטווח ארוך צריך להיבדק באמצעות ספקטרומטריית מסה ג'ל אלקטרופורזה.

למרות זאת, מאוד ספציפי, מצורף מניבים הגבוהים של מולקולות רומן כגון צבעי ניאון, מרכזי חיזור, פולימרים, וחלבונים אחרים לחלבונים באמצעות כימית ציסטאין-maleimide היא טכניקה רבה עצמה המאפשרת מגוון של מבני macromolecular מעניינים להיותccessed. לאחר כמויות גדולות של חלבון bioconjugates המוגדר היטב מבחינה הכימית הוא מפתח במחקרים עתידיים המעורבים חלבון מחייב, הרכבה עצמית, קינטיקה אנזימטית ולוקליזציה חלבון. כפי שתואר לעיל, החל טיהור חומר, בחירה של מדיום תגובה, וכן תוספת של חומרים כימיים משלימים כגון צמצום סוכנים או פעיל שטח יש כל השפעה משמעותית על תשואות bioconjugation. טיהור מושגת בקלות על-ידי כרומטוגרפיה חלבון תואם, ואפיון מושגת באמצעות שילוב של MALDI-TOF MS, ג'ל אלקטרופורזה, ו- UV-Vis ספקטרוסקופיה.

The authors have nothing to disclose.

We thank the Australian Research Council (ARC) for ARC Future Fellowship (FT120100101) and ARC Centre of Excellence CE140100036) grants to P.T. and the Mark Wainwright Analytical Centre at UNSW for access to mass spectrometry and NMR facilities.