רב פוטון תאית נתרן הדמיה בשילוב עם משחרר רפרוף מיקוד בתיווך UV של גלוטמט בCA1 פירמידת נוירונים

אנו מתארים את השילוב של תמונה-הפעלה מושרה UV מוקד של תרכובות נוירו פעיל עם כל תא תיקון מהדק והדמיה רב פוטון של עוברי נתרן תאיים בדנדריטים ועמוד שדרה של תאי עצב בהיפוקמפוס בחתכי רקמה חריפים של מוח העכבר.

מיקרוסקופ פלואורסצנטי רב פוטון אפשר הניתוח של פרמטרים מורפולוגיים ופיסיולוגיים של תאים במוח ברקמות שלמות עם החלטת מרחב ובזמן גבוהה. בשילוב עם אלקטרופיזיולוגיה, זה נעשה שימוש נרחב ללמוד אותות סידן הקשורים לפעילות בתאי subcellular קטנים כגון דנדריטים וקוצים הדנדריטים. בנוסף לארעיים סידן, פעילות הסינפטית גם גורמת אותות נתרן postsynaptic, את המאפיינים שלו הם הבינו רק באופן שולי. כאן, אנו מתארים שיטה לתיקון מהדק בשילוב כל תא והדמיה נתרן רב פוטון בתחומים מיקרו סלולריים של נוירונים מרכזיים. יתר על כן, אנו מציגים הליך הותאם לאולטרה סגול (UV) משחררות רפרוף מושרה -light של גלוטמט, המאפשר הפעלה אמינה ומוקד של קולטני גלוטמט ברקמה. לשם כך, כל תא הקלטות בוצעו ביחידת משנה Cornu Ammonis 1 (CA1) נוירונים פירמידה בחתכי רקמה חריפים שלההיפוקמפוס עכבר. נוירונים היו מלאים בSBFI צבע פלואורסצנטי נתרן רגיש באמצעות התיקון-פיפטה, ועירור רב פוטונים של SBFI אפשר להדמיה של דנדריטים וקוצים סמוכים. להקים משחררות רפרוף מוקד מושרה UV, מספר פרמטרים ובכלל זה עוצמת אור, עוצמת קול מושפע מקורה משחררות רפרוף UV, מיצוב של הקרן, כמו גם ריכוז של המתחם בכלוב נבדקו ומותאמים. התוצאות שלנו מראות כי זלוף המקומי עם גלוטמט בכלוב (משרד התשתיות הלאומי-גלוטמט) ותוצאת UV-משחררות רפרוף המוקד שלה בזרמים פנימה וארעיים נתרן בדנדריטים ועמוד שדרה. כמובן זמן והמשרעת של שני זרמים פנימה ואותות נתרן לתאם עם משך דופק משחררות הרפרוף. יתר על כן, התוצאות שלנו מראות כי אותות נתרן תאיים חסומים בנוכחות חוסמי לionotropic קולטני גלוטמט, הוכחה כי הם מתווכים על ידי זרם נתרן למרות שמסלול זה. לסיכום, השיטה שלנו מספקת כלי אמין לחקירה של אותות נתרן תאיים הנגרמים על ידי הפעלת קולט מוקדי ברקמת המוח שלמה.

שיפורים שנעשה לאחרונה בטכניקות מיקרוסקופיות אור כגון מיקרוסקופיה רב הפוטון אפשרו המחקר של פרמטרים מורפולוגיים ופיסיולוגיים של תאים במוח ברקמות שלמות עם החלטת מרחב ובזמן גבוהה. בשילוב עם אלקטרופיזיולוגיה, טכניקות אלה נמצאים כעת בשימוש נרחב כדי לנתח אותות הקשורים לפעילות חשמליות בתאי עצב, כמו גם אותות סידן במקביל בתאי subcellular קטנים, כלומר בדנדריטים קנס וקוצים הדנדריטים. בנוסף לארעיים סידן, פעילות הסינפטית גם גורמת אותות נתרן בדנדריטים ועמוד שדרה, את המאפיינים שלו הם במידה רבה לא נחקרו. ניתן לנתח אותות אלה על ידי שני פוטונים הדמיה של נתרן תאיים ([Na ^+] _i) המאפשרת המדידה של [Na ^+] _אני ארעיים לתקופה ממושכת בלי הלבנת צבע משמעותית או צילום נזק ^1,2 on-line.

להדמיה של [Na ^+] _i , צבעי מחוון כימי רק כמה זמינים, למשל קורונה הירוקה לאסנטה נתרן הירוק ^3,4. הבדיקה הניאון הנפוצה ביותר עבור Na ⁺ הדמיה היא isophthalate benzofuran (SBFI) מחייב נתרן. זה ratiometric, צבע UV-נרגש דומה לפורע-2 צבע סידן רגיש הידוע וכבר מועסק הדמיה Na ⁺ קונבנציונלית בסוגי תאים רבים (לדוגמא ^5,6). ישנן אפשרויות שונות של מרגש הצבע ואיסוף הקרינה שלה. אם רזולוציה גבוהה זמנית (כלומר קצב פריימים גבוה הדמיה) נדרשת בשילוב עם מידע מרחבי, SBFI יכול להיות נרגש עם מנורת קשת קסנון או דיודה מכשיר בהספק גבוה פולטות אור (LED) ובפליטה שלה זוהתה עם תשלום במהירות גבוה מכשיר -coupled ^7,8 (CCD) מצלמה. לרזולוציה מרחבית מקסימלי עמוקה ברקמה, מיקרוסקופיה סריקת לייזר רב פוטון היא שיטת הבחירה ^9. Efficie הקוונטים הנמוך יחסיתncy של SBFI מחייב ריכוזים גבוהים יחסית צבע (0.5-2 מ"מ), וטעינה ישירה של צורת קרום בלתי חדיר של SBFI באמצעות חדה פיפטה microelectrode ¹⁰ או תיקון ^1.

באמצעות SBFI, עבודה קודמת שבוצעה בחתכי רקמה חריפים של ההיפוקמפוס המכרסמים הראתה ארעיים נתרן הקשורים לפעילות בדנדריטים ועמוד שדרה של נוירונים הפירמידה CA1 שנגרמים בעיקר על ידי זרם של נתרן דרך ionotropic NMDA הקולטני ^1,2. לצורך המחקר של המאפיינים של אותות נתרן מקומיים כגון בפירוט רב יותר, הפעלה ספציפית של קולטנים postsynaptic על ידי יישום של אגוניסטים לקולטן היא שיטה גם מתאימה-בחירה. כדי לחקות פעילות presynaptic ושחרור משדר, יישום צריך להיות קצר יחסית וממוקד כדי לאפשר גירוי מקומי. זה, עם זאת, מוכיח להיות די מאתגר ברקמה שלמה. יישום לחץ מקומי של אגוניסטים לקולטן באמצעות פיפטה דקה שקצהו מאפשר ap מאוד מוקדיקפול, אבל מארח את הסיכון הפוטנציאלי להפקת תנועה של המבנה של עניין (למשל כמו דנדריט או קוצים הדנדריטים), ובכך מעכב את ההדמיה ברזולוציה גבוהה. התאמתו של iontophoresis של חומרי נוירו פעיל תלויה בתכונות חשמליות שלהם ואמפליטודות נוכחית גבוהה עלולה לייצר חפצים סלולריים, כמו גם.

אחת דרכים לעקוף מכשולים אלה היא התעסוקה של תרכובות המופעלת תמונה וphotolysis הבזק שלהם. בעיקרון, שני עקרונות שונים המשמשים לצילום הפעלה של חומרים בכלוב: I) רחב בתחום הבזק photolysis ¹¹ וII) משחררות רפרוף מוקד העסקת מודולים סריקה בשילוב עם לייזרים ^12. בעוד photolysis הבזק רחב בתחום משמש להפעלת אזורים גדולים יותר של עניין, למשל כל תא, משחררות רפרוף מוקד מועסק כדי לעורר באופן ספציפי תאים סלולריים קטנים. במחקר הנוכחי אנו מדגימים הליך לכל תא תיקון מהדק ורב-pההדמיה hoton נתרן בדנדריטים ועמוד שדרה של תאי עצב מרכזיים, בשילוב עם הליך הותאם למשחררות רפרוף מושרה UV-האור של גלוטמט, המאפשר הפעלה אמינה ומוקד של קולטני גלוטמט ברקמה.

מחקר זה בוצע בהתאם קפדן עם ההנחיות מוסדיות של היינריך היה אוניברסיטת דיסלדורף, גרמניה, כמו גם את הקהילה האירופית הנחיית המועצה (86/609 / EEC). כל הניסויים שנמסרו ולאושרו על ידי משרד צער בעלי החיים במתקן הטיפול בבעלי חיים ושימוש בהיינריך היה אוניברסיטת דיסלדורף, גרמניה (מספר מעשה מוסדי: O52 / 05). בהתאם לגרמני צער בעלי חיים החוק (Tierschutzgesetz, סעיפים 4 ו -7), אין אישור נוסף רשמי להסרת הנתיחה שלאחר המוות של רקמת המוח היה צורך.

עבור דור של פרוסות חריפות, עכברים מורדמים עם CO ₂ ובמהירות ערופה (בהמשך להמלצתה של הנציבות האירופיות שפורסמו ב: המתת חסד של חיות ניסוי, לוקסמבורג: משרד לפרסומים רשמיים של הקהילה האירופית, 1997; ISBN 92-827-9694 -9).

.1 הכנתפתרונות

1. הכן נוזל המוח והשדרה מלאכותי (ACSF) לנתיחה המכילה (במ"מ): 125 NaCl, KCl 2.5, 0.5 CaCl _2, 6 MgCl _2, 1.25 לאא ₂ PO _4, 26 NaHCO _3, ו20 גלוקוז, מבעבע עם 95% O ₂ ו 5% CO _2, וכתוצאה מכך pH של 7.4.
2. הכן ACSF לניסויים המכילים (במ"מ): 125 NaCl, KCl 2.5, 2 CaCl _2, 1 MgCl _2, 1.25 לאא ₂ PO _4, 26 NaHCO _3, ו20 גלוקוז, מבעבע עם 95% O ₂ וCO2 5%, וכתוצאה מכך בpH של 7.4.
3. הכן פתרון תאיים (ICS) המכיל (במ"מ): 150 KMeSO _3, 12.5 חומצת sulfonic אתאן piperazine אתיל הידרוקסי (HEPES), 40 KCl, 5 NaCl, חומצת tetraacetic גליקול 1.25 אתילן (EGTA), 5 Mg-ATP, 0.5 NA- GTP. כדי להתאים את pH 7.3. aliquots חנות של 1 מ"ל ב -20 מעלות צלזיוס.
4. לדלל -salt isophthalate benzofuran מחייב נתרן (SBFI) במים מזוקקים כפולים ולהכין aliquots של 5 μlשל פתרון מניות 10 מ"מ.
5. ICS הפשרה ולהוסיף פתרון מניות SBFI בריכוז סופי של 1 מ"מ. וורטקס ומיקרו תסנין (0.22 מיקרומטר). לשמור על 4 מעלות צלזיוס עד השתמש בניסוי. אל תקפיא ולהשתמש רק ליום אחד.
6. הכן פתרון מניות גלוטמט משרד תשתיות הלאומי של 50 מ"מ על ידי המסת התרכובת במים מזוקק כפולים. לדלל פתרון מניות גלוטמט משרד תשתיות לאומית לריכוז סופי של 5 מ"מ בACSF הנורמלי. לשמור על 4 מעלות צלזיוס עד השתמש בניסוי. אל תקפיא ולהשתמש רק ליום אחד. aliquots חנות, שאינם באופן מיידי בשימוש בניסוי, ב -20 מעלות צלזיוס.

.2 Dissection של רקמות

הערה: הכנת פרוסות בהיפוקמפוס החריפה של המוח המכרסם תוארה בפירוט קודם לכן ^13,14. בקיצור, בפרוטוקול הבא הועסק במחקר הנוכחי.

1. לאחר עריפת הראש, במהירות להסיר את המוח מהגולגולת.
2. מייד למקם את המוח בצלחת פטרי עם ACSF נתיחה קר כקרח ולנתח חצי כדור על ידי ביצוע חתך sagittal לאורך קו האמצע.
3. לבצע קיצוץ שני בכיוון הרצוי כמשטח חסימה ולחבר את זה לשלב הגזירה של vibratome עם דבק מגע.
4. קחו חיתוך קאמרי וקירור אלמנט (שניהם המשיכו ב -20 ° C) של vibratome מתוך שלב גזירת ההקפאה ובמקום עם סעיף מוח בתא. ואז לשים את אלמנט קירור בתא ולצלול רקמה בACSF נתיחה קרה כקרח. כדי לייצב את ההכנה, אחד ייתכן שירצה להתמודד גוש הרקמה עם ג'ל אגר.
5. חותך 250 מיקרומטר פרוסות עבות, parasagittal של ההיפוקמפוס עם vibratome. ודא שכל נוזלי ACS הם מבעבעים בכל העת.
6. לאחר חיתוך, לשמור על רקמות על רשת בכוס עם ACSF הנורמלי ולדגור על 34 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות. לאחר מכן לשמור בטמפרטורת חדר.

.3 הכנת החומרה

בתוך עמודים = "תמיד">
איור 1 תכנית מראה נתיבי אור ושליטה ניסיונית של המתקן בהיקף של הדמיה רב פוטון, photolysis הבזק UV לייזר לסריקת, ואלקטרופיזיולוגיה. רב פוטון הקרן (אדום) מופקת על ידי לייזר פעם, מתכונן אינפרא אדום (IR) (כי תשא). הוא עובר תריס מכאני, תא 'Pockels, וגלאי אינפרא אדום (זיהוי של עוצמת קרן), אשר כולם מאפשר שליטה של ​​כוח הלייזר ומשך הממשל שלה. / דיודת הלייזר להעיף בלהעיף החוצה האופציונלית מועסקת ליישור בסיסי של קרן הלייזר. ההרחבה הקרן יכולה לשמש בשילוב עם מטרות עם מטוס מאוד רחב גב מוקדי. גלגל מסנן ND בשליטה מרחוק ניתן להשתמש בנוסף או במקום התא 'Pockels לשלוט כוח קרן לייזר. אחרי שעברתי את ראש הסריקה, IR-האור פעמו מונחה לדגימה. לפלוטאור טד הקרינה (אור ירוק) נאסף גם על ידי חיצוני או הגלאים מכפיל הפנימיים (PMTs). הגלאים החיצוניים מסונכרנים באופן מלא עם PMTs הפנימי באמצעות מתג בתדירות גבוהה (בקר PMT). קרן משחררות הרפרוף (תכלת) מופקת על ידי לייזר UV מצב מוצק (DPSS UV-לייזר). הוא לאחר מכן הופנה ליחידת הסריקה מונע galvo בראש עצמי של הקבל עלית הקרינה על ידי מדריך אור. המיקום המדויק (הסטייה כרומטית בין הדמיה וקרן משחררות רפרוף) של נקודת משחררות הרפרוף או האזור מופעל על ידי יצוא התמונה מהתוכנה ההדמיה. ניהול התזמון לסנכרון ההדמיה, אלקטרופיזיולוגיה, וphotolysis הבזק נשלט באופן אלקטרוני. הגלאי השקוף (TL-PMT) הוא של צורך בתיעוד של המיקום של טפטפות בתוך הרקמה. יחידות הבקרה ותוכנה של מערכת ההדמיה, אשר שונתה, משמשת לשליטה ולסנכרן את כל מכשירים האחריםדרוש כדי להפעיל את המערכת. רכיבי מערכת שכותרתו "מותאמים אישית" תוכננו ולבנות / להתאים על ידי המחברים. רכיבים מסוימים הותאמו כדי לענות על הדרישות של המערכת מרובה הפוטון המותאם אישית לבנות ומתויגים כ" שונה ". אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

1. לעבור על רכיבים של המערכת מרובה הפוטון. לבדוק ולהתאים את יישור קרן לייזר אינפרא אדום.
   1. מיצוב אלומת שליטה על ידי מרפרף בפריזמה המרכוז במקום אובייקטיבי. אם הקרן הוסטה ממקומה, מחדש להתאים אותו על ידי המראות בפריסקופ. שימו לב שמטוס המרכוז של פריזמה חייב להיות באותה הרמה כמו מישור המוקד האחורי של המטרה תוך הדמיה.
   2. הפעל את ספקטרומטר ולבדוק מאפיינים רב פוטון של הקורה.
   3. להגדיר את הפרמטרים של תוכנת ההדמיה לערכים הבאים: בחרגודל מסגרת של 512 x 512 פיקסלים עבור תמונות סקירה של התא (תיבות קליפ קטנות עם גורם הזום של 2.5 לשיעור גבוה מסגרת ורזולוציה מרחבית גבוהה, בהתאמה). מהירות הדמיה הגדר מצב מהיר ומצב סריקה לXYT. Z-דריכה צריכה להיות 1 מיקרומטר לערימות סקירה ו0.2 מיקרומטר לערימות מפורטות כדי להתאים לדרישות דגימה המרחבית לdeconvolution בוצע מאוחר יותר.
2. התאם קרן לייזר רב עצמת פוטון (790 ננומטר) על ידי שינוי הגדרות של התא 'Pockels (כוח סופי תחת המטרה: 14 ≈ - 16 μW) וצילום המכפילים (PMTs).
3. הפעל ולכייל את מערכת משחררות רפרוף על ידי הצבת שקופית מדגם ניאון מתחת לעדשה האובייקטיבית.
   1. באמצעות המשקפת, לשנות את הפוקוס של אופטיקה UV ומרחבית להגביל את נקודת לייזר UV לגודל של 2 מיקרומטר בקוטר במקסימום על ידי השימוש ביחידה מתמקדת בראש סריקת UGA.
   2. התחל את שגרת הכיול של softwar שליטת יחידת משחררות הרפרוףדואר.
      1. הגדר את לייזר UV לכמה נקודות בטווח הסריקה שלו, ואילו הקרינה שנתפסה עם מצלמת CCD. על ידי לחיצה על נקודת לייזר UV בכל נקודה, להתאים את המיקום של מראות סריקת גלווני למתאימות למסוים לתאם בתוכנה.

איור 2 תכנית מפורטת הממחישה את המאפיינים של עירור, פליטה ושבילי קרן משחררות רפרוף. קרן עירור IR (אדום) עוברת את הקרן משלבת מראה dichroic ברמה לצריח המגיש בקבל עלית הקרינה של מיקרוסקופ והאובייקטיבי ל להגיע לדגימה. קרן משחררות הרפרוף (הכחולה) מועברת באמצעות סיבי אור האופטי קוורץ לcollimation והקרן מתמקדת יחידה ולאחר מכן הנחתה בהמשך למיל הסריקהrrors ביחידת הסריקה, עובר מראה dichroic למראה dichroic קורה שילוב. כאן זה בשילוב עם קרן סריקת עירור. האור הנפלט מהדגימה עוקב אחר נתיב נתיב קרן סריקת עירור בכיוון ההפוך לכיוון ראש סריקת הדמיה. המצלמה משמשת לבקרה חזותית של פיפטה התיקון ולמיצוב של קורה משחררות הרפרוף בשילוב עם מיקרוסקופ סריקת לייזר confocal (לא מוצג). נתיב האור הירוק מייצג תאורת עלית הקרינה אופציונלית שעשויה להיות שימוש עם יישומים אחרים.

3. 2. 2. השתמש במערכת הבזק photolysis במצב הנקודה כדי לזכות ביישומי מוקד. ודא שהתאמת המוקד של קרן משחררות הרפרוף (הספק ממוצע מתחת למטרה: 0.55 mW) תוצאות בגודל נקודה של 1.5 מיקרומטר בקוטר (הרחבה XY) כפי שנחשפו בשקופית ניאון ממוקמת ברמה-z שקולה לזו של רקמהפרוסה (לא מוצג).
   3. המיקום מדויק של נקודת משחררות הרפרוף מושגת על ידי היבוא של דמותה של מערכת ההדמיה באמצעות חיבור לרשת בין מחשבי הדמיה uncaging- ו.
      1. השימוש בתוכנה זו חוטף מסך, ברציפות לקרוא את המסגרות של תוכנת ההדמיה (במקום להאכיל המצלמה) ולהתאים את מסגרות הדמיה ומשחררות רפרוף congruently. לייצא כל מסגרת ^-10 מהתוכנה ההדמיה כתמונת התייחסות ליחידת הפלאש כדי להבטיח התאמה נאותה במהלך הניסוי כולו.

איור 3 התאמה של מקום משחררות הרפרוף: בדיוק כדי למקם את נקודת משחררות הרפרוף, צילום מסך של תוכנת ההדמיה (מסגרת צהובה) מיובא לתוך תוכנת משחררות הרפרוף (מסגרת ירוקה).תמונה השמאלית בתוך המסגרת הצהובה מייצגת תמונת Hi-Lo מקודד (כחול: פיקסלים רוויים: פיקסלים שחורים, אדום) של תא הפירמידה CA1 כולו. התמונה מעולף על ידי רשת הכיול של תוכנת משחררות הרפרוף (ים ירוק "X"). מימין, חלק מוגדל של התא מוצג עם הנקודה המעולפת משחררות הרפרוף (צלב אדום). הנקודה הצהובה היא התמונה מעולף באופן אוטומטי של קורה משחררות הרפרוף. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

4. הפעל micromanipulators, רכיבי אלקטרופיזיולוגיה, ומכשיר יישום לחץ למסירה של המתחם בכלוב לאזור היעד.
5. התקנת התקן יישום לחץ מוקד לזלוף המקומי של תרכובות כלוב. זה יקטין את עלויות עצומות בהשוואה לזלוף אמבטיה של חומרים אלה. התאם את הלחץ מחזיק ללחץ אטמוספרי ניתנו כדי למנוע גרירה של ACSF לאו דליפה של חומרים בכלוב מפיפטה היישום.
   הערה: מכשיר יישום לחץ מארח מיקרו שסתום מדויק וultrafast מאוד בבעל פיפטה. זה מאפשר להעסיק לחצי יישום מינימאליים ולכן מקטין חפצי תנועה למינימום במהלך זלוף המקומי עם מתחם הכלוב.
6. משוך טפטפות לכל תא תיקון מהדק וזלוף המקומי באמצעות נימי זכוכית בורוסיליקט אש מלוטשת. טפטפות צריכה להיות בקוטר קצה ~ 1 מיקרומטר והתנגדות של R ≈ 3 MΩ (ערכים שנקבעו עם K-טווינה ₃ מבוסס ICS).
7. פרוסת מקום באמבטיה הניסיונית ולהדביק אותו ברשת (מסגרת פלטינה 250 מיקרומטר עבה, והקיפה עם חוטים כירורגית, od 40 מיקרומטר) (איור 4 א ', ב'). השתמש הפוך, (יניקת כדור בצד של הקצה השבור) שבור קצה, ופיפטה פסטר אש המלוטשת להעברת הפרוסה. הימנע מכיפוף וכל טיפול קשה אחר של הפרוסה.

איור 4 רכיבים של האמבטיה הניסיונית ומיצוב של האמבטיה בבמת מיקרוסקופ. () האמבטיה הניסיונית מורכבת של חדר האמבטיה עצמו (ריבוע כחול), אשר מוקף בטבעת מתכת מגנטית. צינורות מבטיחים זלוף הרציף של האמבטיה עם מי מלח (ACSF). הרשת להחזיק את ולתקן את הפרוסה מוכנס לתוך תא האמבטיה. הכנה (ב) חריפה פרוסה ממוקמת בתוך חדר האמבטיה. הפרוסה נקבעה על ידי האשכולות של הרשת. מיקום (C) ואת הגיאומטריה של האמבטיה הניסיונית בשלב מיקרוסקופ במהלך הניסויים.

8. הנח אמבטיה בשלב מיקרוסקופ וקבע תנקב פרוסה עם ACSF.

.4 שלמות תא התיקון-clamping

1. פיפטה תיקון עומס עם ICS מכיל SBFI ולטעון פיפטה זלוף המקומית עם מתחם כלוב. צרף טפטפות לmicromanipulators המקבילה. מניחים אלקטרודה השוואתית באמבטיה. ודא שאתה מקורקע באופן קבוע, כדי למנוע נזק לבמה הראש (cf איור 4C).
2. הורד את שני טפטפות לאמבטיה ומניח אותם מעל אזור CA1 בהיפוקמפוס. להפעיל לחץ עדין פיפטה תיקון (+40 mbar), כדי למנוע דילול של ICS עם ACSF.
3. לפצות את פוטנציאל הקיזוז של פיפטה את התיקון באמצעות תוכנת אלקטרופיזיולוגיה.
4. להתקרב תא פירמידה CA1 עם פיפטה תיקון העסקת מיקרוסקופיה וידאו IR-DIC. החל שאיבה עדינה עד Giga-חותם מתקבל. בחר תא סומה אשר ממוקמת 30 -70 מיקרומטר מתחת לפני השטח של הפרוסה כדי להבטיח מורפולוגיה של תאים שלמים על יד הצד אחד ופיזור נמוך והנחתה של קרן משחררות הרפרוף בצד האחר.
5. לפצות על יכולת מהירה. membran הפסקהדואר ותא פתוח כדי לקבל תצורה כל התא.
6. לפצות על יכולת איטית והתנגדות סדרה.
7. מאפשר לתא להיות דיאליזה עם SBFI-ICS לפחות 30 דקות לפני תחילת ניסויי ההדמיה.

הדמיה .5 Multi-פוטון וגירוי

איור 5 פרוטוקול ניסויי. כדי לאתחל ניסוי, דופק הדק (מסומן בסימן אדום (ᴨ) והקו האדום) מוגדר כדי להתחיל את ההדמיה (כחול), אלקטרופיזיולוגיה (הירוק), והממשל של הכלוב בו זמנית מתחם (צהוב) בשניות 0 נקודת הזמן. בתקופה ראשונה זו, קרן ההדמיה צריכה להיות מעומעמת לחלוטין (אור כחול). לאחר 4.5 שניות (קו מקווקו), זלוף המקומי של המתחם בכלוב הוא הופסק וקרן ההדמיה צריכה להיות מוגדרת wor שלהעוצמת מלך לרכישת נתונים (כחול). 1.5 שניות לאחר מכן (זמן נקודה 6 שניות), דופק הדק שני הוא נתון (מסומן בסימן אדום (ᴨ) והקו האדום), שמאתחל את יחידת פלאש UV (משך ההבזק: 300 אלפיות השנייה; שצוין על ידי הבזק הצהוב ) וקובע סמנים באלקטרופיזיולוגיה ופרוטוקול ההדמיה.

1. הוספת tetrodotoxin (TTX, 500 ננומטר) לACSF כדי למנוע הפעלה של תעלות נתרן מתח מגודרת ודור של פוטנציאל פעולה.
2. דמיין מורפולוגיה תאית באמצעות עירור רב פוטון וכתוצאה מכך הקרינה SBFI ולבחור דנדריט קוצני לניסוי. הגדלה עבור תמונות ברזולוציה גבוהה יותר ולמקם את תיבת קליפ סביב דנדריט.
3. מלא פיפטה תיקון סטנדרטית עם ACSF 10 μl המכיל גלוטמט בכלוב. חבר את פיפטה ליישום המערכת בלחץ ולצרף אותו לmicromanipulator.
4. הנח פיפטה עם מתחם בכלוב ליד דנדריט (~ 30 מיקרומטר). מקם את פיפטה כדי לאפשרזלוף המקומי יעיל של דנדריט של בחירה. התאם את לייזר משחררות הרפרוף: מקם את נקודת משחררות הרפרוף קרוב (~ 1 - מיקרומטר 2) למבנה של עניין.
5. אזורי סט של ריבית על דנדריט נבחר וקוצים סמוכים באמצעות תוכנת הדמיה.
6. מתקרב לאזור של העניין וfocally להזריק המתחם בכלוב במשך כמה שניות עם לחץ נמוך (<3 PSI). התחל מהדק תיקון והקלטות הקרינה (ב790 עירור רב פוטונים ננומטר) באמצעות אות הדק.
   הערה: במהלך זלוף המקומי של מתחם הכלוב, קרן העירור מעומעמת לחלוטין כדי למנוע הלבנה.
7. להפסיק זלוף המקומי של המתחם בכלוב. להגדיל את עוצמת לייזר שני פוטונים כדי לאפשר עירור יעיל של SBFI ולהחיל הבזק UV לאתחל (משך 300 msec משחררות רפרוף) משחררות רפרוף.
8. לעקוב אחר שינויים בקרינת SBFI. לעצור את ההקלטה לאחר הקרינה SBFI התאוששה חזרה לנקודת התחלה.

.6 פרמקולוגיה

1. כדי לבדוק את מעורבותם של קולטני גלוטמט ionotropic בדור של הזרמים ו / או אותות נתרן עורר על ידי photolysis הבזק UV של גלוטמט בכלוב, להעסיק חוסמי הקולטן.
   1. לעבור לACSF המכיל Cyano-nitroquinoxaline-דיונת חוסם AMPA-רצפטור (CNQX, 10 מיקרומטר) ואמין phosphonopentanoate חוסם NMDA קולטן (APV, 50 מיקרומטר) בנוסף לTTX (ראה לעיל) ותנקב הפרוסה לפחות 10 דקות.
   2. הליך גירוי חוזר (ראה 5.4 ו5.5.)
2. הפיכות של האפקטים 'מעכבי
   1. לחזור לACSF הרגיל המכיל TTX בלבד.
   2. Perfuse הפרוסה עבור 20 דקות.
   3. הליך גירוי חוזר (ראה 5.4 ו5.5.).

.7 מורפולוגיה

1. להקליט XYZ-ערימה של סט קופסא אזור קליפ למדידות שבוצעו. ודא שערימה זו היא oversampled מרחבית (לפחות 0.2 מיקרומטר לפיקסל) כדי לאפשר deconvolution תמונה האופטימלי ולהגדיל את איכות תמונה ורזולוציה.
2. להקליט XYZ-ערימה של כל התא כדי להעריך מורפולוגיה של תאים.
3. אלגוריתם deconvolution לרוץ.

במחקר הנוכחי, אנחנו מדגימים הליך למיקרוסקופיה רב פוטון של דינמיקת נתרן סלולרית עם SBFI צבע פלואורסצנטי נתרן תלוי בנוירונים הפירמידה CA1 של פרוסות רקמה בהיפוקמפוס עכבר חריף. יתר על כן, אנו מראים כיצד לשלב טכניקת הדמיה זו עם משחררות רפרוף מבוססות לייזר לסריקת של תרכובות נוירו פעיל (לדוגמא גלוטמט בכלוב) ו מדויק מיקוד למייקרו תחומים סלולריים.

נוירונים טעינה עם SBFI באמצעות התיקון-פיפטה אפשרו להדמיה של כל התא כולל דנדריטים קנס וקוצים סמוכים על ידי העסקת עירור רב פוטונים (איור 6 א ', ב', ד 'ואיור 7 א).

איור 6 אותות נתרן וזרמים סינפטיים הנגרמים על ידי הבזק photolysis של גלוטמט בכלוב. () מקסיםתמונת הקרנת אל של נוירון פירמידלי CA1 עמוס SBFI באמצעות פיפטה התיקון (PP). התיבה מציינת את האזור המוצג בהגדלת B. LP מציין את המיקום וכיוון של פיפטה לזלוף המקומי של גלוטמט בכלוב. הקרנת המרבית הספק גבוה של ערימה של חלקים אופטיים של דנדריט עם קוצים הדנדריטים סמוכים (B). הערימות של חלקים אופטיים עברו z-יישור וdeconvolution. הצלב האדום מציין את אזור היעד של קרן משחררות הרפרוף. הקו המקווקו הכתום משרטט את האזור של עניין שממנו פליטת הקרינה נרשמה. התיבה מציינת את האזור המוצג בהגדלת ד (ג) משמאל: אות נתרן (בשורה העליונה) וסומטי פנימה (בשורה תחתונה) נוכחית הנגרם על ידי הבזק photolysis של גלוטמט בכלוב (שצוין על ידי הבזק צהוב). הקו האדום מייצג את נתוני הניסוי בכושר. האזור האפור מייצג את התקופה שבה הבזק משחררות הרפרוף (300אלפיות שני) חסומים ההדמיה של הקרינה SBFI ימנית:. ללא מראש זלוף עם גלוטמט בכלוב, אותו UV-הבזק לא עוררו שינוי בפליטת SBFI, ולא זרם פנימה (ד ') משמאל:. כוח תמונה גבוהה של דנדריט וסמוך קוצים כפי שמסומן בB. צד, את אותה תמונה עם ערכים אפורים הפוכים. קווים מקווקווים מציינים את האזורים של עניין שבו פליטת הקרינה נרשמה. הצלב האדום מציין את הלוקליזציה של קרן משחררות הרפרוף ימני:. ארעיים נתרן הנגרם על ידי UV-flash photolysis של גלוטמט בכלוב. עקבות כחולה: אותות נתרן בדנדריט; עקבות אדומות: ממוצע תגובה משלושה קוצים סמוכים למקום משחררות הרפרוף; עקבות ירוקות: ממוצע תגובה משלושה קוצים רחוקים. אנא לחץ כאן לגרסה גדולה יותר של דמות זו.

לאחר זלוף המקומי עם כלובגלוטמט, החלת UV-הבזק קרוב לדנדריט הביאה לירידה זמנית בפליטת הקרינה של SBFI, המשקפת עלייה בריכוז הנתרן התוך התאי (איור 6 ג, ד ואיור 7). במקביל, זרם פנימה נרשם בסומה (איור 6C ואיור 7). הגדלת משך הזמן של פלאש UV הביאה הגדלת אמפליטודות של שני עוררו פנימה זרמים ואותות נתרן (מידע לא מוצג), מצביעה על כך שהמערכת הייתה גם בטווח הדינמי שלה וכי תגובות לא משחררות רפרוף ולא סלולריות היו רוויות. יישום של UV-flash של משך זהה או יותר לפרוסות אשר לא היה מראש perfused עם גלוטמט בכלוב, מעולם לא עורר שינויים בקרינת SBFI ולא זרמים פנימה, מצביע על כך שהאותות הללו הם תוצאה של משחררות הרפרוף של גלוטמט (איור 6 ג). יתר על כן, תוצאות אלו מראות כי אין תלות הדדית של מרכיבי imaging- ומשחררות רפרוף הוא ציינה under תנאי הניסוי שלנו. אותות נתרן גם ניתן היו לזהות בקוצים הדנדריטים (איור 6 ד). למרות שאנו לא ננסה להשיג גירוי של עמוד השדרה אחת בלבד עם משחררות רפרוף גלוטמט, אמפליטודות שיא נטו להיות מעט גבוה יותר בעמוד שדרה קרובה למקום משחררות הרפרוף, ואילו עמוד השדרה רחוקה הראתה כמעט זהים הקרינה שינויים כדנדריט ההורה (איור 6 ד).

לבסוף, למדנו המסלול לזרם נתרן לתוך דנדריטים וקוצים בתגובה למשחררות רפרוף של גלוטמט. לשם כך, אנו מועסקים CNQX וAPV, אשר הם חוסמי בררניים לקולטניים גלוטמט נתרן חדיר, ionotropic של AMPA- וNMDA-תת סוג, בהתאמה. התוצאות שלנו מראות כי אותות נתרן תאיים הנגרם על ידי גלוטמט והזרמים סומטיים שהושרו הושמטו בנוכחות של חוסמי אלה (איור 7). על כביסה מהחוסמים, האותות חזרו. זה מדגים thaמשחררות רפרוף t של גלוטמט מפעיל קולטני גלוטמט ionotropic על נוירונים הפירמידה CA1, אשר מתווכים הזרם של נתרן לדנדריטים ועמוד שדרה, וכתוצאה מכך ארעיים נתרן תאיים וזרמים פנימה.

איור 7 פרופיל תרופתי של אותות נתרן עוררו וזרמים פנימה. נוירון פירמידלי CA1 מלא SBFI עם פיפטה התיקון (PP) (א) מצורף לסומה (ב ') משמאל:. חולף נתרן ונוכחי סומטי הנגרם על ידי צילום הפעלה של גלוטמט בכלוב בדנדריט וקוצים מצורפים מרכז:. זלוף עם חוסמי הקולטן לגלוטמט ionotropic CNQX וAPV מעכבים שתי אות נתרן והזרם פנימה הנגרם על ידי משחרר רפרוף ימני:. עם כביסה מהחוסמים, האותות משוחזרים. Represen הקו האדוםts של נתונים הניסיוניים בכושר. האזור האפור מייצג את התקופה שבה הבזק משחררות הרפרוף (300 אלפיות השנייה) חסום ההדמיה של הקרינה SBFI. אנא לחץ כאן לגרסה גדולה יותר של דמות זו.

המחקר הנוכחי מראה כי SBFI הוא גם מתאים לשני פוטונים הדמיה של עוברי נתרן תאיים בתאים סלולריים קטנים. יש לה להיות כל הזמן לזכור, עם זאת, כי היעילות הקוונטית של SBFI היא נמוכים למדי ¹⁵ ויחסי שינויים בריכוז הנתרן הם די קטנים עם פעילות פיזיולוגית. לפיכך, מדידה ברזולוציה גבוהה של עוברי Na ⁺ בתהליכי קנס היא משימה יחסית משעממת, וbinning או מיצוע של מספר ניסויים שתידרש כדי להשיג אותות משביעות רצון. בנוסף, קינטיקה של עוברי נתרן היא איטית באופן מפתיע, מה שהופך את החובה להקליט לתקופות זמן ממושכות. תצפית זו מקבילה לאלה במחקרים קודמים, שבו ריקבון monoexponential של עוברי נתרן בדנדריטים עצביים ובהאסטרוציטים התאפיינו בקבועי זמן דעיכה גדולים בטווח של 10 שניות בטמפרטורת חדר ^1,2,6. נראה ארעיים נתרן ובכך להפעיל שיתוף זמן הרבה יותר איטיurse וקבועי זמן דעיכה הרבה יותר גדולים בהשוואה לארעית סידן ^16.

מניח בצד חסרונות אלה, הדמיה נתרן מוכיחה להיות כלי רב ערך לחקירת תכונות פיסיולוגיות של תחומי משנה עצביים. לדוגמא, הדמיה נתרן יכולה לשמש כדי לעקוב אחר פעילות הסינפטית מעוררת באו בסמוך לסינפסות פעילה. בגלל נתרן הוא בעצם לא נאגר ^8,17, ארעיים נתרן מושרה פעילותם באופן ליניארי הקשורים למגוון רחב של שחרור גלוטמט הסינפטי או אקסוגני מיושם גלוטמט. הם מכאן מייצגים אינדיקטורים ישירים ובלתי משוחד של פעילות glutamatergic עצבית. יתר על כן, צבעי מחוון נתרן תערוכה של _ד K הגבוה _(ד K של SBFI הוא בטווח של 25 ¹ מ"מ). אפילו בריכוזי הצבע תאיים גבוהים יחסית המשמשים להשגת בהירות מספקת (בדרך כלל 0.5-1 מ"מ), _ד הגבוה K של לרמוז כי הצבעים עצמם אינם פועלים כמאגרים ליםגנות. כתוצאה מכך, הם לא לעוות כמובן משרעת ולא זמן של עוברי נתרן, שהוא תמיד דאגה כאשר צבעי סידן רגיש הם הציגו לתוך התאים ^18. מכאן ניתן להניח כי האותות שאותרו מייצגים מידה טובה של השינויים "האמיתיים" בנתרן תאיים. כמובן הזמן האיטי שלהם ואז משתמע כי המהירות לדיפוזיה תאית לנתרן בתאי עצב היא הרבה יותר קטנה מאשר להניח ¹⁹ בעבר.

דרישה קריטית עבור הביצוע המוצלח של ניסויים העוסקים במאפיינים של מסלולי הולכה וזרם נתרן הסינפטי מעוררים לתוך עמוד השדרה ודנדריטים היא האינדוקציה של הפעלה מהירה ומקומית מאוד של מבני postsynaptic. ניתן להשיג זאת על ידי יישום מהיר והמקומי של אגוניסטים גלוטמט או מונוסודיום בסביבה הישירה של עמוד השדרה או דנדריט ידי photolysis הבזק של תרכובות כלוב. photolysis פלאש עושה dama לא מכאניge הרקמות, ללא תשלום של חפצי תנועה ומבוסס היטב לחקירה של שאלות קשורות (למשל איתות סידן מקומית). הקוטר של נקודת משחררות הרפרוף היה 1.5 מיקרומטר בxy-המטוס. קרוב משחרר רפרוף לאותות נתרן דנדריט הקוצני מושרה בשני הקוצים ודנדריט ההורה. ואילו האותות נטו להיות הגדול ביותר בעמוד השדרה הקרוב ביותר למקום משחררות הרפרוף, אמפליטודות בדנדריט ההורה וקוצים רחוקים היו עדיין די דומות לאלו בסביבה ישירה של נקודת משחררות הרפרוף. משחרר רפרוף בוצע עבור 300 אלפיות השניים שבמהלכה זרמים פנימה גדלו במשרעת. גלוטמט שברחה מכלוב ייתכן שמתפזר ברקמות במהלך אותה תקופת הזמן, הפעלה מרוחקת יותר ממקום משחררות הרפרוף ionotropic קולטני גלוטמט וזרם נתרן באזורים וקוצים הדנדריטים.

בעיה מהותית שמתרחשת בעת שימוש בליזר UV לphotolysis של תרכובות כלוב מנוהלות באמצעות פתרון ים התאהוא 'סינון פנימי ". בגלל קצב הספיגה הגבוה של הכלוב, אור UV מוחלש מאוד לאורך הדרך מהמטרה לאתר הגירוי ^20,21. דרך אפשרית על מנת להימנע ממצב זה היא זלוף המקומי עם הכלוב, כי היא מוגבלת רק לאתר הגירוי, אשר יתר על כן מקטין את הכמות של תרכובת בכלוב זקוקה למינימום. בהשוואה למשחררות רפרוף בתיווך לייזר סריקת UV, שני פוטונים כמעט אינפרא אדום ²² משחררות רפרוף הוא מרחבית מדויקת יותר, בעיקר בגלל הדיוק של הגירוי מוגבר בציר z. מצד השני, בשל החתך הקטן של כלובים נפוצים לאורכי גל ארוכים יותר כפי שהיא מתבצעת עם שני פוטונים עירור, או ריכוז גבוה של המתחם בכלוב או גבוה מאוד, יש צורך בעוצמות אור פוטנציאל phototoxic. כמו כן, משחררות רפרוף שני פוטונים מחייבים השקעה גבוהה בהרבה בציוד; בין השאר, לייזר נוסף IR בתוספת הרכיבים האופטיים הנדרשים, יש צורך.

SBFI ומשרד התשתיות הלאומי-גלוטמט שניהם להתרגש בטווח אורכי הגל הזהה. זה עלול להוביל לתלות הדדית לא מכוונת של לייזר UV משחררות רפרוף וSBFI או לייזר ההדמיה IR ומשרד התשתיות הלאומי, גלוטמט, וכתוצאה מכך הלבנת SBFI על ידי הבזק משחררות הרפרוף ו / או משחררות רפרוף רציפה של גלוטמט על ידי קרן IR. עם זאת, כפי שמוצג באיור 6 ג, לא פלאש UV על ידי עצמו ולא ההדמיה פוטון הרב נגרם שפעות גומלין כזה בתנאי הניסוי שלנו.

מערכות UV-פלאש דומים לזה שתואר כאן משמשות באופן שיגרתי בהרבה מעבדות אחרות ויכולות בקלות יחסית להיות משולבת בתוך כל מיקרוסקופ הדמיה רב פוטון הקיים. הוא מציע יתרון שקרן הלייזר לphotolysis ניתן למקם באופן חופשי בשדה הראייה. בנוסף, המערכת מאפשרת מיקום מחדש מהיר ואוטומטי של קרן הלייזר ואת שחרורו נפח, בהתאמה, בשדה הראייה במהלך ניסוי. Ouשינוי r מפשט ומשפר את המיקום מדויק של נקודת משחררות הרפרוף, כך שהמסגרות של תוכנת ההדמיה יכולות לשמש כדי להתאים מסגרות הדמיה ומשחררות רפרוף congruently.

יחדיו, כל תא תיקון מהדק והדמיה נתרן רב פוטון בדנדריטים ועמוד שדרה של תאי עצב מרכזיים, בשילוב עם הליך הותאם למשחררות רפרוף UV-induced אור של גלוטמט, מאפשר הפעלה אמינה ומוקד של קולטני גלוטמט ברקמה. וכך זה יכול לשמש כדי לנתח את המאפיינים של שידור סינפטי מעורר ושל אותות נתרן postsynaptic בתאי עצב ברקמה שלמה.

המחברים מצהירים שום אינטרסים מתחרים. המחברים קיבלו תמיכה כספית המאפשרת פרסום גישה פתוח על ידי ראפ אופטו (ודל, גרמניה), אשר מייצר מכשיר המשמש במאמר זה וידאו. החברה לא הייתה מעורבת בניסויים ולא בטיפול בנתונים ולא בכתיבת כתב היד.

מחקר זה נתמך על ידי מענק של הקרן הגרמנית למדע (DFG, Ro2327 / 6-1) לCRR המחברים מבקשים להודות ס Durry וג רודריגו לקבלת סיוע טכני מומחה, ומ 'Dübbert (אלקטרוניקה מעבדה, הזואולוגי מכון , האוניברסיטה של ​​קלן, גרמניה) לעזרה ביישום בקר תא Pockels ומתג HF.