Multi-fotón intracelular de sodio Imaging Combinado con Desembalado focal UV-mediada de glutamato en las neuronas CA1 Piramidal

Se describe la combinación de focal foto-activación inducida por UV de compuestos neuroactivos con células enteras patch-clamp y las imágenes de múltiples fotones de los transitorios de sodio intracelulares en dendritas y espinas de las neuronas del hipocampo en cortes de tejido agudas del cerebro de ratón.

Microscopía de fluorescencia Multi-fotón ha permitido el análisis de parámetros morfológicos y fisiológicos de las células del cerebro en el tejido intacto con alta resolución espacial y temporal. Combinado con la electrofisiología, se utiliza ampliamente para estudiar las señales de calcio relacionados con la actividad en pequeños compartimentos subcelulares tales como dendritas y espinas dendríticas. Además de los transitorios de calcio, la actividad sináptica también induce señales de sodio postsinápticos, las propiedades de los cuales son sólo marginalmente entendidos. Aquí se describe un método para su conjunto de células patch-clamp combinado y de imagen de sodio multi-fotón en celulares dominios micro de las neuronas centrales. Además, se introduce un procedimiento modificado para la ultra-violeta (UV) uncaging inducida -light de glutamato, que permite la activación fiable y focal de receptores de glutamato en el tejido. Para este fin, las grabaciones de células enteras se realizaron en Cornu Ammonis subdivisión 1 (CA1) neuronas piramidales en cortes de tejido agudos de lahipocampo del ratón. Las neuronas se llenaron con el colorante fluorescente SBFI sensible al sodio a través del parche pipeta, y multi-fotón de excitación de SBFI permitieron la visualización de las dendritas y espinas adyacentes. Para establecer uncaging focal inducida por UV, varios parámetros, incluyendo la intensidad de luz, volumen afectado por el haz uncaging UV, el posicionamiento de la viga así como la concentración del compuesto enjaulado fueron probados y optimizados. Nuestros resultados muestran que la perfusión local con glutamato enjaulado (MNI-glutamato) y su focal resultado-UV uncaging en corrientes hacia el interior y los transitorios de sodio en las dendritas y espinas. Transcurso de tiempo y la amplitud de las dos corrientes de entrada y las señales de sodio se correlacionan con la duración del impulso de uncaging. Además, nuestros resultados muestran que las señales intracelulares de sodio están bloqueados en presencia de bloqueadores para los receptores de glutamato ionotrópicos, lo que demuestra que están mediadas por la entrada de sodio, aunque esta vía. En resumen, nuestro método proporciona una herramienta fiable para lainvestigación de señales intracelulares de sodio inducida por la activación del receptor en el tejido cerebral focal intacto.

Las recientes mejoras en técnicas microscópicas, tales como la microscopía de luz multi-fotón han permitido el estudio de parámetros morfológicos y fisiológicos de las células del cerebro en el tejido intacto con alta resolución espacial y temporal. Combinado con la electrofisiología, estas técnicas son ampliamente utilizados para analizar las señales eléctricas relacionadas con la actividad de las neuronas, así como las señales de calcio concomitantes en pequeños compartimentos subcelulares, es decir, en finas dendritas y espinas dendríticas. Además de los transitorios de calcio, la actividad sináptica también induce señales de sodio en las dendritas y espinas, las propiedades de las que son en gran parte inexplorado. Tales señales pueden ser analizados mediante formación de imágenes de dos fotones de sodio intracelular ([Na ^+] _i), que permite la medición en línea de [Na ^+] _i transitorios por períodos prolongados sin blanqueo tinte significativa o foto-daño ^1,2.

Para imágenes de _i [Na ^+] , sólo unos pocos colorantes indicadores químicos están disponibles, por ejemplo, Corona Verde o Asante Natrium Verde ^3,4. La sonda fluorescente más comúnmente utilizado para obtener imágenes de Na ⁺ es isoftalato de benzofurano (SBFI) de unión de sodio. Es un radiométrica, colorante UV excitada similar a la conocida colorante sensible al calcio fura-2 y se ha empleado para formación de imágenes convencional Na ⁺ en muchos tipos de células (por ejemplo, ^5,6). Hay diferentes posibilidades de excitar el colorante y la recogida de su fluorescencia. Si se requiere alta resolución temporal (es decir, una velocidad de fotogramas de imagen de alta) en combinación con la información espacial, SBFI puede ser excitado con una lámpara de arco de xenón o un diodo (LED) dispositivo emisor de luz de alta potencia y su emisión detectada con una carga de alta velocidad dispositivo-junto (CCD) ^7,8 cámara. Para la resolución espacial máxima profundidad en el tejido, la microscopía de barrido láser multi-fotón es el método de elección ^9. El efficie cuántica relativamente bajancy de SBFI requiere concentraciones relativamente altas de tinte (0,5-2 mM), y la carga directa de la forma de membrana impermeable de SBFI a través de un microelectrodo agudo ¹⁰ o parche pipeta ^1.

Usando SBFI, trabajo anterior realizado en cortes de tejido agudos de hipocampo de roedores demostró transitorios sodio relacionados con la actividad en las dendritas y espinas de las neuronas piramidales CA1 que son causadas principalmente por el influjo de sodio a través de receptores ionotrópicos NMDA ^1,2. Para el estudio de las propiedades de dichas señales de sodio locales en más detalle, la activación específica de los receptores postsinápticos por aplicación de agonistas de los receptores es un método muy adecuado de elección. Para imitar la actividad presináptica y la liberación del transmisor, la aplicación debe ser relativamente breve y centrado para permitir la estimulación local. Esto, sin embargo, resulta ser bastante difícil en el tejido intacto. Aplicación de presión local de agonistas de los receptores utilizando una pipeta con punta fina permite ap muy focalplicatura, pero alberga el riesgo potencial para producir el movimiento de la estructura de interés (por ejemplo, como una dendrita o espinas dendríticas), y por lo tanto dificulta la proyección de imagen de alta resolución. La idoneidad de la iontoforesis de sustancias neuro-activo depende de sus propiedades eléctricas y las altas amplitudes de corriente puede producir artefactos celulares también.

Una forma de soslayar estos obstáculos es el empleo de compuestos foto-activado y su fotólisis flash. Básicamente, dos principios diferentes se utilizan para la foto-activación de sustancias enjaulados: I) de campo amplio de flash fotólisis ¹¹ y II) uncaging focal empleando módulos de análisis en combinación con el láser ^12. Si bien en todo el campo de flash fotólisis se utiliza para activar las regiones más grandes de interés, por ejemplo, una célula entera, se emplea uncaging focal para estimular específicamente pequeños compartimentos celulares. En el presente estudio se demuestra un procedimiento para de células enteras patch-clamp y multi-pformación de imágenes de sodio Hoton en las dendritas y espinas de las neuronas centrales, combinada con un procedimiento modificado para uncaging inducida por luz UV de glutamato, que permite la activación fiable y focal de receptores de glutamato en el tejido.

Este estudio se llevó a cabo en estricta conformidad con las directrices institucionales de la Universidad Heinrich Heine de Düsseldorf, Alemania, así como la Directiva de la Comunidad Europea del Consejo (86/609 / CEE). Todos los experimentos fueron comunicados y aprobados por la Oficina de Protección de los Animales en el Centro de Cuidado de Animales y el empleo de la Universidad Heinrich Heine de Düsseldorf, Alemania (número acto institucional: O52 / 05). De conformidad con la Ley de Bienestar Animal Alemán (Tierschutzgesetz, los artículos 4 y 7), sin aprobación adicional formal para la eliminación de tejido cerebral postmortem era necesario.

Para la generación de las rebanadas agudas, los ratones fueron anestesiados con _CO2 y rápidamente decapitado (siguiendo la recomendación de la Comisión Europea publicado en: La eutanasia de los animales de experimentación, Luxemburgo: Oficina de Publicaciones Oficiales de las Comunidades Europeas, 1997; ISBN 92-827-9694 -9).

1 Preparación deSoluciones

1. Preparar el fluido cerebroespinal artificial (ACSF) para la disección que contiene (en mM): 125 NaCl, 2,5 KCl, 0,5 CaCl _2, 6 _MgCl2, 1,25 NaH ₂ PO _4, 26 _NaHCO3, y 20 de la glucosa, con burbujas con un 95% de _O2 y 5% de CO _2, resultando en un pH de 7,4.
2. Preparar ACSF para experimentos que contienen (en mM): 125 NaCl, 2,5 KCl, CaCl 2 _2, 1 MgCl _2, 1,25 NaH ₂ PO _4, 26 _NaHCO3, y 20 de la glucosa, con burbujas con un 95% de _O2 y 5% de CO2, lo que resulta en un pH de 7,4.
3. Preparar la solución intracelular (ICS) que contiene (en mM): 150 KMeSO _3, 12,5 etano sulfónico hidroxi etil piperazina (HEPES), 40 KCl, 5 NaCl, ácido tetraacético de etileno glicol 1,25 (EGTA), 5 Mg-ATP, 0,5 Nacional GTP. Ajustar el pH a 7,3. Tienda alícuotas de 1 ml a -20 ° C.
4. Diluir (SBIF) -sal isoftalato benzofurano vinculante de sodio en agua doblemente destilada y preparar alícuotas de 5 lde una solución madre 10 mM.
5. ICS Descongelar y añadir solución madre SBFI a una concentración final de 1 mM. Vortex y micro-filtrado (0,22 m). Mantener a 4 ° C hasta su uso en el experimento. No vuelva a congelar y usar sólo por un día.
6. Preparar MNI solución de glutamato de stock de 50 mM disolviendo el compuesto en agua bidestilada. Diluir MNI solución de glutamato de stock a una concentración final de 5 mM en ACSF normal. Mantener a 4 ° C hasta su uso en el experimento. No vuelva a congelar y usar sólo por un día. Alícuotas de las tiendas, que no se utilizan inmediatamente en el experimento, a -20 ° C.

2. Disección del Tejido

NOTA: La preparación de cortes de hipocampo agudos del cerebro de roedores se describió en detalle anteriormente ^13,14. En breve, el siguiente protocolo se utilizó en el presente estudio.

1. Después de la decapitación, retire rápidamente el cerebro del cráneo.
2. Colocar inmediatamente el cerebro en una placa de Petricon helado de disección ACSF y diseccionar un hemisferio mediante la realización de un corte sagital en la línea media.
3. Realizar un segundo corte en la orientación deseada como una superficie de bloqueo y conectar esta a la etapa de corte de un vibratome con pegamento.
4. Tome cámara de corte y elemento de refrigeración (tanto mantenido a -20 ° C) de la vibratome fuera de la etapa de corte congelador y el lugar con la sección del cerebro en la cámara. Luego ponga elemento de refrigeración en la cámara y sumergir el tejido en helado disección ACSF. Para estabilizar la preparación, uno puede querer contrarrestar el bloque de tejido con gel de agar.
5. Cortar 250 micras de espesor rodajas, parasagitales del hipocampo con la vibratome. Asegúrese de que todos los líquidos de la AEC se burbujea en todo momento.
6. Después de cortar, mantener el tejido en una malla en un vaso de precipitados con el ACSF normal y se incuba a 34 ° C durante 30 min. A continuación, mantener a temperatura ambiente.

3 Preparación de Hardware

Figura 1. esquema que muestra trayectorias de luz y control experimental de la plataforma de formación de imágenes que consiste en multi-fotón, de escaneo láser UV de flash fotólisis, y electrofisiología. El haz de múltiples fotones (rojo) es producido por una de infrarrojos (IR) de láser pulsado, ajustable (TISA). Se pasa un obturador mecánico, una célula Pockels ', y el detector de IR (detección de la intensidad del haz), todos los cuales permiten el control de la potencia del láser y su duración de la administración. El / flip-cabo diodo láser opcional en flip-se emplea para la alineación básica del haz de láser. El expansor de haz se puede utilizar en combinación con los objetivos con un plano extremadamente amplia de back-focal. La rueda de filtros ND control remoto puede ser usado en adición o en lugar de las células Pockels 'para controlar la potencia del haz láser. Después de pasar por el cabezal de escaneo, el pulsante IR-luz es guiada a la muestra. Emitented luz fluorescente (luz verde) se recoge, ya sea por el exterior o los detectores fotomultiplicadores internos (PMT). Los detectores externos están totalmente sincronizados con los PMT internos a través de un conmutador de alta frecuencia (controlador PMT). El haz uncaging (azul claro) es producida por un láser UV de estado sólido (DPSS UV-láser). A continuación, se dirige a la unidad de exploración galvo impulsada en la espalda parte superior del condensador epi-fluorescencia por una guía de luz. El posicionamiento preciso (aberración cromática entre la imagen y haz uncaging) del punto uncaging o área está habilitada por la exportación de imágenes desde el software de imágenes. La Administración del tiempo para la sincronización de la imagen, la electrofisiología y la fotólisis flash se controla electrónicamente. El detector de transiluminación (TL-PMT) es de necesidad para la documentación de la colocación de las pipetas dentro del tejido. Las unidades de control y el software del sistema de imagen, que ha sido modificado, se utiliza para controlar y sincronizar todos los demás dispositivosnecesaria para hacer funcionar el sistema. Componentes del sistema etiquetados como "costumbre" fueron diseñados y construir / adaptado por los autores. Algunos componentes han sido adaptados para cumplir los requisitos del sistema multi-fotón costumbre-construye y se etiquetan como "modificado". Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

1. Encienda los componentes del sistema multi-fotón. Pruebe y ajuste la alineación del haz de infrarrojos láser.
   1. Control de posicionamiento del haz por voltear en el prisma de centrado en lugar de un objetivo. Si se dislocó el haz, re-ajustar por los espejos en el periscopio. Tenga en cuenta que el plano de centrado del prisma debe estar en el mismo nivel que el plano focal posterior del objetivo mientras que las imágenes.
   2. Encienda el espectrómetro y comprobar las características de múltiples fotones del haz.
   3. Establecer parámetros del software de imágenes a los siguientes valores: Elijaun tamaño de fotograma de 512 x 512 píxeles para imágenes generales de la célula (cajas de clips más pequeños, con un factor de zoom de 2,5 para alta frecuencia de imagen y alta resolución espacial, respectivamente). Ajuste la velocidad de formación de imágenes en el modo rápido y modo de exploración para XYT. Z-paso a paso debe ser de 1 m para las pilas de visión general y de 0,2 m para pilas detalladas para que coincida con los requisitos de muestreo espacial para deconvolución realizado más tarde.
2. Ajustar la luz del láser de múltiples fotones (790 nm) de intensidad mediante la alteración de la configuración de las células Pockels '(energía final en virtud del objetivo: ≈ 14 - 16 mW) y los fotomultiplicadores (PMT).
3. Encender y calibrar el sistema uncaging colocando una diapositiva muestra fluorescente bajo la lente del objetivo.
   1. Uso de los prismáticos, ajustar el enfoque de la óptica de los rayos UV y espacialmente limitar el punto de láser UV para un tamaño de 2 m de diámetro como máximo mediante el empleo de la unidad de enfoque a la cabeza de exploración UGA.
   2. Iniciar la rutina de calibración del softwar control de la unidad uncaginge.
      1. Ajuste el láser UV a varios puntos dentro de su rango de exploración, mientras que la fluorescencia es capturado con una cámara CCD. Al hacer clic en el punto de láser UV en cada punto, ajustar la posición de los espejos de escaneo galvánicos para corresponder a un cierto coordinar en el software.

Figura 2. esquema detallado que ilustra las características de excitación, emisión y trayectorias de rayos uncaging. El haz de excitación IR (rojo) pasa el haz de la combinación de espejo dicroico en el nivel a la torreta Filer en el condensador epi-fluorescencia del microscopio y el objetivo de llegar a la muestra. El haz uncaging (azul) se entrega a través de una fibra óptica luz de cuarzo para la colimación y haz unidad de enfoque y, posteriormente, guió a los mi exploraciónrrors en la unidad de exploración, pasa un espejo dicroico a la combinación de haces espejo dicroico. Aquí se combina con el haz de exploración de excitación. La luz emitida por la muestra sigue el camino de la trayectoria del haz de barrido de excitación en la orientación opuesta hacia la cabeza de exploración de imágenes. La cámara se utiliza para el control visual de la pipeta de parche y para el posicionamiento de la viga uncaging en combinación con el microscopio láser confocal de barrido (no mostrado). La trayectoria de la luz verde representa una iluminación epi-fluorescencia opcional que puede ser de uso con otras aplicaciones.

3. 2. 2. Utilice el sistema de flash fotólisis en el modo de punto de obtener aplicaciones focales. Asegúrese de que el ajuste focal del haz uncaging (potencia media por debajo del objetivo: 0,55 mW) da como resultado un tamaño de punto de 1,5 m de diámetro (extensión xy) tal como se revela en una diapositiva fluorescente colocada en un nivel z que corresponde a la de un tejidorebanada (no mostrado).
   3. El posicionamiento preciso del punto uncaging se logra mediante la importación de una imagen del sistema de formación de imágenes a través de una conexión de red entre-ordenadores de imágenes y uncaging-.
      1. El uso de un software capturador de pantalla, leer continuamente los marcos del software de imagen (en lugar de la alimentación de la cámara) y ajustar los marcos de imagen y uncaging congruentemente. Exportar cada fotograma 10 ^º desde el software de imágenes como imagen de referencia en la unidad de flash para asegurar un ajuste adecuado durante todo el experimento.

Figura 3 Ajuste de la mancha uncaging: Para posicionar con precisión el lugar uncaging, una captura de pantalla del software de imagen (cuadro amarillo) se importa en el software uncaging (recuadro verde). Elimagen de la izquierda dentro del marco amarillo representa una imagen codificada Hi-Lo (azul: píxeles negros, rojo: saturado píxeles) de toda la célula piramidal CA1. La imagen se superpone a la red de calibración del software uncaging ("X" verde s). A la derecha, una parte ampliada de la celda se muestra con el punto uncaging superpuesto (cruz roja). La mancha amarilla es la imagen superpuesta de forma automática del haz uncaging. Por favor haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

4. Encienda micromanipulador, componentes de electrofisiología, y dispositivo de aplicación de presión para el suministro del compuesto enjaulado a la región de destino.
5. Instale un dispositivo de aplicación de presión focal para perfusión local de compuestos enjaulados. Esto reducirá los costos enormemente en comparación con baño de perfusión de estas sustancias. Ajustar la presión de sujeción a la presión atmosférica se administra para prevenir un arrastre de ACSF en o una fuga de sustancias enjaulados de la pipeta de aplicación.
   NOTA: El dispositivo de aplicación de presión alberga una micro-válvula de alta precisión y ultra rápido en el soporte de pipetas. Esto permite emplear presiones aplicación mínima y por lo tanto reduce los artefactos de movimiento a un mínimo durante la perfusión local con el compuesto enjaulado.
6. Tire de pipetas para su conjunto de células patch-clamp y perfusión local utilizando capilares de vidrio borosilicato pulidas al fuego. Pipetas deben tener un diámetro de la punta de ~ 1 micras y una resistencia de R ≈ 3 mW (valores determinados con K _meso-3 basado en ICS).
7. Lugar rebanada en el baño experimental y fijarlo con una rejilla (marco de platino 250 m de espesor, se extendieron con filamentos quirúrgicos, OD 40 m) (Figura 4A, B). Utilice un invertida, la punta rota, y pipeta Pasteur pulida al fuego (bola de succión en el lado de la punta rota) para la transferencia de la rebanada. Evite doblar y cualquier otra manipulación áspera de la rebanada.

Figura 4. Componentes de la bañera experimental y el posicionamiento de la bañera en la platina del microscopio. (A) El baño experimental consiste en la cámara de baño en sí (cuadrado azul), que está rodeado por un anillo de metal magnético. El tubo asegura perfusión continua del baño con solución salina (ACSF). La rejilla para sujetar y fijar la rebanada se pone en la cámara de baño. (B) la preparación rebanada aguda situado dentro de la cámara de baño. La rebanada es fijado por los hilos de la rejilla. (C) de posicionamiento y la geometría de la bañera experimental en la platina del microscopio durante los experimentos.

8. Coloque baño en la platina del microscopio y permanentemente perfundir rebanada con ACSF.

4. Plenario de células patch-sujeción

1. Cargar parche pipeta con ICS contienen SBFI y cargar pipeta perfusión local con compuesto enjaulado. Adjuntar pipetas para micromanipuladores correspondientes. Coloque el electrodo de referencia en el baño. Asegúrese de que está conectado a tierra de forma permanente para evitar daños a la etapa de la cabeza (cf figura 4C).
2. Baje las dos pipetas en el baño y colocarlos encima de la región CA1 del hipocampo. Aplique una leve presión sobre la pipeta parche (40 mbar) para evitar la dilución de los ICS con ACSF.
3. Compensar la tensión offset de la pipeta parche utilizando el software de electrofisiología.
4. Acercarse a una célula piramidal CA1 con parche pipeta empleando microscopía de vídeo-IR DIC. Aplicar una suave succión hasta que se obtenga un sello Giga. Elija una célula el soma de los cuales está ubicado 30 -70 m por debajo de la superficie de la rebanada para asegurar la morfología celular intacta en el lado de un lado y baja dispersión y atenuación del haz uncaging en el otro lado.
5. Compensa la capacidad rápida. Membran RecesoE y de célula abierta para ganar configuración de célula completa.
6. Compensa la capacidad lento y resistencia en serie.
7. Permita que la celda que se dializa con los SBIF-ICS durante al menos 30 minutos antes de comenzar los experimentos de imagen.

Imágenes 5. Multi-fotón y estimulación

Figura 5. protocolo experimental. Para inicializar un experimento, un pulso de disparo (indicado por el signo rojo (ᴨ) y la línea roja) está configurado para iniciarse al mismo tiempo la formación de imágenes (azul), la electrofisiología (verde), y la administración de la enjaulado compuesto (amarillo) en el punto 0 seg. Durante este primer período, el de rayos de imagen debe ser totalmente atenuado (luz azul). Después de 4,5 seg (línea de trazos), la perfusión local del compuesto enjaulado se termina y el haz de formación de imágenes se debe establecer en su worintensidad rey de adquisición de datos (azul). 1,5 seg después (punto 6 seg), un segundo impulso de disparo está dada (indicada por el signo de color rojo (ᴨ) y la línea roja), que inicializa la unidad de flash UV (duración del flash: 300 mseg; indicado por el flash amarillo ) y establece los marcadores en la electrofisiología y el protocolo de obtención de imágenes.

1. Añadir la tetrodotoxina (TTX, 500 nM) a ACSF para evitar la activación de los canales de sodio dependientes de voltaje y la generación de potenciales de acción.
2. Visualice la morfología celular utilizando excitación multi-fotón y resultante de fluorescencia SBFI y elegir una dendrita espinosa para el experimento. Enfoque adentro para imágenes con mayor resolución y ubicar el clip alrededor de la dendrita.
3. Llenar una pipeta parche de serie con 10 l ACSF que contiene glutamato enjaulado. Conecte la pipeta para el sistema de aplicación de presión y adjuntarlo a la micromanipulador.
4. Coloque la pipeta con el compuesto enjaulado cerca de la dendrita (~ 30 m). Coloque la pipeta para permitireficiente perfusión local de la dendrita de elección. Ajuste el láser uncaging: posicionar el punto uncaging estrecha (~ 1 - 2 m) para la estructura de interés.
5. Set regiones de interés en la dendrita elegido y espinas adyacentes utilizando software de imágenes.
6. El enfoque de la región de interés y focalmente inyectar el compuesto enjaulado para varios segundos con baja presión (<3 PSI). Iniciar patch clamp y grabaciones de fluorescencia (a 790 nm de excitación multi-fotón) a través de la señal de disparo.
   NOTA: Durante la perfusión local del compuesto enjaulado, el haz de excitación está completamente atenuado para evitar la decoloración.
7. Deje de perfusión local del compuesto enjaulado. Aumenta la intensidad del láser de dos fotones para permitir la excitación eficiente de SBFI y aplicar un flash UV para inicializar uncaging (uncaging duración de 300 ms).
8. Monitorear cambios en SBFI fluorescencia. Detener la grabación después de SBFI fluorescencia se ha recuperado de nuevo a la línea de base.

6. Farmacología

1. Para probar la implicación de los receptores ionotrópicos de glutamato en la generación de las corrientes y / o señales de sodio evocadas por fotólisis de destello UV de glutamato enjaulado, emplear bloqueadores de los receptores.
   1. Cambiar a ACSF que contiene el bloqueador del receptor de AMPA-ciano-nitroquinoxalina-diona (CNQX, 10 M) y el bloqueador del receptor de NMDA-amino-phosphonopentanoate (APV, 50 M), además de TTX (ver arriba) y perfundir rebanada durante al menos 10 min.
   2. Procedimiento de estimulación de repetición (véase 5.4 y 5.5.)
2. La reversibilidad de los efectos de los inhibidores de la '
   1. Cambie de nuevo a ACSF normal que contiene sólo TTX.
   2. Perfundir rebanada durante 20 min.
   3. Procedimiento de estimulación de repetición (véase 5.4 y 5.5.).

7. Morfología

1. Grabar un XYZ-pila de la caja región de recorte conjunto de las medidas realizadas. Asegúrese de que esta pila es de sobremuestreod espacialmente (por lo menos 0,2 m por píxel) para permitir la deconvolución de imagen óptima y aumentar la calidad y resolución de imagen.
2. Grabar un XYZ-pila de toda la célula para evaluar la morfología celular.
3. Ejecutar algoritmo de deconvolución.

En el presente estudio, se demuestra un procedimiento para la microscopía de múltiples fotones de la dinámica de sodio celulares con el fluorescente SBFI colorante dependiente del sodio en las neuronas piramidales CA1 del ratón aguda cortes de tejido del hipocampo. Por otra parte, nos muestran cómo combinar esta técnica de imagen con uncaging basado escaneo láser de compuestos neuro-activa (por ejemplo, glutamato enjaulado) y su precisión extrema a la micro-dominios celulares.

Cargando neuronas con SBFI a través de la pipeta patch-permitieron la visualización de toda la célula incluyendo finas dendritas y espinas adyacentes mediante el empleo de excitación multi-fotón (Figura 6A, B, D y la Figura 7a).

Figura 6. señales de sodio y corrientes sinápticas inducidas por el flash fotólisis de glutamato enjaulado. (A) Maximimagen de proyección al de una neurona piramidal CA1 cargado con SBFI a través de la pipeta de parche (PP). El cuadro indica el área que se muestra ampliada en B. LP indica la posición y orientación de la pipeta para perfusión local de glutamato enjaulado. (B) de alta potencia de proyección máxima de una pila de secciones ópticas de una dendrita con espinas dendríticas adyacentes. Las pilas de secciones ópticas se sometieron z-alineación y deconvolución. La cruz roja indica que la región de orientación del haz uncaging. La línea de puntos naranja delimita la región de interés de la que se registró la emisión de fluorescencia. El cuadro indica el área que se muestra ampliada en D. (C) A la izquierda: la señal de sodio (fila superior) y somática corriente de entrada (fila inferior) inducida por el flash fotólisis de glutamato enjaulado (indicado por el flash de color amarillo). La línea roja representa un ajuste de los datos experimentales. El área gris representa el período en el que el flash uncaging (300mseg) obstruyó la obtención de imágenes de fluorescencia SBFI Derecha:. Sin pre-perfusión con glutamato enjaulado, la misma UV-flash ni evocó un cambio en la emisión de SBFI, ni una corriente hacia el interior (D) Izquierda:. Imagen de alta potencia de la dendrita y adyacentes espinas según lo delineado en B. Junto, la misma imagen con valores de gris invertidos. Las líneas punteadas indican las regiones de interés en la que se registró la emisión de fluorescencia. La cruz roja indica la localización del haz de uncaging Derecha:. Transitorios de sodio inducida por la radiación UV-flash fotólisis de glutamato enjaulado. Azul traza: señales de sodio en la dendrita; trazo rojo: la respuesta de tres espinas adyacentes al lugar uncaging promedio; verde rastro: la respuesta de tres espinas distantes promedio. Por favor haga clic aquí para una versión más grande de esta figura.

Después de la perfusión local con enjauladoglutamato, la aplicación de un UV-flash cerca de una dendrita resultó en una disminución transitoria en la emisión de fluorescencia de SBFI, lo que refleja un aumento en la concentración de sodio intracelular (Figura 6C, D y la Figura 7B). Al mismo tiempo, una corriente hacia el interior se registró en el soma (Figura 6C y la Figura 7B). El aumento de la duración del destello UV resultó en el aumento de las amplitudes tanto de la provocada corrientes hacia el interior y las señales de sodio (datos no mostrados), lo que indica que el sistema estaba dentro de su rango dinámico y que las respuestas ni uncaging ni celulares se saturaron. Aplicación de un UV-flash de idéntica duración o más para rebanadas que no habían sido pre-perfundido con glutamato enjaulado, nunca provocó cambios en la fluorescencia SBFI ni corrientes hacia el interior, lo que indica que estas señales se deben a la uncaging de glutamato (Figura 6C). Por otra parte, estos resultados muestran que u no se observa la interdependencia de los componentes Imaging- y uncagingnder nuestras condiciones experimentales. Señales de sodio también puede ser detectada en las espinas dendríticas (Figura 6D). Mientras que no trató de lograr la estimulación de una sola columna sólo con uncaging glutamato, amplitudes máximas tendían a ser ligeramente superior en las espinas cerca del lugar uncaging, mientras que las espinas mostraron más lejos cambios de fluorescencia prácticamente idénticas a la dendrita padres (Figura 6D).

Finalmente, se estudió la vía para la entrada de sodio en dendritas y espinas en respuesta a uncaging de glutamato. Para este fin, empleamos CNQX y APV, que son bloqueadores selectivos para los receptores de glutamato de sodio-permeable, ionotrópicos de la AMPA- y NMDA-subtipo, respectivamente. Nuestros resultados muestran que las señales de sodio intracelular inducida por glutamato y las corrientes provocadas somáticas se omitieron en la presencia de estos bloqueadores (Figura 7B). Tras lavado de los bloqueadores, las señales se recuperaron. Esto demuestra That uncaging de glutamato activa los receptores de glutamato ionotrópicos en las neuronas piramidales de CA1, que median el flujo de sodio en las dendritas y espinas, lo que resulta en los transitorios de sodio intracelular y corrientes hacia el interior.

Figura 7. perfil farmacológico de señales de sodio evocados y corrientes hacia el interior. (A) SBFI lleno de CA1 neurona piramidal con parche pipeta (PP) unido a la soma (B) Izquierda:. Transitoria de sodio y la corriente somática inducida por la foto-activación de glutamato enjaulado en una dendrita y espinas adjuntos Centro:. Perfusión con el bloqueadores de los receptores de glutamato ionotrópicos CNQX y APV inhibe tanto la señal de sodio y la corriente hacia el interior inducida por uncaging Derecha:. Tras lavado de los bloqueadores, las señales se restauran. Los represen línea rojact que un ajuste de los datos experimentales. El área gris representa el período en el que el flash uncaging (300 ms) obstruyó la obtención de imágenes de fluorescencia SBFI. Por favor haga clic aquí para una versión más grande de esta figura.

El presente estudio muestra que SBFI es muy adecuado para formación de imágenes de dos fotones de los transitorios de sodio intracelulares en pequeños compartimentos celulares. Tiene que tenerse en cuenta, sin embargo, que la eficiencia cuántica de SBFI es más bien baja ¹⁵ y relativos cambios en la concentración de sodio son bastante pequeñas con actividad fisiológica. Por lo tanto, la medición de alta resolución de los transitorios de Na ⁺ en los procesos de finos es una tarea relativamente tedioso, y binning o promediación de varios ensayos puede ser necesario para obtener señales satisfactorios. Además, la cinética de los transitorios de sodio son sorprendentemente lenta, por lo que es obligatorio para grabar durante períodos de tiempo prolongados. Esta observación se corresponde con los de estudios anteriores, donde la caries monoexponencial de los transitorios de sodio en las dendritas neuronales y en los astrocitos se caracteriza por constantes de tiempo grandes descomposición en el intervalo de 10 segundos a temperatura ambiente ^1,2,6. Por lo tanto los transitorios de sodio parecen ejercer un momento co mucho más lentourse y mucho más grandes constantes de tiempo de decaimiento, en comparación con los transitorios de calcio ^16.

Ponga a un lado estos inconvenientes, las imágenes de sodio ha demostrado ser una herramienta valiosa para la investigación de las propiedades fisiológicas de subdominios neuronales. Por ejemplo, las imágenes de sodio puede servir para controlar la actividad sináptica excitatoria en o cerca de las sinapsis activas. Debido esencialmente de sodio no está tamponada ^8,17, transitorios de sodio inducida por la actividad están relacionadas linealmente a una amplia gama de la liberación de glutamato sináptico de glutamato o exógenamente aplicados. Ellos por lo tanto, representan indicadores directos e imparciales de la actividad glutamatérgica neuronal. Además, colorantes indicadores de sodio presentan una alta K _d 's (de SBFI K _d está en el intervalo de 25 mM ^1). Incluso en las concentraciones de colorante intracelulares relativamente altas usadas para lograr el brillo suficiente (generalmente 0,5-1 mM), el alto K _d 's implica que los propios tintes no actúan como amortiguadores para sodium. En consecuencia, no distorsionan el curso amplitud ni el tiempo de los transitorios de sodio, que es siempre una preocupación cuando tintes sensibles al calcio se introducen en las células ^18. Por lo tanto, se puede suponer que las señales detectadas representan una buena medida de los cambios "reales" en sodio intracelular. Su evolución en el tiempo lento implica entonces que la velocidad para la difusión intracelular de sodio en las neuronas es mucho menor que anteriormente supone ^19.

Un requisito fundamental para la exitosa ejecución de los experimentos que abordan las propiedades de las vías de transmisión y de afluencia de sodio sinápticos excitatorios en espinas y dendritas es la inducción de una activación rápida y muy localizada de estructuras postsinápticas. Esto se puede conseguir mediante la aplicación rápida y local de glutamato o agonistas de glutamato en la vecindad directa de una columna o una dendrita por la fotolisis de flash de compuestos enjaulados. Fotólisis flash hace dama no mecánicamentege el tejido, está libre de artefactos de movimiento y está bien establecido para la investigación de cuestiones relacionadas (por ejemplo, la señalización de calcio local). El diámetro de la mancha uncaging fue de 1,5 micras en el plano xy. Uncaging cerca de una señal de sodio dendritas espinosas inducidas en las dos espinas y la dendrita padres. Considerando que las señales tendían a ser más grande en las espinas más cercanos al lugar uncaging, las amplitudes en la dendrita de los padres y espinas más lejos todavía eran bastante similares a aquellos en proximidad directa de la mancha uncaging. Uncaging se realizó durante 300 mseg durante el cual corrientes hacia el interior aumentaron en amplitud. Glutamato Uncaged podría haber difundido en el tejido durante el mismo período de tiempo, la activación de los receptores ionotrópicos de glutamato y la entrada de sodio en las regiones dendríticas y espinas más lejos del punto uncaging.

Un problema intrínseco que se produce cuando se utiliza un láser UV para la fotólisis de compuestos enjaulados administrados a través de la solución de baño de célulases 'de filtrado interno'. Debido a la alta tasa de absorción de la jaula, la luz UV se atenúa fuertemente a lo largo del camino desde el objetivo a la zona de estimulación ^20,21. Una manera posible de evitar esto es la perfusión local con la jaula que se limita sólo a la zona de estimulación, lo que disminuye, además, la cantidad de compuesto necesaria enjaulado a un mínimo. En comparación con uncaging mediada por escaneo láser UV, cerca de infra-rojo de dos fotones uncaging ²² es espacialmente más precisa, principalmente debido a la precisión de la estimulación se incrementa en el eje z. Por otro lado, debido a la sección transversal pequeña de las jaulas comúnmente utilizados para longitudes de onda más largas como se emplea con excitación de dos fotones, ya sea una alta concentración del compuesto enjaulado o muy alta, se necesitan intensidades de luz potencialmente fototóxicas. Además, uncaging de dos fotones requiere una inversión mucho mayor en el equipo; entre otros, un láser IR adicional, más los componentes ópticos necesarios, se necesitan.

Tanto SBFI y MNI-glutamato son excitables en el rango de longitud de onda idénticas. Esto puede conducir a una interdependencia involuntaria de láser UV uncaging y SBFI o láser de formación de imágenes IR y MNI-glutamato, lo que resulta en el blanqueo de SBFI por el flash uncaging y / o un uncaging continua de glutamato por el haz IR. Sin embargo, como se muestra en la Figura 6C, ni un destello UV por sí mismo ni la formación de imágenes de múltiples fotones causado tales efectos recíprocos en las condiciones experimentales.

Sistemas UV en flash similar a la descrita aquí se utilizan de forma rutinaria en muchos otros laboratorios y pueden con relativa facilidad pueden incorporar en cualquier microscopio de imagen multi-fotón existente. Ofrece la ventaja de que el haz de láser para la fotólisis se puede colocar libremente en el campo de visión. Además, el sistema permite un reposicionamiento rápido y automatizado del haz de láser y el volumen de liberación, respectivamente, en el campo de visión durante un experimento. Our modificación simplifica y mejora el posicionamiento preciso del punto uncaging, de modo que los marcos de la formación de imágenes de software pueden servir para ajustar los marcos de imagen y uncaging congruentemente.

Tomados en conjunto, de células enteras patch-clamp de sodio y de formación de imágenes multi-fotón en dendritas y espinas de las neuronas centrales, combinada con un procedimiento modificado para uncaging UV-inducida por la luz de glutamato, permite la activación fiable y focal de receptores de glutamato en el tejido. De este modo, puede servir para analizar las propiedades de la transmisión sináptica excitatoria y de señales de sodio en las neuronas postsinápticas en el tejido intacto.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses. Los autores recibieron apoyo financiero que permite publicación de acceso abierto por Rapp optoelectrónicos (Wedel, Alemania), que produce un instrumento utilizado en el artículo de vídeo. La compañía no ha estado involucrada en los experimentos ni en el manejo de los datos ni en la escritura manuscrita.

Este estudio fue apoyado por una beca de la Fundación Alemana de Ciencias (DFG, Ro2327 / 6-1) a CRR Los autores desean agradecer a S. Durry y C. Rodrigo de asistencia técnica de expertos, y M. Dubbert (Laboratorio de Electrónica, Instituto Zoológico , Universidad de Colonia, Alemania) para obtener ayuda en la aplicación del controlador de la célula Pockels y el interruptor de HF.