רדיואקטיבי באתרו הכלאה לזיהוי תבניות ביטוי מגוונות גנים רקמות

פרוטוקול זה משמש בהצלחה כמותית לזהות רמות ודפוסים מרחביים של ביטוי mRNA של מספר סוגי רקמות על פני בעלי החוליות. השיטה יכולה לזהות תעתיקי שפע נמוך ומאפשר עיבוד של מאות שקופיות בו זמנית. אנו מציגים את הפרוטוקול באמצעות פרופיל הביטוי של היווצרות העופות המוח העוברי כדוגמה.

לדעת את העיתוי, ברמה, לוקליזציה נייד, ואת סוג התא הגן מתבטא תורם להבנתנו את הפונקציה של הגן. כל התכונות הללו ניתן להשיג עם ההכלאה ב באתרו כדי mRNAs בתוך התאים. כאן אנו מציגים רדיואקטיבי בשיטת הכלאה באתרו שונה מ קלייטון et al. (1988) ^1, כי עובדת בהצלחה במעבדה שלנו במשך שנים רבות, במיוחד שכל בעלי חוליות בוגרים ^2-5. הארוכים משלימים RNA (קרנה) בדיקות רצף היעד מאפשר זיהוי של תמלילי שפע נמוכות ^6,7. שילוב הנוקליאוטידים רדיואקטיביים לתוך בדיקות קרנה מאפשר רגישות גילוי נוסף של תמלילי שפע נמוכות ניתוחים כמותיים, או על ידי סרט אור רנטגן רגיש או תחליב מצופה על הרקמה. אלה שיטות זיהוי לספק תיעוד ארוך טווח היעד של ביטוי גנים. לעומת הלא רדיואקטיבי בדיקה ספידODS, כגון DIG-תיוג, שיטת בדיקה רדיואקטיבית ההכלאה אינו מחייב צעדים הגברה מרובים באמצעות HRP נוגדנים ו / או ה-TSA ערכת לגילוי תמלילי שפע נמוכים. לכן, שיטה זו מספקת יחס ליניארי בין עוצמת האות לבין כמות ה-mRNA ממוקדים על ניתוח כמותי. הוא מאפשר עיבוד 100-200 שקופיות בו זמנית. זה עובד גם על שלבי ההתפתחות השונים של העובר. מחקרים התפתחותיים ביותר של ביטוי גנים משתמשים עוברים שלמים שאינם רדיואקטיביים גישות ^8,9, בין השאר בשל הרקמה העוברית היא שברירית יותר רקמת מבוגר, עם פחות לכידות בין תאים, ולכן קשה לראות את הגבולות בין אוכלוסיות תאים עם קטעי רקמה. לעומת זאת, הגישה שלנו רדיואקטיבי, בשל מגוון גדול יותר של רגישות, הוא מסוגל להשיג ניגודיות גבוהה יותר בהחלטה של ​​ביטוי גנים בין אזורים רקמות, מה שמקל לראות הגבולות בין האוכלוסיות. באמצעות שיטה זו, החוקרים יכלו לחשוף אתמשמעות אפשרית של הגן המזוהה החדש, ובהמשך לחזות את הפונקציה של הגן של עניין.

1. רקמת הכנה

1. למסוק רקמות חדשות. עבור עוברי העופות, הביצים בזהירות לפתוח ולנקות את העובר בצלחת עם 1xPBS, פעמיים. עבור מוחות בוגרים, להסיר במהירות את המוח בעדינות ולשטוף עם 1 X PBS.
2. עוברים שבץ מוח או מבוגר לתוך תבנית מוטבע מלא אוקטובר רקמות Tek, orientating רקמה לפי הצורך עבור חתך, ומהר להקפיא את גוש ידי הצבתו בתוך אתנול תערובת קרח יבש, נזהר שלא לקבל את התערובת בתוך בלוק .
3. פורסים את המדגם קפוא cryostat תוך 10-12 חלקים עבים מיקרומטר. על רקמת המוח העוברי, ממוזג חיתוך הטובה ביותר היא בטווח של -18 ° C עד -20 ° C.
4. הר חלקים קפואים בשקופיות סופר פלוס זכוכית.
5. אחסן את הסעיפים תיבת שקופיות ב -80 ° C.

2. דור של Riboprobes רדיואקטיביים (השתמש בטיחות קרינה נהלי המוסד שלך)

1. צור ד.נ. ליניארי מטוהריםתבנית של עניין cDNA שלך או על ידי האנזים לעכל מוגבל של שבר משובטים מוקף האמרגן רנ"א פולימראז אתרים מ-DNA פלסמיד או PCR של הכנס המצורפת מקדם אתרים RNA פולימראז מחייב. ניתן גם ליצור קטעי ה-PCR עם היזמים RNA פולימראז כחלק 3 'ו 5 "ה-PCR primers. ג'ל לטיהור שברי מוגבל או PCR שלך שנוצר עם ערכת ג'ל GENECLEAN טיהור.
2. כדי צינור 0.5 Eppendorf מ"ל, להוסיף 0.5-1 מיקרוגרם של מטוהרים תבנית ה-DNA ליניארי, מאגר שעתוק, DTT, RNasin, הפתרון AGC תערובת נוקלאוטידים, ומים RNase חופשית להביא את עוצמת הקול עד לגובה הרצוי. לאחר מכן הוסף S ^35-UTP ו-RNA פולימראז המתאימה לעשות לא riboprobes antisense או הגיוני.
3. דגירה התערובת במשך שעה 1 ב 37 אמבט המים C °. הוסף aliquot של פולימראז רנ"א דגירה של שעה 1 אחר.
4. הוסף אצטט 3M נתרן פתרון (0.1 פי נפח הכל) ו 100% EtOH (2.5 FOהנפח הכולל של LD) לתוך צינור Eppendorf כדי להאיץ riboprobe מסונתז רנ"א.
5. דגירה בקרח יבש או -80 מעלות צלזיוס במשך 15 דקות או יותר מ -3 שעות כדי לסייע משקעים.
6. גלולה RNA על ידי צנטריפוגה ב 4 ° C, 15,000 סל"ד בצנטריפוגה Eppendorf בטבלה העליונה למשך 30 דקות.
7. הסר את supernatant ולשטוף גלולה עם EtOH 70%, לחץ באצבע לערבב היטב גלולה.
8. גלולה RNA שוב על ידי צנטריפוגה ב 4 ° C, 15,000 סל"ד למשך 30 דקות.
9. הסר את supernatant לחלוטין pipeting ולאחר מכן להוסיף 40 הפתרון הכלאה μl. מערבבים היטב על ידי pipeting פנימה והחוצה.
10. שים 1 μl של פתרון בפתרון 3 בטיחות לפתור מ"ל תערובת הבקבוקון, נצנץ ובכן, ולמדוד את סעיפים ב למונה הנצנץ.
11. מניחים את Eppendorf עם riboprobe ב -20 ° C לשימוש בתוך שבוע.

3. טיפול רקמות

1. על מכסה המנוע, להכין טרי PBS שנאגרו paraformaldehy 4%דה פתרון על 3-5 מעלות מעל טמפרטורת החדר. שקופיות המקום -80 ° C אחסון במעמד מתכת על קרח יבש, לשאת לעבוד בחלל מתחת למכסה המנוע, ולאחר מכן למקם את מתקן בפתרון paraformaldehyde 4% ו דגירה של 5 דקות בטמפרטורת החדר.
2. לשטוף 3 פעמים ב 1 x PBS כ -15 מטבלים כל אחד (כ 2 1 לכל מח"ש).
3. בשכונה, לעשות חיץ acetylation ולנער אותו נמרצות תוך 10 שניות. מיד שופכים למגש המכיל את המדף של שקופיות ו דגירה של 10 דקות, כדי להפחית את הרקע המחייב של riboprobe.
4. יש לשטוף 3 פעמים ב 2 x SSPE 15 מטבלים.
5. מייבשים ב 70%, 95% ו 100% סדרתי EtOH דקות 2 בכל צעד (לא חייב להיות מכסה המנוע).
6. לייבש את השקופיות מתחת למכסה המנוע דקות לפחות 10-15.

4. הכלאה

1. חישוב כמות riboprobe (0.5-1x10 ⁶ עותקים לדקה לכל שקופית) פתרון ההכלאה (100 μl לכל שקופיות) שקופיות את כל הדרוש. Prewaתערובת RM-riboprobe הכלאה עד 65 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות כדי לפגל riboprobe.
2. 100 Pipet μl של פתרון riboprobe-הכלאה בשורה לרוחב שקופיות, ולהשתמש coverslip זכוכית להפיץ אותו באופן שווה על פני רקמת ו coverslip. מקום מחליק באופן אופקי, מול זקוף לתוך מתקן מתכת מתלה המקום לאט זקוף לתוך אמבט 65 ° C הנפט עבור מינימום של 4 שעות ועד למקסימום של 16 שעות. הנפט יוצרת חותם אטום סביב coverslips את.
3. הסרת מדפי מתכת מהאמבטיה שמן ולנגב את עודפי השמן סביב המדף עם נייר טישו.
4. לשטוף את השמן מן השקופיות מכוסים ו מתלה מתכת מגשי זכוכית או מתכת המכילים כלורופורם, פעמיים. 2 ^nd כלורופורם לשטוף יכול לשמש הראשון לניסוי הבא.
5. להעביר את המדף עם שקופיות מכוסים למגש עם ב 0.1% β-mercaptoethanol פתרון + 2 SSPE x ו לעלות ולרדת כמה מטבלים מעט כדי לשחרר coverslips ולהסיר לפזר הכלאה Solu עודףtion.
6. להעביר את המדף עם שקופיות מכוסים בתמיסה חדשה של 0.1% β-mercaptoethanol + 2 x SSPE, ולאחר מכן הסר coverslips עם כ מלקחיים RNase חופשי הפתרון למניעת גירוד סעיפים רקמות. להעביר את השקופיות וחשפה למעמד טרי בעל שקופיות אופקי מגש מתלה, בתמיסה של 0.1% β-mercaptoethanol ב 2 x SSPE.
7. דגירה מתלה עם שקופיות mercaptoethanol-β טריים 0.1% + 2 x פתרון SSPE בטמפרטורת החדר למשך שעה 1 כדי להסיר עודפי מאוגד RNA בדיקה. מחק את זה ואת הפתרונות הקודמים לשטוף מימית, כמו גם coverslips, כמו פסולת רדיואקטיבית.
8. להעביר את המדף עם שקופיות פתרון prewarmed SSPE 2x ב 65 ° C, להוסיף β-mercaptoethanol כדי הסופי של ריכוז 0.1%, ו - דגירה על 65 מעלות צלזיוס במשך שעה 1. מחק כמו פסולת רדיואקטיבית.
9. להעביר דגירה מתלה עם שקופיות פעמיים ב prewarmed 0.1 x SPPE על 65 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות כל אחד. כמות רדיואקטיביות מוסרשלב זה הוא קטן מאוד נחשב עוד פסולת רדיואקטיבית מוגזמת לאחר שלב זה.
10. מייבשים ארונות שקופיות ב 70%, 95% ו 100% EtOH 2 דקות כל אחד.
11. לייבש את השקופיות בשכונה דקות לפחות 30.

5. ויזואליזציה של אות רדיואקטיבי

1. מניחים שקופיות היבשים לתוך קלטת סרט בחדר חשוך, הצב את רנטגן הסרט (קודאק BioMax MR הסרט) על השקופיות, ולסגור את הקלטת. ודא השקופיות עומדים בפני צד האמולסיה של הסרט X-ray. לחשוף את השקופיות עבור ~~~HEAD=NNS 1-7 ימים, בהתאם השפע הצפוי של תעתיקי את.
2. לפתח את הסרט רנטגן מפתח Fixer רגיל. האות הכלאה מופיע בתור שחור (חשופים דגנים כסף ב אמולסיה) על הסרט (איור 1).
3. 1. (אופציונלי) כדי לקבוע את הרזולוציה הסלולר ולראות אות על הרקמה, השקופיות צריך להיות טבול תחליב צילומי counterstained.אם אתה הולך בסופו של דבר counterstain עם סגול cresyl, אז delipidize סעיפים ידי דוגרים על קסילן במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר פעמיים, rehydrate 1 דק 'כל אחד 100%, 100%, 95%, 95%, 70% ו 50% EtOH ואז במים deionized. אם אתה לא הולך עם כתם צבע שאינו דורש delipidization, אז delipidization אין צורך. מגלשות יבשות גם תחת מכסה המנוע לפחות 2-3 שעות.
   2. בחדר החושך באמצעות האור בטוח, לגרוף את מספיק קודאק NTB תחליב לכסות במחצית שקופיות לאורכו (כלומר רקמות) במיכל זכוכית טבילה, ואז נמס אמבט 42 ° C מים במשך 20-30 דקות. ואז לדלל אותה במים מזוקקים יחס 1:1. רמת תחליב אמור לכסות את כל החלקים בשקופית כאשר השקופית הוא טבל בו. אם יש לך הרבה שקופיות, ייתכן שיהיה עליך להכין תחליב נוסף.
4. מטבל לתוך שקופיות אמולסיה בדילול מלא ב 42 ° C אמבט מים ומגלשות טבל יבשים במיכל סגור היטב באור overnigHT בחדר חשוך, או בתנור על 37 מעלות צלזיוס במשך 2-3 שעות, עם אורות כבויים.
5. להעביר את השקופיות לתוך חריצי מתלים בקופסאות שחורות המכילות הייבוש, נזהר על השקופיות לא לגעת זה בזה וכך ליצור חפצים. סוגרים את הקצוות של תיבות עם הקלטת חשמל שחור לאט כדי למנוע חשמל סטטי המושרה ניצוצות אור, ואז עוטפים את הקופסאות בנייר אלומיניום. אחסן את תיבות על 4 מעלות צלזיוס החל מספר ימים עד שבועות (האות מיום 1 על הסרט X-ray דומה 5 ימים תחת אמולסיה).
6. לחמם את תיבות שקופיות לטמפרטורת החדר במשך שעה 1.
7. בחדר החושך, להסיר מתלה עם שקופיות (או שקופיות מקום במעמד מתכת אם באמצעות תיבות עם חריצי שקופיות) מן הקופסאות ולפתח אותם מפתח D-19 קודאק ב 16 מעלות צלזיוס במשך 3.5 דקות.
8. לשטוף את השקופיות שפותחו במי ברז בטמפרטורת החדר למשך דקות 1.
9. דגירה השקופיות פעמיים Fixer ב 19 מעלות צלזיוס במשך 6 דקות כל אחד. אורות ניתן להפעיל במהלך הדגירה מסדר 2.
10. לשטוף את השקופיות במים זורמים בטמפרטורת החדר למשך דקות לפחות 30 ולהתרפס תחליב מהצד האחורי של המגלשה תוך "רטוב" עם סכין גילוח כדי למנוע גירוד הזכוכית.
11. כתם סגול עם רקמת cresyl 0.3% במי ברז במשך 5 דקות.
12. לשטוף סגול נוספת פתרון cresyl במי ברז טריים ~~~HEAD=NNS 15 מטבלים.
13. מייבשים את השקופיות עבור ~~~HEAD=NNS 15 לתנודות כל פתרון אלכוהול: 50%, 70%, 95%, 95%, 100% ו 100% EtOH.
14. דגירה של שקופיות קסילן 5 דקות בטמפרטורת החדר פעמיים.
15. Coverslip עם המדיום Permount בשקופית ולייבש את השקופית מכוסה בברדס הלילה (> 16 שעות), זה ייקח כמה ימים לפני כן דבק הוא יציב מספיק כדי לנקות את השקופיות יותר.

6. יצירת תמונות darkfield צבע

1. אם יש צורך, נוסף תחליב עודף נקי על הגב של השקופיות (לא coversliped הצד ללא רקמות) על ידי להרטיב אותו במים מגרדים בסכין גילוח.
2. יש לשטוף שקופיות עם פתרון EtOH 80% ולנגב בעדינות 1-2 פעמים כדי לסלק פסולת ואבק.
3. לצלם מתחת darkfield או brightfield תאורה. צעדים 6.2 ו 6.3 ייתכן שיהיה צורך לחזור 2-3 פעמים על מנת לקבל תמונות טובות ללא חלקיקי אבק, אשר ראו בקלות תחת מיקרוסקופ הביתור darkfield.

7. נציג תוצאות

שתי דרכים עיקריות של צפייה בתוצאות הכלאה באתרו על סעיפים רקמות הכלאה עם S ³⁵ בדיקות רדיואקטיביות: 1) x-ray סרטים שהונח על שקופיות או 2) תחליב שהיה מצופה על השקופיות. הגישה השלישית היא באמצעות מסך phosphorimager הונחה על השקופיות, אבל לא היה מרוצה עם רזולוציה של גישה זו. X-ray סרטים לספק תוצאה מהירה וניתוח של המצב הכולל של ההכלאה. צילום רנטגן הסרט חושף גם נתונים ברזולוציה אנטומי רחב והוא יכול לשמש analys כמותייםהוא ^10. דוגמאות רנטגן תמונות סרטים של סוף שנות ראשי העובר העופות הכלאה עם בדיקות antisense לביטוי FoxP1 ו CoupTF2 הגן הם במספרים 1 א 'וב'. שני גנים נפוצים מאוד חלוקות משנה מוח ספציפיים. באיכות טובה רנטגן בעקבות הסרט צריכה להיות חדה (לא מטושטשת) ויש להם יחס גבוה אות הרקע. תמונה מטושטשת יכול להיות בגלל מגע לא אחיד בין הסרט x-ray ו שקופיות זכוכית עם רקמת הכלאה.

עבור שקופיות תחליב טבל, תחליב מכיל אור מלחי כסף רגישים מצופים על רקמות כמו apposed להיות על הפלסטיק של הסרט X-ray. במהלך פיתוח, את ³⁵ שנחשפו מכלל מלחי כסף מומרים מתכתי גרגרי כסף, ממש כמו בסרט X-ray. עם זאת, מרבצי כסף גלויים ישירות על התאים המייצגים ביטוי גנים שניתן לצפות ומדד איכותית תחת מיקרוסקופ. גרגרי כסף מתכתי לחסום אור ישיר דרךונראה כמו נקודות שחורות תחת התצוגה brightfield. Counterstain סגול cresyl מופיע בצבע סגול (איור 3 א, 3 ג, ו איור. 4). ב darkfield, גרגרי כסף משקפים אור מגיע מהצד נראה כמו נקודות לבנות (איור 1 ג, 1D, 3B ו 3D). במצב זה, סגול cresyl הכתם מופיע בצבע אדום. ב brightfield, האות הכלאה קל יותר להציג בהגדלה גבוהה ברזולוציה הסלולר, בעוד darkfield, בנוסף, האות ההכלאה ניתן לצפות בהגדלה נמוכה יותר על פני הרקמה כולה. צפה darkfield היא הגישה שאנו בדרך כלל להשתמש כדי להראות את הדפוס הכללי ביטוי גנים. עם זאת, ביחס לתוצאות מהירה המתקבל x-ray סרטים, את השקופיות תחליב טבל לוקח זמן רב יותר (1 עד מספר שבועות) והוא רגיש יותר לקבל רקע.

ישנם ארבעה מקורות נפוצים של רקע חזק: 1) רקע על כל סרט צילום רנטגן הוא בדרך כלל לעשות כדיבעיות עם המפתח או Fixer, או הסרט נחשף באופן חלקי, 2) על רקע שקופיות הזכוכית היא בדרך כלל עקב בעיות עם הכנת כביסה או זכוכית השקופית, כגון silination לא נכון של השקופיות ממקור מסחרי או עצמי מוכן, 3) אמולסיה חשיפה רקע בפיתוח, ו 4) על רקע סעיף או בשל חוסר שלאחר הכלאה בצעדים זהירים כביסה, טמפרטורה נמוכה מדי של הכלאה, איכות ירודה של פתרון ההכלאה, זיהום paraformaldehyde במנות כביסה גורמת באופן קבוע בדיקות צולבות הקישור כדי השפלה, riboprobe רקמות המוביל מולקולות קטנות תיוג רקמות לא באופן ספציפי, DTT פעיל או β-mercaptoethanol וכתוצאה מכך צלב החיבור של S ^35-רנ"א בדיקות ב-di גופרי אג"ח לרקמות, ומחכים זמן רב מדי עבור acetylation. זה קריטי כדי לקבל את השקופיות פתרון acetylation בתוך שניות של ערבוב אנהידריד בכאבים ודלקות שאינן זיהומיות אצטית. אם מספר דקות לעבור withouלא הוספת הפתרון השקופיות, ולאחר מכן קבוצות אצטיל לא יוסרו באופן יעיל ואז לאגד RNA שאינן במיוחד. גורמים אחרים כוללים הכלאה על 20 שעות, מה שעשוי ליצור חזקה מדי של האות, ואת טיפות שמן עודף בשקופיות, אשר הטמנת פתרון הכלאה על השקופיות במהלך שוטף מימית, וכתוצאה מכך נקודות רדיואקטיביים על רקמת ומחליק נותן אותות רקע כהה. אם עובדים עם שקופיות רבות (יותר מ -100 פרוסות), להוסיף 3 ^rd כלורופורם לשטוף או לשנות שוטף כלורופורם, כדי למנוע חלקיקים מן עודפי השמן הנותר על השקופיות. טיפול רקמות רשלנית, כלומר לא קופאים מהר מספיק (תוך 5-10 דקות לאחר דיסקציה) או הפשרת מחדש הקפאת גם מעלה הרקע בשל mRNA השפלה. להיזהר שלא לטעות רקע החשיפה נגמר.

על רקע תחליב בשקופיות טבל אפשרי כי זה קל מאוד רגיש ודורש חשיפה ארוכת בחושך. Com בעיות דוד, כולל רקע גבוה מדי של הטמפרטורה על היזם ו Fixer. כאשר הטמפרטורה עולה על 19 מעלות צלזיוס, קרוב או חם יותר מאשר בטמפרטורת החדר, יותר רקע גרגר כסף מתקבל. חשיפה לרמות נמוכות של אור דולף אל תוך החושך יגרום רקע אמולסיה. לא לשטוף את Fixer מספיק זמן (לפחות 30 דקות במים זורמים), יעזוב מסדר את זה אז מגיב עם סגולה cresyl ליצור משקע חום לאורך כל אמולסיה. עם זאת, אם את השקופיות נשטפים במים זמן רב יותר מאשר 90 דקות לאחר קיבוע לפני צביעת סגול cresyl, זה יכול לגרום תחליב להיות רפוי בסעיפים להכתים גרוע. אם אין מספיק זמן כדי להכתים את שקופיות בתוך חלון 30-90 דקות לאחר קיבוע כביסה, לשטוף לאחר 30 דקות, לייבש את השקופיות לילה ולהמשיך עם סגול cresyl מכתים למחרת. באופן כללי, רוב mRNAs יש דפוסי ביטוי גנים ספציפיים, ואילו האות רקע אחיד יותר.

לפרשנות טובה יותר של סגוליות הבדיקה, תחושת שליטה בדיקות צריך להיות מיושם על חלקים סמוכים. בדיקות תחושת ביותר לא מראים אות, אבל יש כאלה, וכשהם עושים זאת, אנו מוצאים כי לעתים קרובות שונה מאשר אות antisense. אנו מאמינים כי זה יכול להיות קשור antisense סינתזה או אחרת הגן על גדיל antisense של הגנום. אנו מציגים דוגמה Pax6 היגיון בדיקות antisense (איור 2 א 'וב'). הגדיל antisense מגלה תיוג לאורך אזור חדרי המוח הקטן של המוח הקדמי, ואת העין כצפוי (איור 2 א), אבל במובן מגלה להbeling בשכבת הפיגמנט של הרשתית (איור 2 ב).

עבור גדלים בדיקה, אנו משתמשים בדיקות cDNA במקום כלשהו בטווח של 300-5000 BPS. בדיקות פחות מ 300 bps עבודה, אבל את האותות הם בדרך כלל חלשים. לא ניסינו חלליות גדולות יותר מ 5000 bps. עדיף להשתמש בדיקות על רקמה אותו מין אם הדבר אפשרי. אם לא, אנחנו צולבות להכליא בדיקות על קטעים של מינים אחרים, להקטין את ההכלאה ולשטוף הטמפרטורות ב 3-5 מעלות צלזיוס במרווחים המבוססים על זהות ברצף, אם הוא ידוע. אם לא ידוע, אז אנחנו מבצעים הכלאה של ניסוי וטעייה ולשטוף בטמפרטורות. אם הטמפרטורה יורדת יותר מדי, החללית cDNA יכול לעבור, להכליא עם mRNAs אחרים של רצפים דומים ברחבי המינים או מאותו המין ^11. בפועל, אנו מוצאים כי cDNAs כי הם ~ 95% או יותר זהה ליעד mRNA ברקמה, הכלאה מחמירים טמפרטורת הכביסה (65 ° C) תנאים עובד היטב. עבור רצפים הנמצאים צלצלES של ~ 85-94% זהה, הכלאה וטמפרטורה לשטוף ייתכן שיהיה צורך להפחית בטווח של ~ 50 עד 60 ° C.

הסיבה לשימוש מתקן מתכת ביותר המדרגות הוא שימוש שוטף כלורופורם קסילן. ממיסים אורגניים שני סוגים רבים של פלסטיק. זכוכית וכמה סוגים של פלסטיק עמידים אלה חומרים אורגניים. אבל זכוכית היא יותר קל לשבור, וכמה פלסטיקים שבהתחלה הם עמידים יתמוססו על תקופות ארוכות של חשיפה של חומרים אורגניים.

באיור 1. Autoradiography של in-situ הכלאה של תמונות רנטגן סרטים ושקופיות תחליב טבל. (AB) X-Ray הסרט תמונות של sagittal חלקים כל הראש של פינק זברה ציפור שיר ביום עוברי 10, הכלאה עם riboprobes antisense ל (A) FoxP1 או (ב) CoupTF2, נלקח עם תאורה brightfield תחת מיקרוסקופ לנתח. שחורים, גרגרי שנחשפו בסרט מראה mRNA אקספרסיון. סרגל קנה מידה = 500 מיקרומטר. (CD) אמולסיה טבל שקופיות של sagittal חלקים כל הראש של פינק זברה ביום האץ' הודעה 6, הכלאה עם riboprobes antisense עד (ג) FoxP1 (ד) CoupTF2, נלקח עם תאורה darkfield תחת מיקרוסקופ לנתיחה. לבן, חשוף דגנים כסף ב תחליב מעל רקמת מראה ביטוי ה-mRNA. סגול אדום, cresyl הכתם. סרגל קנה מידה = 200 מיקרומטר. עבור כל תמונה, המקור הוא מקורי שמאלה. הרנטגן תמונות הסרט נחשפו במשך יום אחד, שקופיות טבל במשך 3 ימים. בדיקה FoxP1 הוא 178 bps לחלק BP 1544-1711 של ה-mRNA, CoupTF2 הוא 545 bps לחלק נ"ב 1-545 של ה-mRNA. כפי שניתן לראות, בתוך ה-mRNA FoxP1 המוח הקדמי הוא מועשר ב mesopallium (M), הסטריאטום (א ') ו התלמוס הגבי (DT), ואילו CoupTF2 מועשרת ב nidopallium (N), arcopallium (א), התלמוס הגחוני יותר . יש עקביות ביטוי בין סוגים חשיפה (ו הגילאים). עם שקופיות טבל, לעומת זאת, תיוג רזולוציה גבוהה יותר נראה,גבולות רקמה ד ואזורי מזוהים באופן ישיר. אלה וכל תמונות אחרות המוצגות במאמר הן מן החלקים באמצעות תקן 65 ° C הכלאה חומרה גבוהה.

איור 2. השוואת antisense וסימון תחושה מראה דפוסים שונים. (א) הגדיל antisense של Pax6 באה לידי ביטוי במוח, במיוחד באזור חדרית (חץ לבן). הוא הראה autoradiography על x-ray סרטים של sagittal פרוסות כל הראש שנלקחו זברה פינק ביום עוברי 12. (ב) סעיף צמוד הכלאה עם גדיל את תחושת Pax6 מגלה שום ביטוי ברקע לאורך כל הראש עובר, אבל ביטוי ברור של שכבת הפיגמנט של הרשתית (חיצים שחורים) כאפיק antisense. קו מקווקו מציין את קווי המתאר של המוח כולו. C: המוח הקטן.

rong> באיור 3. ב אותות באתרו של ביטוי גנים שקופיות תחליב טבל שנלקחו המוח פינק זברה בשלבים עובריים בסוף שנות תחת צפיות brightfield ו darkfield. (א) brightfield התמונה הביטוי D1B ביום עוברי 10 מחשיפה נורמלי אמולסיה. תווית (שחור) בקושי אפשר לראות בהגדלה זו. החללית הוא 625 bps לחלק נ"ב 1-625 של ה-mRNA. (ב) סעיף ההגדלה זהה כמו () אבל עבר נוף darkfield מראה התווית (לבן) בסטריאטום (א ') ו התלמוס (ה'). (ג) brightfield התמונה הביטוי Slit3 ב 12 יום עובריים מחשיפה אל אמולסיה. לייבל (שחור) יכול בקלות לראות. החללית הוא 779 bps לחלק 1243-2021 של ה-mRNA. (ב) סעיף ההגדלה זהה כמו (א) עבר תווית צפה darkfield מראה (לבן) בחוט השדרה (SC) התואמת את התמונה brightfield. מקורי מכוונת שמאלה. CB: המוח הקטן.

/ 3764/3764fig4.jpg "alt =" איור 4 "/>
איור 4. ברזולוציה כסף תבואה ברמה התאית. הוא הראה FoxP1 תווית ה-mRNA של פינק זברה המוח הקדמי עם גרגרי כסף (כתמים שחורים) מעל תאים (סגול cresyl) באזורי המוח בגילאים שונים לעומת תמונות חשמל נמוכה יותר של איור 1 א ו 1 ג. () שפע ביטוי גבוהה על תאים בודדים (חיצים שחורים) ב הבוגרת זברה פינק mesopallium. (ב) שפע ביטוי נמוך מעל תאים בודדים (ראשי חץ שחור) nidopallium צמוד של אותו סעיף. (C) גבוהה FoxP1 mRNA ביטוי על תאים (חיצים שחורים) ב mesopallium עובריים יום 12. (ד) לרב ביטוי נמוך מעל תאים (ראשי חץ שחור) nidopallium צמוד של אותו סעיף. תאים למשל הם חגו עם קו צהוב. תאים עובריים (C ו-D) הם קטנים ארז חזק יותר לעומת תאים בוגרים (A ו-B). מאז יש קצת מקום בין תאים תחליב, שטח הפנים של Si נחשףדגנים lver מן החללית S ³⁵ הם גדולים מעט יותר מהאזור של גופי התא. סרגל קנה מידה = 10 מיקרומטר.

רדיואקטיבי הכלאה באתרו של ביטוי mRNA נעשה שימוש נרחב למטרות מרובות, כולל ללימוד הארגון רקמות אזורי, סוגי תאים, ואת הפעילות המוחית התפקודית ^{2-5,10,12-14.} שימוש אחר הוא על גנים, אשר הביטוי mRNA במוח תלויה פעילות עצבית מוגברת, המכונה לעתים קרובות פעילות תלויי גנים או גנים מוקדמים מיידיות. עם השימושים האלה, השיטה שלנו יושם על פני מספר רב של מינים, כולל ציפורים, יונקים (למשל אדם), דגים, דו חיים, ברקמות רבות, כולל המוח, העור, השרירים, והגילאים מרובות, כולל גוזלים / תינוקות, ונוער , מבוגרים, והנה העובר בחלקים שלמים ^2,3,5,15-17. התכונות המיוחדות של פרוטוקול שלנו כוללים: (1) הוא מייצר איזון בין ייחוד אנטומי וספציפיות כמותית. כדי לכמת את ביטוי הגנים על הסרט X-Ray, אנחנו לוקחים את התמונות הדיגיטליות של התמונות (לשעבר:. איור 1A ו-1B), השתמש Photoshop (Adobe) היסטוגרמה פונקציה כדי למדוד את צפיפות פיקסלים באזורים בעלי עניין ולחסר את רמות הרקע על הסרט מחוץ רקמות אך עדיין בשקופית זכוכית ^2,4. לכמת ביטוי ברמה התאית, אנחנו לוקחים תמונות של גרגרי כסף על תאים בהגדלה גבוהה (40-100x, איור 4). לאחר מכן, אנו משתמשים סף פונקציות מידה של J תמונה של וויין Rasband ב-NIH על מנת לספור את מספר גרגרי כסף בתמונה, להפחית את מספר רקע בתחום דומה ללא תאים בשקופית זכוכית, לחלק במספר תאים, להשיג כמה ערכים של ביטוי לכל תא. ^4,18 (2) ניתן תפוקה גבוהה יחסית, מה שמאפשר עיבוד של 100-200 שקופיות בו זמנית, עקב חותם coverslip חזק שנוצר על ידי אמבט שמן מינרלי. סטנדרט in-situ שיטות הכלאה להימשך זמן רב יותר לסגור את השקופיות עם parafilm, לק, ואמצעים אחרים, בהם שקופיות תופסים הרבה מקום, (3) זה מאודרגיש תמלילי שפע נמוכה עקב סולפט dextran פתרון של Denhardt במאגר הכלאה ^2,13, (4) הגישה הדמיה darkfield מניב תמונות עם ניגודיות גבוהה בשל מצלם תחת תאורה darkfield על מיקרוסקופ לנתח ^4,5. בנוסף, היא מאפשרת זיהוי הרגיש של שינויים קטנים ביטוי גנים, כמו בביטוי תלוי בפעילות הגן לזהות אזורים במוח ספציפיים המופעלים בזמן התפיסה והייצור של התנהגויות ספציפיות ^19. המגבלות ביחס שאינם רדיואקטיביים פרוטוקולים הן כי האחרונים הם ברורים בהחלטה הסלולר ואת המיקום של ה-mRNA בתוך התא, ועבודה עם אמולסיה רגישה מאוד מניפולציה ואור. ניתן לשלב את השיטה שלנו עם שיטות אחרות, כגון אי - רדיואקטיבי הכלאה באתרו לתייג ביטוי mRNA של גן אחד או יותר בתוך הרקמה באותו ^10,17,20. זה יכול להיות משולב עם immunocytochemistryלתייג את שתי רנ"א ביטוי החלבון על מדגם זהה כדי שיתוף לתהליך הלוקליזציה של mRNA עם סוגי תאים מסוימים ^10. השינויים בפרוטוקול הדרושים כאלה ניסויים תיוג כפולים מתוארים והאסמכתאות.

לסיכום, הגישה שלנו מאפשרת הבנה של תזמון ומיקום הסלולרי של ביטוי גנים לשם הבנת הארגון באזור, פעילות רקמה תפקודית, ותפקוד הגן.

אין לנו מה למסור.

המחברים מבקשים להודות לכל חברי המעבדה ג'רוויס מי שיפר את הפרוטוקול במהלך השנים.