בידוד יציב Multi-חלבון על ידי תסביכים In vivo מבוקר נייד חוצה קישור חיסונית מגנטי כרומטוגרפיה זיקה

התא חדיר crosslinker DSP [dithiobis-(succinimidyl propionate)] מייצב אינטראקציות חלוף יציב In vivo, המאפשרת בידוד מחמירים שלהם באמצעות חלבון מורכב טכניקות לטיהור. כאן אנו מציגים טכניקה תאים crosslinking גדל בתרבות בעקבות הבידוד של קומפלקסים חלבונים על ידי immunoprecipitation.

האופי הדינמי של machineries הסלולר בנויה לעתים קרובות על עמותות חלבון חולף ו / או חלש. אינטראקציות אלה זיקה נמוכה למנוע שיטות המחמירים עבור בידוד וזיהוי של רשתות חלבון סביב חלבון של עניין. השימוש crosslinkers כימיים מאפשרת ייצוב סלקטיבי של אינטראקציות יציב, ובכך לעקוף את מגבלות ביוכימיות לטיהור. כאן אנו מציגים פרוטוקול מקובל עבור התאים בתרבית המשתמשת crosslinker homobifunctional עם זרוע spacer של 12 א ', dithiobis-(succinimidyl proprionate) (DSP). DSP הוא ביקע על ידי הפחתה של קשר disulphide נוכח המולקולה. Cross-linking בשילוב עם כרומטוגרפיה של חלבונים immunoaffinity עניין עם חרוזים מגנטיים מאפשר בידוד של קומפלקסים חלבונים כי אחרת לא יעמוד טיהור. פרוטוקול זה תואם קבוע טכניקות כתם המערבי וזה יכול להיות scaled עד לזיהוי חלבונים על ידי ספקטרומטריית מסה ^1.

סטפני א Zlatic ופרל V. ריידר תרמו באופן שווה על עבודה זו.

1. הכנה Crosslinking

1. יהיה עליך צלחת מספר מספיק של תאים כדי לאפשר בידוד של 500 מיקרוגרם חלבון לכל תגובה צינור רגיל. צינור אחד עשוי להיות מספיק לזיהוי interactors המשוערת של חלבון של עניין על ידי immunoblot. במקרה זה, החומר חייב חרוז ניתן eluted עם חיץ SDS-PAGE מדגם (immunoprecipitation). לניתוח ספקטרומטריית מסה, מספר התגובות תקן צריכה להיות מוגברת לפחות עשר פעמים, קומפלקסים חלבונים צריכה להיות eluted על ידי תחרות עם אנטיגן פפטיד מוכר על ידי הנוגדן משמש (immunoaffinity כרומטוגרפיה). אסטרטגיה זו תאפשר את בידודה של קומפלקסים חלבונים ללא אימונוגלובולינים.
2. צפיפות התאים האופטימלי עבור crosslinking היא בין 75% ל 90% confluency. בתנאים confluency גבוה, תאים נוטים ערימת אחד על השני, אשר מקטין את הנגישות crosslinker התא חדיר לכל התאים.
3. סוג התא ומצב הניסוי צריך להיות מסומן על החלק התחתון של צלחת התא. אנו שגרתי כוללים שולטת עם הרכב לבד.
4. הכן את כל פתרונות מלבד הפתרון DSP לפני crosslinking.
   1. הכינו מלאי של חיץ-פוספט שנאגרו מלוחים עם 0.1 mM CaCl ₂ ו - CaCl ₂ 1 מ"מ (PBS / Ca / Mg) לפני תחילת הניסוי. התוספת של יוני סידן ומגנזיום הוא קריטי עבור הדבקה של תאים הצלחת תרבות במהלך הניסוי. חנות ב 4 ° C.
   2. 50X פרוטאז השלם קוקטייל אינהיביטור - 1 טבליה מומס במים מילי-Q 1mL. חנות ב -20 ° C.
   3. 20% Triton X-100 10g לשקול את טריטון X ו -100 לדלל בהיקף כולל של 50 מילי מים-Q מ"ל. רוק בבית 4 ° C במשך הלילה בחנות ב 4 ° C עד השימוש. אין לאחסן במשך חודש יותר מ 1. השתמש דילולים של המניה זה 20% כדי להכין את תמוגה ו-IP מאגרים המתוארים להלן.
   4. 50X פתרון DSP מרווה 1M טריס pH 7.4. אחסן בטמפרטורת החדר.
   5. הכינו מאגר 10x פתרון.
      מאגר 10X:
      • 50 מ"ל 1 M HEPES
      • 150 מ"ל 5 M NaCl
      • 10 מ"ל 0.5 M EGTA
      • 250 μL 2 M MgCl ₂
      • התאם ל-pH 7.4
      • תביאו נפח סופי 500 מ"ל
      למאגר 10X הפתרון הוא מדולל למאגר 1X לפי הצורך.
      מאגר 1x משמש גם lysate ו חיסונית מגנטי משקעים מאגרים.
      מאגר 1X
      • 10 Hepes mM
      • 150 mM NaCl
      • 1 mM EGTA
      • 0.1 מ"מ MgCl ₂
      • pH 7.4
   6. מאגר תמוגה הצפת 1X 0.5% + טריטון X-100.
   7. חיסונית-Magnetic חוצץ רטיבות (Buffer IP) 1X הצפת + 0.1% Triton X-100.

2. הכנת פתרון Crosslinking

1. הכן את פתרון DSP מיד לפני החלים על תאים. DSP הוא הידרופובי מאוד צריך להיות מומס DMSO לפני דילול למאגר PBS / Ca / Mg. להמיס 40 מ"ג של DSP ב 1 מ"ל של DMSO. זה עושה את פתרון 100 מ"מ של DSP (משקל מולקולרי של DSP הוא 404.42 g / mol).
2. חם נפח מתאים של PBS / Ca / Mg עד 37 ° C כדי להקל על דילול של DSP / DMSO לתוך PBS.
   כרכים הדרושים צלחת בגדלים שונים:
   6-גם 2 מ"ל לכל צלחת יפה
   צלחת 10 ס"מ 10 מ"ל לכל צלחת
   צלחת 15 ס"מ 20 מ"ל לכל צלחת
3. הוסף 10μL של פתרון DSP / DMSO מניות עבור כל 1 מ"ל של PBS חם / Ca / Mg. הוסף DSP / DMSO פתרון ירידה במלאי ירידה עם ערבוב עד שכל חזר DSP נמס. הפוך את פתרון השליטה DMSO 10 μL להוסיף 1 מ"ל של כל PBS / Ca / Mg.
4. שמים את כל PBS / Ca / Mg פתרונות באמבט קרח מים לא יותר מ 10 דקות.

3. הכן תאים עבור Crosslinking

1. הכן אמבט קרח מים שתתאים כל הצלחות crosslinking הדגירה או שליטה ברכב.
2. קח צלחות של 37 ° C חממה ולמקם אותם מיד לתוך אמבט קרח למים.
3. שטפו פעמיים עם תאים קר כקרח PBS / Ca / Mg. השתמש באותו נפח בו תשתמש עבור הדגירה crosslinker (ראה סעיף 2.2).
4. הסר לשטוף השני להוסיף או שליטה ברכב או חיץ DSP פתרון crosslinking.
5. לדגור על קרח במשך שעתיים. אתה צריך לבדוק את הצלחות בערך כל עשרים דקות על מנת להבטיח כי כל התאים מכוסים על ידי פתרון. ניתן להבחין כמות קטנה של DSP לזרז את הפתרון. זה נורמלי.

4. איון של התגובה DSP

1. הכן פתרון מרווה 1X DSP של 20 מ"מ טריס pH 7.4 ב PBS / Ca / Mg (20 μL של 1 M טריס pH 7.4 עבור כל 1 מ"ל של PBS / Ca / Mg).
2. הסר את השליטה ברכב ופתרונות crosslinking.
3. הוסף קר כקרח פתרון איון ו לדגור על קרח במשך 15 דקות.

5. תא תמוגה

1. במהלך הדגירה מרווה DSP, להכין את תמוגה תא חיץ של 0.5% Triton X-100 ב הצפת קוקטייל עם מעכב פרוטאז השלם. הוסף את 20 המניות μL פתרון 50X של השלם עבור כל חיץ מ"ל 1 תמוגה.
2. לאחר דגירה DSP 15 דקות מרווה, לשטוף תאים פעמיים עם PBS / Ca / Mg.
3. הוסף חוצץ תמוגה + השלם תאים אבן על 4 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות. היו שהציעו כרכים של חיץ תמוגה עבור גדלים שונים צלחת:
   • 6 גם 0.5 מ"ל לכל צלחת יפה
   • צלחת 10 ס"מ 1 מ"ל לכל צלחת
   • צלחת 15 ס"מ 1 מ"ל לכל צלחת
4. לאחר תמוגה, השתמש מגרד תא לאסוף את התאים מן הצלחת. הקפד לשמור lysates על קרח כדי למזער את פעילות הפרוטאז
5. תא ספין lysates במשך 15 דקות על 4 מעלות צלזיוס צנטריפוגה מיני הספסל העליון בשיא המהירות (15.000 XG).
6. פיפטה supernatant לתוך צינור טריים. מחק את הכדור.
7. ניתוח רמות החלבון ולהמשיך עם immunoprecipitation.

6. הכנת חיסונית מגנטי חרוזים רטיבות

הערה: שלב זה מתחיל בדרך כלל ישירות לאחר תחילת הדגירה crosslinking 2 שעה.

1. שלב 30 μL של חרוזים immunomagnetic Dynal, 500 μL של הצפת IP (1x הצפת + 0.1% Triton X-100) ואת הכמות המתאימה של נוגדן אנטיגן ספציפי screwtop צינורות microcentrifuge. הכינו נוגדן חופשי ולא ספציפי צינורות נוגדן עבור פקדי שלילית. כמות מתאימה של נוגדנים צריך להיקבע על בסיס אנטיגנים בודדים במהלך ניסויים נפרדים. לייבל כל צינורות IP.
2. אפשר צינורות ה-IP כדי לדגור על כיסא הנדנדה מקצה לקצה מעל בטמפרטורת החדר למשך שעתיים. לחלופין, דגירה צינורות IP עם נוגדן לילה ב 4 מעלות ביום לפני crosslinking.
3. לאחר דגירה, בצע מהיר 10 שניות מיני צנטריפוגה לאסוף את החרוזים בחלק התחתון של הצינור.
4. החלק את צינורות לתוך מחזיק מגנטי, אשר ימשוך את חרוזים מגנטיים הרחק בתחתית הצינור. עם חרוזים בבטחה את הדרך, עכשיו אתה יכול בקלות לשטוף את כל הנוגדנים מאוגד.
5. השתמש טיפ קטן aspirator נשא כגון טיפ ג'ל הטעינה, או p200 עצה כדי להסיר את החיץ הדגירה וכל נוגדן מאוגד. ברגע נפח הדגירה הוא הסיר מוסיפים 1 מ"ל של מאגר ה-IP.
6. שווי הצינור, בעדינות מחדש להשעות את חרוזים, דגירה כל צינורות IP בטמפרטורת החדר במשך 5 דקות עם סיבוב על הקצה לקצה.
7. חזור על שלב 5 דקות לשטוף (שלבים 6.3 עד 6.6) פעם נוספת עם למיליליטר טרייה של מאגר ה-IP.
8. צינורות IP יכולה להישאר הדגירה לשטוף האחרון עד lysate crosslinked מוכן להוסיף את החרוזים.

7. דגירה lysate crosslinked עם חיסונית מגנטי חרוזים

1. אחרי הספין האחרון לשטוף חיסונית מגנטי חרוזים, מטה בצנטריפוגה מיני למשך 10 שניות. ואז להמשיך להחליק את הצינורות לתוך מחזיק מגנטי.
2. שוב, בעזרת טיפ קטן השאיפה לשעמם, להסיר את נפח הדגירה מהצינור. מיד להוסיף 500 μL של lysate תא crosslinked (בהנחה lysate ב 1 מיקרוגרם / מ"ל) של שפופרות המכילות חיסונית מגנטי חרוזים. אם אתה תהיה באמצעות תחרות פפטיד כביקורת שלילית, בסכום המתאים של פפטיד יש לכלול בשלב זה. ניסויים קודמים יש לבצע כדי לקבוע תנאים מתאימים לתחרות פפטיד. לחלופין, ייתכן שתרצה יש lysate חינם חיסונית מגנטי חרוזים כביקורת שלילית. במקרה זה, מיד להוסיף 500 μL של lysate חוצץ (Buffer 1x + 0.5% Triton X-100) + השלם את חיסונית מגנטי חרוזים.
3. Resuspend בעדינות את החרוזים. חרוזים Resuspended צריך להיות מודגרות ב · 4 סיבוב מקצה על קצה למשך 2 שעות.

8. לשטוף lysate מאוגד מן חרוזים

1. לאחר lysate יש לו מספיק זמן הדגירה, לעשות סיבוב מהיר 10 שני צנטריפוגות מיני. ואז להחליק הצינורות לתוך מחזיק מגנטי. בעל המגנטי צריך להישמר באמבט קרח למשך שארית הניסוי.
2. בעזרת טיפ קטן aspirator לשעמם, להסיר את כל lysate מאוגד. מיד לאחר כל lysate מאוגד מוסר להוסיף 1 מ"ל של מאגר ה-IP.
3. שווי הצינור בעדינות resuspend את החרוזים.
4. לאחר חרוזים הם resuspended לחזור על השלב pelleting חרוז (8.1).
5. שוב לשאוב את כל הנפח הדגירה ומיד להוסיף 1 מ"ל של מאגר ה-IP, ואז מכסה את הצינורית.
6. Resuspend בעדינות את החרוזים מאגר ה-IP. דגירה חרוזים resuspended במשך 5 דקות ב · 4 עם נדנדה הקצה על הקצה.
7. חזור על השלבים כביסה חרוז (8.4 עד 8.6) 4 פעמים יותר.

9. לפגל מדגם איסוף מן חרוזים

1. אחרי כל חיסונית מגנטי צינורות משקעים נשטפו, מחדש המשקע חרוזים (8.1) וצינורות להחליק לתוךמגנטי בעל.
2. חלבונים מאוגדים חיסונית מגנטי חרוזים מוסרים ב denaturing תנאים. לשאוב את מאגר ה-IP האחרון לשטוף ולהסיר את צינור ה-IP מבעל מגנטי.
3. הוסף 1x לדוגמה הצפת ג'ל אל צינור ה-IP בדיוק מעל גלולה חרוז לבריכה חרוזים בחלק התחתון של הצינור שוב. כמות חיץ המדגם תלוי בגודל היטב בג'ל לשמש. ייתכן שיהיה עליך לטפוח בעדינות את החלק התחתון של הצינור כדי לקבל את כל החרוזים resuspended במאגר לדוגמה ג'ל.
4. חזור על התהליך denaturing (9.2 עד 9.3) עבור כל צינור ה-IP.
5. חיסונית מגנטי חרוזים resuspended ב הצפת לדוגמה ג'ל מחוממים אז 75 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות כדי להשלים את התהליך denaturing.
6. לאחר המדגם כבר מפוגל ניתן להריץ על ג'ל SDS-PAGE עבור סופג המערבי. רוקנתי חיסונית-Magnetic חרוזים ניתן מחדש על ידי צנטריפוגה pelleted והוציאו מן המדגם עם בעל מגנטי.

10. Elution של מכלולים crosslinked עם פפטידים antigenic (Immunoaffinity כרומטוגרפיה).

1. אחרי כל חיסונית מגנטי צינורות immunoprecipitation נשטפו, מחדש המשקע חרוזים (8.1) וצינורות להחליק לתוך מחזיק מגנטי. לשאוב supernatant ולהוסיף 10 μl של הצפת בתוספת הפפטיד antigenic מוכר על ידי נוגדן המשמש immunoisolation של קומפלקסים חלבונים. אתה צריך לבדוק בריכוזים הנעים 1-20 מיקרומטר עבור elution יעיל.
2. דגירה חרוזים עבור 2 שעות על 4 ° C.
3. שים חרוזים בדוכן מגנטי בזהירות לשחזר את 10 מ"ל של חומר eluted. שמור supernatant.
4. מהר לשטוף את החרוזים עם הצפת וזורקים את הכביסה. שמור את החרוזים.
5. הוסף חוצץ לדוגמה ג'ל כדי supernatant וחרוזים נשמר בריכוז של 1X. דגירה צינורות אלה על 75 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות.
6. ניתוח חרוזים eluate פפטיד על ידי SDS-PAGE. Eluate צריך להיות חופשי של IgG הן על ידי חלבון כתם עמוד SDS או immunoblots (איור 1B). זה חומר ללא IgG מתאים ספקטרומטריית מסה.

באיור 1. בידוד של AP-3 קומפלקסים חלבונים אינטראקציה חלבונים בממברנה. HEK293 תאים (א) או PC12 תאים (ב) טופלו גם בנוכחות של שליטה ברכב (DMSO, מוזר נתיבים איור 1A) או DSP (אפילו נתיבים איור. 1A או כל נתיבים 1B איור). תמציות הבהרה הודגרו עם חרוזים או לבד (איור 1A, Lanes 3-4), נוגדנים transferrin קולטן (איור 1A, Lanes 5-6), או AP-3 נוגדנים δ (איור 1A, Lanes 7-10; איור . 1B, נתיבי 10-10). מתחמי החיסון היו eluted עם חיץ SDS-PAGE מדגם (איור 1A), הצפת לבד או (איור 1B, 1-2 נתיבים), או הצפת בתוספת ריכוזי הגוברת של הפפטיד antigenic δ המתאים חומצות אמינו 680 710 של האדם δ-adaptin (צמח השדה: AAD03777; gi: 1923266) (איור 1B, נתיבי 30-10). פפטיד זה נקשר הנוגדן δ. לאחר elution פפטיד, supernatants (S) וחרוזים (ב) נותחו על ידי immunoblot (איור 1B). AP-3, אשר מזוהה עם נוגדנים נגד δ, β3 ו σ3 יחידות משנה, coprecipitates עם גורמים מסיסים הבאים: שרשרת כבדה clathrin (CHC), גוש-1 pallidin למקטע, ואת vps33b דילוגים למקטע מורכבות, כמו גם הממברנה חלבונים phosphatidylinositol-4-kinase מסוג II אלפא (PI4KIIα) ואת טרנספורטר אבץ 3 (ZnT3). הערה היעדר רשתות IgG עכבר כבד הפפטיד eluted supernatant באיור. 1B.

DSP, קרום חדיר, crosslinker לצמצם כימית עם זרוע spacer של 12 משמש לייצוב אינטראקציות חלבון חולף ^1,2,3,4. כאן אנו שהודגם אסטרטגיה זו מורכבת מתאם AP-3 מורכב חלבון מסיס שמכירה וממיין חלבונים בממברנה לתוך שלפוחית ​​מ endosomes ^5. AP-3 נקשר באופן סלקטיבי טרנספורטר אבץ ZnT3 ואת השומנים phosphatidylinositol kinase-4-kinase מסוג II אלפא אך לא קולטן transferrin ^1,4,6. הרחבנו את התצפיות הללו לזיהוי של רשת אינטראקציה AP-3 חלבונים של חלבונים בממברנה וגורמים cytosolic ידי ספקטרומטריית מסה ^1. משקעים נמוכה חיסונית מגנטי רקע כדלקמן crosslinking לזהות חלבונים אינטראקציה. יתר על כן קטלוג שפורסם של חלבונים הנקשרים הלא סלקטיבי חרוזים מגנטיים מאפשרת חיסול לעבור הראשון של בידוד הלא ספציפית לחלבון וזיהוי על ידי ספקטרומטריית מסה ^7. DSP-reactive מנצל אמין קבוצות אסתר לקשר אמינים העיקרי כגון lysines או הסופית של חומצות אמינו וחלבונים. עם התנאים denaturing, המולקולה DSP הוא חצוי לשניים, ומשאיר קבוצות כימיות קצר על חומצות אמינו מקושרים. עבור אנטיגנים מסוימים יש ירידה אותות immunoreactivity ידי immunoblot כאשר משווים בין שווים המון חלבון DMSO מלאה תאים שטופלו DSP (Figure1A). ייתכן כי ירידה זו תוצאות מתוך זיקה נוגדן ירד ב DSP שונה lysines. מלבד אלה מקרים נדירים, שימוש crosslinking כימיים DSP משפר את היכולת לזהות קרום הקשורים באינטראקציה מקרוב חלבונים.

חלבונים או חלבונים הקשורים מתחמי שולי עם העלון cytosolic של ממברנות, כגון AP-3 הם נקודתיים כדי ממברנות בטמפרטורות דגירה נורמלי של 37 ° C. עם זאת, בטמפרטורת החדר של 15-20 מעלות צלזיוס המורכב-3 AP לאט מפיץ מחדש את cytosol. לפיכך, על מנת ללכוד אינטראקציות בין AP-3 ו הממברנה הקשורים חלבונים, הטמפרטורה הפנימית של תאים אלה חייב להיות מקורר במהירות 4 ° C. הדרך הטובה ביותר להשיג זאת היא 1) יש את כל מאגרי דוגרים באמבט קרח לפני הסרת תאים של 37 ° C חממה, 2) כדי להסיר לאלתר את כל התקשורת חם מהצלחת של תאים ולהחליף חיץ קרח קר, 3) כדי לשמור על תאים תלויה על באמבט קרח עבור מכלול הניסוי crosslinking.

DSP אינו מסיס במים ולכן הפתרון להתחממות PBS / Ca / Mg על 37 מעלות צלזיוס לפני התוספת של פתרון DSP / DMSO רצוי. עם זאת, מאז התאים את הצורך לשמור על טמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס, הפתרון crosslinking DSP צריך להיות ממוקם באמבט קרח פעם את DSP הוא solubilized לחלוטין. אם DSP אינו solubilized לחלוטין כמויות גדולות של המשקע יהוו כפתרון מתקרר (כמות קטנה של משקעים נורמלי). אם כמות גדולה של משקעים מתרחשת, נסה את הפתרון חימום בחזרה 37 ° C עבור solubilization recool מלאה. אם DSP שוב ושוב נופל מתוך פתרון, ייתכן שיהיה עליך להכין פתרון crosslinking טריים. ההסרה המהירה של DSP מפתרון בשל solubilization שלם לא צריך להיות מבולבל עם הקמת איטי של שכבת גבישי המופיע הבארות של תאים שטופלו DSP. הנוכחות של שכבה זו גבישי DSP לא להפריע התגובה cross-linking בתאים.

עבודה זו נתמכה על ידי מענקים מהמוסד הלאומי לבריאות בארה"ב כדי VF (NS42599 ו GM077569).