由不稳定的多蛋白质复合物的分离在体内控制细胞的交联和免疫磁性亲和层析

细胞透水交联剂DSP [dithiobis（琥珀酰亚胺丙酸）]稳定短暂和不稳定的相互作用在体内，这使得他们的隔离，使用严格的蛋白质复合体的净化技术。在这里，我们目前培养的交联，由免疫蛋白复合物的分离细胞的技术。

蜂窝机械的动态性质经常是建立在瞬态和/或弱蛋白协会。这些低亲和力相互作用排除围绕一个感兴趣的蛋白质，蛋白质网络的隔离和识别的严格方法。使用化学交联剂允许的不稳定相互作用的选择性稳定，从而绕过生化净化的局限性。在这里，我们提出在文化协议细胞适合使用一个homobifunctional交联剂间隔臂12埃，dithiobis（琥珀proprionate）（DSP）。 DSP是一个分子中的二硫键还原裂解。交联与磁珠的利益的蛋白质与免疫层析相结合，使蛋白质复合物，否则将不能承受净化隔离。此协议是与常规免疫印迹技术兼容，它可以扩展为蛋白质鉴定的质谱^1。

斯蒂芬妮A. Zlatic和珠江五莱德贡献同样对这项工作。

1。准备交联

1. 您将需要板足够数量的细胞，让500微克每标准管反应蛋白的隔离。单管可能足以确定一个由免疫印迹的兴趣的蛋白质公认interactors。在这种情况下，珠约束的材料可以用SDS - PAGE样品缓冲液（免疫）洗脱。标准反应质谱分析，应增加至少十倍，应使用的抗体（免疫亲和层析）认可的一种肽类抗原竞争洗脱的蛋白质复合物。这一战略将让免疫球蛋白的蛋白质复合物的隔离。
2. 交联的最佳细胞密度是75％至90％汇合。在高汇合条件下，细胞往往桩上对方，从而降低所有细胞的细胞渗透交联剂的无障碍。
3. 细胞类型和实验条件下，应标示单元板的底部。我们通常包括仅与车辆控制。
4. 除了DSP解决方案，以交联前的所有准备解决方案。
   1. 氯化钙₂ 0.1毫米和氯化钙₂ 1毫米（PBS / CA /镁）开始实验前准备的磷酸盐缓冲液缓冲库存。除了钙，镁离子是细胞在实验过程中培养板的附着力的关键。保存在4 ° C。
   2. 50X完整的蛋白酶抑制剂 - 1ML Milli - Q水溶解1片。储存在-20 ° C。
   3. 20％的Triton X - 100的重量了10G TRITON X -100和稀释在50毫升Milli - Q水的总量。岩石在4 ° C过夜，并储存于4 ° C直到使用。不要存放超过1个月。使用这20％的股份稀释，以准备下面描述的缓冲区的裂解和IP。
   4. 50X DSP淬火液1M的TRIS pH至7.4。在室温下储存。
   5. 准备一个10X缓冲的解决方案。
      10X缓冲液A：
      • 50毫升1 M羟乙基
      • 150毫升5 M氯化钠
      • 10毫升0.5 M的EGTA
      • 250μL2 M MgCl _2的
      • 调整pH值至7.4
      • 使终体积为500毫升
      10X缓冲液A液稀释至1X缓冲液A的需要。
      1X缓冲液A也可用于裂解液和免疫磁性沉淀缓冲区。
      缓冲区一个1X
      • 10毫米HEPES
      • 150 mM氯化钠
      • 1 mM的EGTA
      • 0.1毫米氯化镁₂
      • pH值7.4
   6. 裂解缓冲液1X缓冲液A + 0.5％Triton X - 100的的。
   7. 免疫磁性沉淀缓冲液（IP缓冲区）1X缓冲液A + 0.1％Triton X - 100的的。

2。准备交联解决方案

1. 立即准备申请前到细胞的DSP解决方案。 DSP是疏水性极强，并应在DMSO溶解在PBS / CA /镁缓冲液稀释。在1 DMSO溶液溶解40毫克的DSP。这使得DSP（DSP分子量是404.42克/摩尔）100毫米的解决方案。
2. 适当体积的PBS /钙/镁预热至37 ° C，以便PBS稀释的DSP / DMSO。
   各类钢板尺寸所需的卷：
   6孔板，每孔2 mL的
   10厘米的盘每盘10毫升
   15厘米盘每盘20毫升
3. 新增每1毫升的温暖PBS /钙/镁的DSP / DMSO原液10μL。添加DSP /二甲基亚砜原液下降下降，反复搅拌，直到所有的DSP已经解散。请控制解决方案，每1毫升的PBS /钙/镁添加到10μL二甲基亚砜。
4. 放置在一个冰水浴中，超过10分钟不再所有PBS / CA /镁的解决方案。

3。为交联细胞做准备

1. 准备一个冰水浴中，将适合所有板块交联或车辆控制孵化。
2. 从37℃培养箱中培养板，并立即放入冰水浴。
3. 洗涤细胞两次，用冰冷的PBS / CA /镁。使用相同的音量，你将使用（见2.2节）为交联剂孵化。
4. 删除第二次清洗和新增车辆的控制或DSP交联缓冲液中。
5. 在冰上培育了两个小时。您应该检查板块大约每隔20分钟，以确保所有细胞都被溶液覆盖。您可能会注意到一个DSP少量沉淀出的解决方案。这是正常的。

4。灭活DSP的反应

1. 准备一个20毫米的Tris pH值7.4的PBS / CA /毫克（每1毫升的PBS /钙/镁20μL的1 M Tris pH值7.4）的1X DSP淬火液。
2. 删除对车辆的控制和交联的解决方案。
3. 添加冰冷的灭活解决方案，并在冰上孵育15分钟。

5。细胞裂解

1. DSP淬火孵化期间，准备了0.5％的Triton X - 100的缓冲区中一个完整的蛋白酶抑制剂的鸡尾酒的细胞裂解液。添加完成每1 mL裂解缓冲液20μL50X原液。
2. 经过15分钟的DSP淬火孵化，洗涤细胞，用PBS /钙/镁两次。
3. 30分钟，加入裂解液+完整细胞和岩石在4 ° C。有人建议裂解液量为各类板材大小：
   • 6孔板，每孔0.5毫升
   • 10厘米的板1毫升每盘
   • 15厘米板每板1毫升
4. 裂解后，使用细胞刮刀收集板的细胞。一定要保持在冰上裂解液，以尽量减少蛋白酶活性
5. 以最快的速度（15.000 XG）在台式迷你离心机旋转细胞裂解液15分钟，在4 ° C。
6. 移取上清液到一个新管。弃去沉淀。
7. 分析蛋白质水平，并进行免疫。

6。准备免疫磁性沉淀珠

注意：这一步通常是直接开始后2个小时的交联孵化开始。

1. 结合30μLDYNAL免疫磁珠，IP缓冲区的500μL（1X缓冲液+ 0.1％TRITON X - 100）和适量的抗原特异性抗体screwtop离心管。准备抗体和非特异性抗体管为阴性对照。适量的抗体应确定在不同的实验中，基于个人抗原。标签的所有IP管。
2. 允许的IP管，在最终结束两个小时摇杆，在室温孵育。此外，孵化与抗体的IP管一夜之间在4 °一天前交联。
3. 孵化后，做一个快速10秒的微型离心收集在试管底部珠。
4. 磁持有人，这将拉动磁珠离试管底部滑入管。珠安全的方式，你现在可以轻松洗去任何未结合的抗体。
5. 使用凝胶加载提示，或P200提示要删除孵化缓冲区和任何未结合抗体，如小口径抽吸提示。孵化量只要删除添加1毫升IP缓冲区。
6. 第管，轻轻地重新暂停的珠子，并在室温下孵育5月底结束旋转分钟的所有IP管。
7. 重复的5分钟的清洗步骤（步骤6.3通过6.6）再次与IP缓冲区的新鲜毫升。
8. 知识产权管可以留在最后一次洗涤孵化，直到交联裂解液已准备好要加入的珠子。

7。与免疫磁珠孵育交联裂解液

1. 最后洗自旋免疫磁珠后，倒在了10秒的迷你离心机。然后继续滑入磁座管。
2. 同样，使用小口径的愿望提示，删除从管的孵化量。立即加入500μL交联的细胞裂解液（假设在1μg/ mL的裂解）含有免疫磁珠管。如果您将使用适量的肽作为阴性对照肽竞争，应包括在这一点上。应执行先前的实验，以确定适当的肽竞争条件。此外，您可能需要有裂解免费免疫磁性珠作为阴性对照。在这种情况下，立即加入500μL的细胞裂解缓冲液（1X缓冲液A + 0.5％TRITON X - 100）+完整的免疫磁珠。
3. 轻轻重悬珠。悬浮珠应在4℃孵育在年底结束旋转2小时。

8。从珠清洗不作承诺裂解液

1. 一旦裂解液有足够的孵化时间，做一个快速10日在一个小型离心机的第二个旋转。然后将管进入磁场的持有人。磁持有人应保持在冰浴其余实验。
2. 使用小口径抽吸提示，删除所有未绑定的裂解。所有未绑定的裂解液后立即被删除，添加1毫升IP缓冲区。
3. 第管，轻轻重悬珠。
4. 一旦重悬珠重复珠造粒步骤（8.1）。
5. 再次吸了所有的孵化量，并立即加入1毫升IP缓冲区，然后盖管。
6. 轻轻重悬在IP缓冲区的珠子。孵育5分钟，在4月底结束摇摆°重悬珠。
7. 重复洗涤步骤珠（8.4至8.6）4次以上。

9。变性样品，收集从珠

1. 免疫磁性降水管都被冲走后，再沙珠（8.1）和幻灯片管到磁持有人。
2. 绑定的免疫磁珠蛋白在变性条件下被删除。吸了最后一个IP缓冲液洗和删除的磁座的IP管。
3. 添加1X凝胶上样缓冲液珠沉淀池珠再次在试管底部的正上方的IP管。样品缓冲液量取决于要使用的凝胶以及大小。您可能需要轻轻敲击试管底部，在凝胶上样缓冲液重悬珠。
4. 重复的变性过程（9.3至9.2）为每个IP管。
5. 凝胶上样缓冲液悬浮的免疫磁珠，然后加热至75 ° C时5分钟才能完成的变性过程。
6. 一旦样品已变性，它可以在一个SDS - PAGE凝胶免疫印迹。清空免疫磁珠可以重新沉淀，离心和从样品磁座中删除。

10。洗脱的抗原肽交联复合物（免疫亲和层析）。

1. 所有的免疫磁性免疫管后已经洗干净，重新沙珠（8.1）和磁持有人的幻灯片管。吸上清，加10的缓冲液，一个补充用于蛋白质复合物的免疫隔离的抗体识别的抗原肽。您应该测试浓度为有效洗脱从10-200微米不等。
2. 育珠2小时，4 ° C。
3. 将磁珠在磁场的立场，并仔细收回10毫升洗脱材料。保存这个上清。
4. 快速用缓冲液A的珠子和丢弃洗。保存的珠子。
5. 凝胶上样缓冲液保存的上清液和珠，加入到1X浓度。这些管子在75℃5分钟孵育。
6. 珠和肽洗脱液经SDS - PAGE分析。洗脱液应IgG的蛋白质的SDS - PAGE染色或免疫印迹（图1B）。这种材料的IgG是适合于质谱。

图1。 AP - 3相互作用蛋白复合物和膜蛋白的分离 。HEK293细胞（A）或PC12细胞（二）在处理控制车辆的存在（DMSO，奇的车道图1A）或DSP（甚至车道图。 1A或全部车道图1B）。澄清提取物孵育单独珠（图1A，泳道3-4），转铁蛋白受体抗体（图1A，泳道5-6），或AP - 3（图1A，泳道7-10δ抗体;图1B，车道1-10）。免疫复合物，用SDS - PAGE样品缓冲液（图1A）洗脱，一个单独的缓冲区（图1B，泳道1-2），或缓冲δ抗原肽浓度的增加，相应的680 710个氨基酸的补充人类δadaptin（NCBI的：AAD03777; GI：1923266）（图1B，车道3-10）。这种肽结合的δ抗体。肽洗脱后，上清液（S）和珠（二）免疫印迹分析（图1B）。 AP - 3，这是对δ，β3和σ3亚基抗体的检测，可溶性以下因素：网格蛋白重链（CHC），欧盟1亚基pallidin，和啤酒花复杂的亚基vps33b;以及coprecipitates膜蛋白磷酸肌醇- 4 -激酶II型α（PI4KIIα）和锌转运体3（ZnT3）。注意鼠标肽抗体重链的情况下洗脱图上清。 1B。

DSP，膜渗透，化学还原与12 Å间隔臂的交联剂是用来稳定瞬态蛋白质^相互作用 1,2,3,4 。在这里，我们体现这一战略与AP - 3适配器复杂的一种可溶性蛋白复合物，囊泡膜蛋白识别和排序，从内涵^体 5 。 AP - 3的选择性结合的锌转运ZnT3和脂质激酶磷酸肌醇4激酶II型阿尔法但不转铁蛋白^受体 1,4,6 。我们扩大了这些意见，以确定^质谱 1膜蛋白和胞质因素AP - 3蛋白的相互作用网络。低背景免疫磁性降水量如下，以确定相互作用的蛋白质的交联。此外，非选择性磁珠的蛋白质结合的出版目录，允许一个非特定的蛋白质的分离和鉴定^的第一关，消除质谱7。 DSP采用胺反应的酯基，伯胺，如赖氨酸或蛋白质的氨基酸总站链接。变性条件后，DSP分子裂解一半，留下联系在一起的氨基酸短的化学基团。对于某些抗原有免疫印迹在免疫信号减少二甲基亚砜控制和DSP处理的细胞（Figure1A）之间比较平等的蛋白质负荷时。这是可能的，在DSP的抗体的亲和力下降，下降的结果修改赖氨酸。除了这些罕见的情况下，使用DSP的化学交联，提高了检测能力密切相互作用的膜相关蛋白。

蛋白质或蛋白质复合体边缘与胞浆膜单张，如AP - 3，本地化膜在正常孵化温度37 ° C。然而，在室温15-20 ° C时，AP - 3复杂慢慢地重新分配到细胞质。因此，为了捕捉到AP - 3和膜相关蛋白之间的相互作用，这些细胞内部温度必须迅速冷却至4 ° C。做到这一点的最佳方式是：1）所有在冰浴中进行孵化之前，从37℃的孵化器，2卸下细胞）的缓冲区，立即删除所有温暖的媒体，从细胞板，取代冰冷的缓冲区，并3）保持细胞暂停全部交联实验的冰浴。

DSP是不溶于水，从而变暖PBS / CA / mg的溶液至37℃前除了DSP / DMSO溶液是可取的。然而，由于细胞需要保持的4 ° C的温度，DSP交联解决方案应放置在冰浴一旦DSP是完全溶解。如果DSP没有完全溶解，会形成大量的沉淀，溶液冷却（少量的沉淀是正常的）。如果出现大量的降水，加热至37 ° C的完整的增溶和recool解决方案。如果DSP多次掉下来的解决方案，你可能需要准备新鲜的交联解决方案。 DSP的解决方案由于不完整的增溶，快速去除不应该混淆缓慢形成一个结晶层出现在DSP处理的细胞井。这个DSP的结晶层的存在并不妨碍在细胞中的交联反应。

这项工作是支持的美国国立卫生研究院的VF（NS42599和GM077569）的赠款。