عزل بروتين المجمعات المتعددة التي كتبها عطوب في الجسم الحي الشواهد الخلوية عبر ربط والمناعة المغناطيسي اللوني التقارب

نفاذية الخلية crosslinker DSP [dithiobis - (succinimidyl بروبيونات)] تستقر تفاعلات عابرة وعطوب في الجسم الحي ، والذي يسمح باستخدام صارمة عزلتهم تقنيات تنقية البروتينات المعقدة. هنا نقدم تقنية للخلايا المزروعة في الثقافة يشابك تليها عزل بروتين مناعي المجمعات.

بنيت في كثير من الأحيان الطابع الدينامي للأجهزة الخلوية في الجمعيات عابرة البروتين و / أو ضعيفة. هذه التفاعلات تقارب منخفضة تمنع أساليب صارمة لعزل وتحديد شبكات البروتين البروتين حول المصالح. استخدام المواد الكيميائية crosslinkers يسمح للاستقرار انتقائية من التفاعلات عطوب ، وبالتالي تجاوز القيود البيوكيميائية لتنقية. هنا نقدم بروتوكول قابلة للخلايا في ثقافة يستخدم crosslinker homobifunctional مع الذراع هل من 12 (أ) ، dithiobis - (succinimidyl proprionate) (DSP). هو المشقوق DSP بتخفيض ثاني كبريتيد السندات الموجودة في الجزيء. عبر ربط جنبا إلى جنب مع اللوني immunoaffinity من البروتينات في المصالح مع الخرز المغناطيسي يسمح للعزل بروتين المجمعات التي لولاها لا يتحمل تنقية. هذا البروتوكول هو متوافق مع التقنيات العادية لطخة غربية ويمكن زيادتها الامر لتحديد البروتين مطياف الكتلة ^1.

ساهم ستيفاني ألف Zlatic واللؤلؤ رايدر خامسا على قدم المساواة في هذا العمل.

1. التحضير ليشابك

1. سوف تحتاج إلى لوحة جود عدد كاف من الخلايا للسماح للعزلة من 500 ميكروغرام من البروتين لكل فعل أنبوب القياسية. ويجوز للأنبوب واحد يكون كافيا لتحديد interactors المفترضة من البروتين من الفائدة طخة مناعية. ويمكن في هذه الحالة تكون ملزمة eluted حبة المواد العازلة مع عينة SDS - PAGE (مناعي). للتحليل الطيفي ، ينبغي زيادة عدد قياسي من ردود الفعل ما لا يقل عن عشر مرات ، وينبغي eluted مجمعات البروتين عن طريق المنافسة التدريجي مع مستضد الببتيد معترف بها من قبل الأجسام المضادة المستخدمة (immunoaffinity اللوني). وهذه الاستراتيجية تسمح للعزلة المجمعات خالية من البروتين المناعي.
2. كثافة الخلية المثلى ليشابك بين 75 ٪ و 90 ٪ confluency. في ظروف confluency عالية ، وتميل إلى كومة الخلايا على بعضها البعض ، مما يقلل إمكانية الوصول إلى الخلايا crosslinker نفاذا إلى كافة الخلايا.
3. ينبغي أن توضع على نوع من الخلايا وحالة تجريبية على الجزء السفلي من لوحة الخلية. نحن تشمل الضوابط بشكل روتيني مع السيارة وحدها.
4. إعداد جميع الحلول باستثناء الحل DSP قبل يشابك.
   1. إعداد مخزون من الفوسفات مخزنة المالحة العازلة مع 0.1 ملي CaCl ₂ و CaCl ₂ 1 ملم (PBS / كا / ملغ) قبل بدء التجربة. إضافة أيونات الكالسيوم والمغنيسيوم هو أمر حاسم لالتصاق الخلايا إلى لوحة الثقافة أثناء التجربة. المحل في 4 درجات مئوية.
   2. 50X المانع البروتياز أكمل كوكتيل -- 1 قرص المذاب في الماء الملة - Q 1mL. المحل في -20 درجة مئوية.
   3. 20 ٪ تريتون X - 100 X زن خارج 10G -100 تريتون وتمييع في الحجم الكلي للمياه 50 ملي - Q مل. صخرة في 4 درجات مئوية خلال الليل وتخزينها في 4 درجات مئوية حتى الاستخدام. لا تقم بتخزين أكثر من 1 في الشهر. التخفيفات استخدام هذا المخزون بنسبة 20 ٪ لإعداد مخازن تحلل والملكية الفكرية هو موضح أدناه.
   4. 50X الحل الرواية DSP 1M TRIS إلى الرقم الهيدروجيني 7.4. تخزين في درجة حرارة الغرفة.
   5. يعد حل مؤقت 10X.
      10X الاحتياطي A :
      • 50 مل 1 م HEPES
      • 150 مل 5 M كلوريد الصوديوم
      • 10 مل 0.5 M EGTA
      • ميكرولتر 250 2 م ₂ MgCl
      • ضبط الرقم الهيدروجيني إلى 7.4
      • يصل حجم النهائية الى 500 مل
      الاحتياطي 10X هو تمييع الحل ل1X الاحتياطي وحسب الحاجة.
      1X الاحتياطي يستخدم أيضا في lysate ومخازن المناعية المغناطيسي هطول الأمطار.
      العازلة و1X
      • 10 ملي Hepes
      • 150 مم كلوريد الصوديوم
      • 1 ملم EGTA
      • 0.1 ملم MgCl ₂
      • الرقم الهيدروجيني 7،4
   6. الاحتياطي تحلل 1X الاحتياطي A + 0.5 ٪ تريتون X - 100.
   7. المناعية المغناطيسي الاحتياطي الأمطار (الاحتياطي IP) 1X الاحتياطي A + 0.1 ٪ تريتون X - 100.

2. إعداد الحل يشابك

1. إعداد الحل DSP على الفور قبل التقدم إلى الخلايا. DSP هو مسعور للغاية وينبغي حلها قبل DMSO في تمييع في برنامج تلفزيوني / كا / المغنيسيوم العازلة. حل 40 ملغ من حزب اليسار الديمقراطى فى 1 مل من DMSO. هذا يجعل من الحل 100 ملم من DSP (والوزن الجزيئي لحزب اليسار الديمقراطى هو 404.42 جم / مول).
2. الدافئة وحدة تخزين مناسبة من الكالسيوم / PBS / ملغ إلى 37 درجة مئوية وذلك لتسهيل التخفيف من حزب اليسار الديمقراطى / DMSO في برنامج تلفزيوني.
   وحدات التخزين اللازمة لوحة متنوعة الأحجام :
   6 كذلك لوحة 2 مل لكل بئر
   10 سم في 10 مل لوحة لوحة
   15 سم في 20 مل لوحة لوحة
3. إضافة 10μL من محلول المخزون DSP / DMSO لكل مليلتر من 1 PBS دافئة / كا / المغنيسيوم. إضافة DSP / DMSO قطرة قطرة محلول المخزون مع الخلط حتى تتكرر كل DSP قد حلت. جعل حل السيطرة على 10 ميكرولتر DMSO إضافة إلى كل مل 1 من PBS / كا / المغنيسيوم.
4. وضع كافة الحلول PBS / كا / المغنيسيوم في حمام جليد الماء لا تزيد عن 10 دقيقة.

3. تحضير لخلايا يشابك

1. يعد حمام مياه الجليد التي تناسب جميع لوحات ليشابك أو مركبة حضانة السيطرة.
2. تأخذ لوحات من الحاضنة 37 درجة مئوية ووضعها مباشرة في حوض الاستحمام في المياه الجليدية.
3. غسل الخلايا مرتين مع الثلج الباردة PBS / كا / المغنيسيوم. استخدام نفس وحدة التخزين التي ستستخدمها للحضانة crosslinker (انظر القسم 2.2).
4. إزالة غسل الثانية وإما إضافة أو السيطرة على السيارة DSP حل يشابك العازلة.
5. احتضان على الجليد لمدة ساعتين. يجب التحقق من لوحات كل ما يقرب من عشرين دقيقة لضمان تغطية جميع الخلايا عن طريق الحل. قد تلاحظ كمية صغيرة من DSP تترسب من الحل. هذا أمر طبيعي.

4. إهماد من رد الفعل DSP

1. يعد التبريد DSP 1X حل من 20 درجة الحموضة 7.4 ملي تريس في برنامج تلفزيوني / كا / مغ (20 ميكرولتر من 1 الحموضة تريس M 7.4 مل لكل 1 من PBS / كا / ملغ).
2. إزالة السيطرة على السيارة والحلول يشابك.
3. إضافة الثلج الباردة تعطيل الحل واحتضان على الجليد لمدة 15 دقيقة.

5. انحلال الخلايا

1. أثناء الحضانة تبريد DSP ، وإعداد العازلة تحلل الخلية من 0.5 ٪ تريتون X - 100 في مخزن جواب مع اكتمال البروتيني كوكتيل المانع. إضافة 20 ميكرولتر من محلول المخزون 50X كاملة عن كل العازلة 1 مل تحلل.
2. بعد 15 دقيقة حضانة تبريد DSP ، وغسل خلايا مرتين مع PBS / كا / المغنيسيوم.
3. إضافة عازلة + تحلل الخلايا والكامل لموسيقى الروك في 4 درجات مئوية لمدة 30 دقيقة. واقترح بعض مجلدات من تحلل العازلة لوحة بأحجام متنوعة :
   • 6 كذلك لوحة 0.5 مل لكل بئر
   • 10 سم لكل لوحة لوحة 1 مل
   • 15 سم لكل لوحة لوحة 1 مل
4. بعد انحلال ، واستخدام مكشطة خلية لجمع الخلايا من لوحة. ومن المؤكد أن تبقي lysates على الجليد للحد من نشاط الأنزيم البروتيني
5. خلية تدور lysates لمدة 15 دقيقة على 4 درجات مئوية في جهاز للطرد المركزي مصغرة مقاعد البدلاء في أعلى سرعة أعلى (15،000 XG).
6. ماصة وطاف في أنبوب جديد. تجاهل بيليه.
7. تحليل مستويات بروتين مناعي والمضي قدما.

6. إعداد الخرز الأمطار المناعي المغناطيسي

ملاحظة : عادة ما يبدأ هذه الخطوة مباشرة بعد بداية تفريخ يشابك 2 ساعة.

1. تجمع 30 ميكرولتر من الخرز immunomagnetic Dynal ، 500 ميكرولتر من الاحتياطي الملكية الفكرية (1X الاحتياطي A + 0.1 ٪ تريتون X - 100) وكمية مناسبة من الأجسام المضادة للمستضد معين screwtop أنابيب microcentrifuge. تعد خالية من الأجسام المضادة والأجسام المضادة أنابيب غير محددة لعناصر سلبية. وينبغي تحديد المبلغ المناسب للجسم على أساس مستضدات الفردية خلال تجارب منفصلة. تسمية جميع أنابيب IP.
2. السماح للأنابيب IP لاحتضان في نهاية الروك خلال نهاية في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعتين. بدلا من ذلك ، احتضان أنابيب IP مع الأضداد بين عشية وضحاها في 4 درجات اليوم قبل يشابك.
3. بعد الحضانة ، قيام 10 ثانية سريعة مصغرة الطرد المركزي لجمع حبات في الجزء السفلي من الأنبوب.
4. الشريحة الأنابيب في حامل المغناطيسي ، والتي سوف يسحب حبات مغناطيسية بعيدا عن الجزء السفلي من الأنبوب. مع حبات بأمان بعيدا عن الطريق ، ويمكنك الآن يغسل بسهولة بعيدا أي جسم غير منضم.
5. استخدام غيض الشافطة صغيرة تحمل مثل هلام غيض التحميل ، أو P200 تلميح لإزالة أي العازلة الحضانة والضد غير منضم. حالما تتم إزالة وحدة التخزين في حضانة إضافة 1 مل من الاحتياطي الملكية الفكرية.
6. غطاء الأنبوب ، بلطف إعادة تعليق الخرز ، واحتضان جميع أنابيب الملكية الفكرية في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق مع نهاية الإفراط في نهاية التناوب.
7. كرر الخطوة غسل 5 دقائق (6.3 الخطوات من خلال 6.6) مرة أخرى مع ملليلتر جديدة من الاحتياطي الملكية الفكرية.
8. لا يمكن للأنابيب IP البقاء في حضانة تستمر حتى يغسل lysate crosslinked مستعدة لتضاف إلى الخرز.

7. احتضان Lysate Crosslinked المناعي مع الخرز المغناطيسي

1. بعد غسل حبات مشاركة المناعية تدور المغناطيسي ، بانخفاض في جهاز للطرد المركزي مصغرة لمدة 10 ثانية. ثم الشروع في زلة الأنابيب في حامل المغناطيسي.
2. مرة أخرى ، وذلك باستخدام معلومات سرية صغيرة تحمل الطموح ، وإزالة حجم الحضانة من الأنبوب. إضافة على الفور 500 ميكرولتر من lysate الخلية crosslinked (على افتراض lysate في 1 ميكروغرام / مل) للأنابيب تحتوي المناعية المغناطيسي الخرز. إذا كنت ستقوم باستخدام الببتيد المنافسة كعنصر تحكم السلبية ، ينبغي إدراج مبلغ مناسب من الببتيد في هذه النقطة. وينبغي إجراء التجارب السابقة لتحديد الظروف الملائمة المنافسة الببتيد. بدلا من ذلك ، قد كنت تريد أن يكون lysate مجانا المناعية المغناطيسي الخرز كعنصر تحكم سلبية. في هذه الحالة ، إضافة على الفور 500 ميكرولتر من الاحتياطي Lysate (1X الاحتياطي A + 0.5 ٪ تريتون X - 100) + الكامل لحبات المناعية المغناطيسي.
3. resuspend بلطف الخرز. وينبغي المحتضنة الخرز معلق في 4 درجات في نهاية التناوب على نهاية مدة 2 ساعة.

8. غسل Lysate غير منضم من الخرز

1. مرة واحدة كان كافيا lysate فترة حضانة ، لا وسيلة سريعة الدوران 10 ثانية في جهاز للطرد المركزي المصغر. الشريحة ثم الأنابيب في حامل المغناطيسي. يجب أن تبقى حامل المغناطيسي في حمام الجليد للفترة المتبقية من هذه التجربة.
2. باستخدام الشافطة صغيرة تحمل الطرف ، وإزالة جميع lysate غير منضم. مباشرة بعد إزالة كافة lysate غير منضم إضافة 1 مل من الاحتياطي الملكية الفكرية.
3. غطاء الأنبوب وresuspend بلطف الخرز.
4. بمجرد معلق حبات كرر الخطوة التكوير حبة (8.1).
5. نضح مرة أخرى قبالة كل من حجم الحضانة فورا وإضافة 1 مل من الاحتياطي الملكية الفكرية ، وكأب ثم الأنبوب.
6. resuspend بلطف حبات في الاحتياطي الملكية الفكرية. احتضان الخرز معلق لمدة 5 دقائق على 4 درجات مع نهاية الإفراط في نهاية هزاز.
7. كرر الخطوات حبة الغسيل (8.4 من خلال 8.6) 4 مرات أكثر.

9. تفسد العينة وجمع من الخرز

1. بعد أن تم غسلها كل من أنابيب الأمطار المناعية المغناطيسي ، وإعادة الرواسب الخرز (8.1) وأنابيب الانزلاق إلىحامل المغناطيسي.
2. تتم إزالة البروتينات منضمة إلى حبات المناعية المغناطيسي في تغيير طبيعة الظروف. نضح قبالة مخزن IP مشاركة غسل وإزالة أنبوب IP من حامل المغناطيسي.
3. إضافة 1X الاحتياطي نموذج جل في أنبوب IP فقط فوق حبة بيليه لتجميع حبات في الجزء السفلي من الأنبوب مرة أخرى. كمية العازلة عينة يعتمد على حجم جيد من هلام لاستخدامها. قد تحتاج للاستفادة بلطف أسفل أنبوب للحصول على كل من الخرز معلق في جل الاحتياطي نموذج.
4. تكرار عملية تغيير طبيعة (9.2 من خلال 9.3) لكل أنبوب IP.
5. يتم تسخينها ثم المناعية المغناطيسي الخرز معلق في مخزن نموذج في جل 75 درجة مئوية لمدة 5 دقائق لإكمال عملية تغيير طبيعة.
6. بمجرد العينة التشويه والتحريف ويمكن تشغيله على جل SDS - PAGE لالنشاف الغربية. ويمكن تفريغ المناعة المغناطيسي الخرز يعاد مكعبات بواسطة الطرد المركزي وإزالتها من العينة مع حامل المغناطيسي.

10. شطف من المجمعات Crosslinked مع هضميدات الأنتيجين (Immunoaffinity اللوني).

1. بعد كل من أنابيب مناعي المناعية المغناطيسي قد تم غسلها وإعادة الرواسب الخرز (8.1) وأنابيب انزلاق حامل المغناطيسي. نضح طاف وإضافة 10 ميكرولتر من الاحتياطي وتستكمل مع الببتيد مستضدي معترف بها من قبل الأجسام المضادة المستخدمة في المجمعات immunoisolation البروتين. يجب اختبار تركيزات تتراوح بين 1-20 ميكرومتر لشطف كفاءة.
2. احتضان حبات لمدة 2 ساعة عند 4 درجات مئوية.
3. وضع الخرز في الوقوف واسترداد المغناطيسي بدقة 10 مل من المواد eluted. حفظ هذا طاف.
4. تغسل حبات بسرعة مع الاحتياطي ألف وتجاهل يغسل. حفظ الخرز.
5. إضافة نموذج جل الاحتياطي لحفظ طاف والخرز لتركيز 1X. احتضان هذه الأنابيب عند 75 درجة مئوية لمدة 5 دقائق.
6. تحليل الخرز وشطافة الببتيد بواسطة SDS - PAGE. يجب أن تكون خالية من شطافة مفتش الحكومة سواء من جانب البروتين صمة SDS - PAGE أو immunoblots (1B الشكل). هذه المواد خالية من مفتش الحكومة هو مناسبة لقياس الطيف الكتلي.

الشكل 1. عولجوا من العزلة AP - 3 مجمعات البروتين التفاعل والبروتينات الغشاء. HEK293 الخلايا (A) أو الخلايا PC12 (ب) إما في وجود السيطرة على السيارة (DMSO ، غريبة الشكل 1A الممرات) أو DSP (حتى الممرات الشكل 1A أو كل مسارات في الشكل 1B). وحضنت مقتطفات توضيح إما مع الخرز وحدها (الشكل 1A ، الممرات 3-4) ، والأجسام المضادة لمستقبلات ترانسفيرين (الشكل 1A ، الممرات 5-6) ، AP - 3 أو الأضداد δ (الشكل 1A ، انز 70-10 ؛ الشكل . 1B ، الممرات 1-10). وeluted المعقدات المناعية مع العازلة عينة SDS - PAGE (الشكل 1A) ، والاحتياطي وحده أو (الشكل 1B ، الممرات 1-2) ، ومخزن أو تستكمل مع زيادة تركيزات من δ الببتيد مستضدي المقابلة لالأحماض الأمينية 680 710 الإنسان بالتك - δ (NCBI : AAD03777 ؛ غي : 1923266) (الشكل 1B ، الممرات 3-10). هذا الببتيد يربط δ الأضداد. بعد شطف الببتيد ، تم تحليل supernatants (S) والخرز (B) من طخة مناعية (الشكل 1B). AP - 3 ، التي تم الكشف عن الأجسام المضادة ضد مع δ ، β3 ، ومفارز σ3 ، coprecipitates مع العوامل القابلة للذوبان التالية : السلسلة الثقيلة clathrin (CHC) ، وتكتل - 1 pallidin الوحيدات ، والقفزات vps33b الوحيدات المعقدة ، فضلا عن بروتينات الغشاء فسفاتيديل إينوزيتول - 4 - كيناز ألفا من النوع الثاني (PI4KIIα) ونقل الزنك 3 (ZnT3). لاحظ عدم وجود سلاسل الماوس مفتش الثقيلة في الببتيد eluted طاف في الشكل. 1B.

ويستخدم حزب اليسار الديمقراطى ، ونفاذية الغشاء ، crosslinker اختزال كيميائيا مع ذراع هل من 12 ألف إلى استقرار التفاعلات البروتينية عابرة ^1،2،3،4. هنا يتضح لنا هذه الاستراتيجية المعقدة مع محول AP - 3 مجمع بروتين قابل للذوبان والتي تعترف أنواع البروتينات في الغشاء من الحويصلات الإندوسومات ^5. AP - 3 يربط بشكل انتقائي لنقل الزنك وZnT3 كيناز الدهون فسفاتيديل إينوزيتول - 4 - كيناز ألفا من النوع الثاني ولكن ليس مستقبلات ترانسفيرين ^1،4،6. قمنا بتوسيع نطاق هذه الملاحظات لتحديد شبكة التفاعل AP - 3 بروتين من بروتينات الغشاء والعوامل التي عصاري خلوي مطياف الكتلة ^1. خلفية انخفاض المناعة المغناطيسي الأمطار يلي يشابك لتحديد البروتينات المتفاعلة. وعلاوة على ذلك نشرت نشرة من البروتينات التي تربط غير انتقائي لحبات المغناطيسي يسمح لتمرير القضاء الأول من العزلة البروتين غير محددة الهوية من قبل ومطياف الكتلة ^7. DSP تستخدم الجماعات استر أمين التفاعل لربط الأمينات الأولية مثل lysines أو محطة من الأحماض الأمينية للبروتينات. عند تغيير طبيعة الظروف ، هو المشقوق الجزيء في نصف DSP ، تاركا مجموعات كيميائية قصيرة على الأحماض الأمينية المرتبطة. بالنسبة لبعض المستضدات هناك انخفاض في مؤشرات تفاعلية مناعية بواسطة طخة مناعية عند مقارنة الأحمال البروتين متكافئة بين السيطرة DMSO والخلايا المعالجة DSP (Figure1A). فمن الممكن أن هذا الانخفاض ناجم عن تقارب الأضداد انخفض في تعديل lysines DSP. جانبا من هذه الحالات النادرة ، واستخدام المواد الكيميائية يشابك DSP يعزز القدرة على الكشف عن غشاء المرتبطة بشكل وثيق تتفاعل البروتينات.

وقد تمت ترجمة البروتينات أو البروتينات المرتبطة المجمعات محيطيا مع النشرة عصاري خلوي من الأغشية ، مثل AP - 3 إلى الأغشية في درجات الحرارة العادية الحضانة من 37 درجة مئوية. ومع ذلك ، في درجة حرارة الغرفة من 15-20 درجة مئوية بتوزيع ببطء AP - 3 معقدة إلى العصارة الخلوية. وهكذا ، من أجل الاستيلاء على التفاعلات بين AP - 3 و بروتينات غشاء المرتبطة ، يجب أن تكون درجة الحرارة الداخلية لهذه الخلايا تبرد بسرعة إلى 4 درجات مئوية. أفضل طريقة لتحقيق ذلك هي : 1) أن جميع المخازن تفرخ في حمام الثلج قبل إزالة الخلايا الحاضنة من 37 درجة مئوية ، 2) لإزالة جميع وسائل الإعلام على الفور حارا من لوحة من الخلايا واستبدال العازلة الجليد الباردة ، و 3) للحفاظ على خلايا علقت على حمام الثلج لمجمل التجربة يشابك.

DSP ليست قابلة للذوبان في الماء وارتفاع درجات الحرارة وبالتالي حل PBS / كا / ملغ إلى 37 درجة مئوية قبل إضافة DSP / DMSO الحل المستحسن. ومع ذلك ، لأن الخلايا بالحاجة إلى المحافظة على درجة حرارة 4 درجات مئوية ، ينبغي وضع حل يشابك DSP في حمام الثلج بمجرد solubilized تماما DSP. إذا لم يتم DSP solubilized تماما سوف يعجل كميات كبيرة من شكل كحل يبرد (كمية قليلة من الأمطار أمر طبيعي). إذا كمية كبيرة من الأمطار يحدث ، في محاولة للتدفئة الحل الظهر الى 37 درجة مئوية لمدة solubilization كاملة وrecool. إذا DSP يقع مرارا وتكرارا من أصل الحل ، قد تحتاج لإعداد حل يشابك الطازجة. لا ينبغي أن الإزالة السريعة للDSP من الحل بسبب solubilization ناقصة يجب الخلط بينه والتكوين البطيء لطبقة البلورية التي تظهر في آبار DSP الخلايا المعالجة. وجود هذه الطبقة البلورية DSP لا تتداخل مع ردود الفعل عبر ربط في الخلايا.

وأيد هذا العمل من المنح المقدمة من المعاهد الوطنية للصحة لفودافون (NS42599 وGM077569).