Cette méthode aidera les chercheurs à étudier la biologie et la physiopathologie des bactéries anaérobies qui vivent dans l’appareil reproducteur féminin et qui causent des infections dans celui-ci. Les modèles précédents d’inoculation vaginale murine se sont concentrés sur les bactéries cultivées et récupérées dans des conditions aérobies. Notre méthode enseigne sur l’inoculation et la récupération des bactéries obligatoirement anaérobies, qui nécessitent des stratégies supplémentaires pour minimiser l’exposition à l’oxygène.
Selon leur degré de fastidieuseté, les nouvelles souches bactériennes utilisées dans ce modèle peuvent nécessiter des modifications à certaines étapes. Nous avons fourni des suggestions de modifications potentielles dans le premier tableau du manuscrit. Pour commencer, ajoutez 200 microlitres d’une culture bactérienne vieille de 16 heures à une cuvette de 1,5 millilitre avec 800 microlitres de média frais dans une chambre anaérobie.
Ensuite, on a mesuré la densité optique, ou OD, de la culture diluée à 600 nanomètres dans un spectrophotomètre, en utilisant une cuvette séparée avec uniquement des milieux comme blanc. Pour obtenir la valeur OD réelle de la culture, multipliez la lecture du spectrophotomètre par cinq, puis déterminez le volume d’inoculum requis pour l’expérience et calculez le volume de la culture bactérienne nécessaire pour atteindre la densité d’inoculum requise. Ensuite, pipeter le volume requis de culture bactérienne dans un tube de microcentrifugation stérile et centrifuger à 16 000 fois G pendant une à trois minutes.
Après avoir retiré le surnageant, remettre en suspension la pastille dans du PBS anaérobie pour obtenir le volume requis d’inoculum calculé précédemment. Pour déterminer le nombre d’unités formant colonies bactériennes dans l’inoculum préparé, utilisez d’abord 10 microlitres de suspension bactérienne pour effectuer plusieurs dilutions en série dans du PBS et utilisez une pipette multicanal pour repérer les dilutions d’inoculum sur plaque sur des plaques de gélose. Dans le même temps, préparez les tubes de lavage vaginal dans la chambre anaérobie en pipetant 70 microlitres de PBS anaérobie stérile dans des tubes microcentrifuges de 1,5 millilitre étiquetés avec des numéros de souris.
Fermez bien les tubes et sortez-les de la chambre. Pour effectuer un lavage vaginal, placez d’abord une souris sur une cage qu’elle peut saisir avec ses pattes antérieures. Ensuite, saisissez doucement la partie médiane de la queue et soulevez-la de sorte que les quartiers postérieurs soient légèrement surélevés et que l’ouverture vaginale soit exposée.
Après avoir prélevé 50 microlitres de PBS à partir du tube de lavage étiqueté, insérez doucement l’embout de la pipette de deux à trois millimètres dans la lumière vaginale pour le laver avec du PBS en le pipetant trois à quatre fois. Ensuite, transférez le matériau de lavage dans le tube de lavage d’origine avec les 20 microlitres restants de PBS inutilisé. Immédiatement après ce lavage vaginal, inoculez chaque souris en transférant par voie vaginale 20 microlitres de la suspension bactérienne ou du contrôle du véhicule.
Pour les expériences de co-inoculation avec deux souches bactériennes différentes, inoculer séparément avec 10 microlitres de chaque suspension bactérienne, plutôt que de mélanger les souches au préalable. Pour éviter que le volume administré ne s’accumule immédiatement au niveau de l’introït vaginal, continuez à maintenir la partie postérieure de la souris pendant 10 à 20 secondes. Transférez la souris inoculée dans une nouvelle cage ou avec des compagnons de cage déjà inoculés, et répétez la procédure avec les autres souris.
Après avoir inoculé toutes les souris, obtenir les unités formant colonie post-inoculum en plaquant des dilutions en série de l’inoculum dans la chambre anaérobie. Pour prélever des organes de souris, préparez des tubes de prélèvement d’organes de cinq millilitres dans la chambre anaérobie en ajoutant un millilitre de PBS anaérobie stérile à chaque tube pour les vagins et les cervices. Ajouter 750 millilitres de PBS aux tubes marqués pour les cornes utérines.
Pour recueillir le lavage final au sacrifice, préparez une autre série de tubes de lavage vaginal comme démontré précédemment. De plus, pour le rinçage et la stérilisation des instruments de dissection, préparez un bécher de 50 millilitres d’eau désionisée et un bécher de 50 millilitres d’éthanol à 70 à 90%. Immédiatement avant ou après le sacrifice des souris, effectuez le lavage final comme démontré précédemment.
Après le sacrifice, vaporisez l’abdomen et le dos d’une souris avec de l’éthanol à 70%. Ensuite, utilisez des ciseaux stérilisés à l’éthanol et séchés pour ouvrir la cavité pelvienne abdominale de la souris avec des coupes verticales. Ensuite, utilisez la pince pour retirer la peau.
Pour exposer l’appareil reproducteur, poussez doucement les intestins hors de la cavité corporelle vers le côté du champ ouvert et retirez la vessie de la souris pour accéder à la partie inférieure de l’appareil reproducteur. Après cela, coupez le centre de l’os pubien avec des ciseaux sans couper le vagin. Ensuite, utilisez deux paires de forceps pour saisir chaque côté du bassin et ouvrez le bassin latéralement pour exposer la partie inférieure du vagin en dessous.
Saisissez doucement le col de l’utérus avec une pince et tirez-le vers le haut pour exposer le côlon. Après cela, utilisez de petits ciseaux pour libérer le vagin des tissus conjonctifs externes. Libérez soigneusement le vagin du côlon sans perforer le tractus intestinal.
Lorsque le vagin est complètement libéré du côlon, utilisez des ciseaux pour flanquer le vagin au niveau de l’introïtus, puis coupez pour le retirer du corps de la souris. En maintenant une légère prise sur le col de l’utérus, tirez-le vers le haut pour rendre les cornes utérines plus visibles et coupez directement sous les ovaires sur les côtés droit et gauche pour libérer les cornes utérines. Ensuite, retirez l’appareil reproducteur du corps de la souris et placez-le dans une boîte de Petri stérile.
Ensuite, à l’aide d’une lame de rasoir, séparez les cornes utérines, le col de l’utérus et le vagin. Placez chaque tissu dans son tube de prélèvement étiqueté respectif. Pour homogénéiser les organes, préparez un homogénéisateur portatif dans une armoire de biosécurité.
Tout d’abord, préparez un ensemble de trois tubes de 50 millilitres avec de l’eau désionisée, de l’éthanol à 70% et du PBS, respectivement, pour laver les lames de l’homogénéisateur après homogénéisation de chaque organe. Pour nettoyer l’homogénéisateur, plongez la lame dans le tube d’eau et allumez la machine à pleine vitesse pendant environ trois secondes. Ensuite, secouez la lame sur une serviette en papier pour éliminer l’excès d’eau.
Rincer la lame successivement dans de l’éthanol à 70% et du PBS. Après le rinçage initial, abaissez la sonde homogénéisante au fond d’un tube avec des organes pour piéger le tissu en dessous. Ensuite, allumez l’homogénéisateur pour broyer le tissu et déplacez doucement la sonde de haut en bas environ cinq fois, en la maintenant immergée.
Éteignez et retirez l’homogénéisateur et assurez-vous visuellement d’une perturbation complète des tissus. Après homogénéisation, recycler l’échantillon dans la chambre anaérobie et effectuer une dilution en série pour la récupération de l’UFC. En suivant ce protocole, la récupération des bactéries viables et le dénombrement des unités formant des colonies à partir des lavages vaginaux pourraient être effectués avec succès pour les souches bactériennes, Gardnerella vaginalis, Prevotella bivia et Fusobacterium nucleatum.
De plus, le nombre d’unités formant des colonies de Gardnerella vaginalis obtenues à partir de lavages vaginaux était corrélé à celles récupérées à partir des homogénats de tissus vaginaux. Cette méthode a également révélé que les titres de Prevotella bivia et les tissus utérins de souris étaient significativement plus élevés lors de la co-infection par Gardnerella vaginalis par rapport à la mono-infection à Prevotella. De plus, cette méthode pourrait être utilisée avec succès pour comparer la persistance vaginale d’une souche mutante de Fusobacterium nucleatum à celle du type sauvage 24 et 72 heures après l’inoculation.
Pour étudier la réponse immunitaire à l’inoculation bactérienne vaginale, des tests de cytokines peuvent être effectués sur les homogénats tissulaires. Alternativement, les tissus pourraient être conservés pour un examen histologique afin d’évaluer les signes d’inflammation.
