ستساعد هذه الطريقة الباحثين على دراسة البيولوجيا والفيزيولوجيا المرضية للبكتيريا اللاهوائية التي تعيش وتسبب العدوى في الجهاز التناسلي للأنثى. ركزت النماذج السابقة من التلقيح المهبلي للفئران على البكتيريا التي نمت وتعافت في ظل الظروف الهوائية. ترشد طريقتنا إلى تلقيح واستعادة البكتيريا اللاهوائية الإلزامية ، والتي تتطلب استراتيجيات إضافية لتقليل التعرض للأكسجين.
اعتمادا على مدى ثباتها ، قد تتطلب السلالات البكتيرية الجديدة المستخدمة في هذا النموذج تغييرات في خطوات معينة. لقد قدمنا اقتراحات للتعديلات المحتملة في الجدول الأول من المخطوطة. بادئ ذي بدء ، أضف 200 ميكرولتر من مزرعة بكتيرية عمرها 16 ساعة إلى كوفيت سعة 1.5 ملليلتر مع 800 ميكرولتر من الوسائط الطازجة في غرفة لاهوائية.
ثم قم بقياس الكثافة الضوئية ، أو OD ، للثقافة المخففة عند 600 نانومتر في مقياس الطيف الضوئي ، باستخدام كفيت منفصل مع الوسائط فقط كفراغ. للحصول على قيمة OD الفعلية للثقافة ، اضرب قراءة مقياس الطيف الضوئي في خمسة ، ثم حدد حجم اللقاح المطلوب للتجربة واحسب حجم الثقافة البكتيرية اللازمة لتحقيق كثافة اللقاح المطلوبة. بعد ذلك ، ماصة الحجم المطلوب من الثقافة البكتيرية إلى أنبوب طرد مركزي دقيق معقم وأجهزة طرد مركزي عند 16،000 مرة G لمدة دقيقة إلى ثلاث دقائق.
بعد إزالة المادة الطافية ، أعد تعليق الحبيبات في PBS اللاهوائي لتحقيق الحجم المطلوب من اللقاح المحسوب من قبل. لتحديد عدد وحدات تشكيل المستعمرة البكتيرية في اللقاح المحضر ، أولا ، استخدم 10 ميكرولتر من المعلق البكتيري لعمل العديد من التخفيفات التسلسلية في PBS واستخدم ماصة متعددة القنوات لاكتشاف تخفيفات اللقاح على ألواح الآجار. في الوقت نفسه ، قم بإعداد أنابيب غسل المهبل في الغرفة اللاهوائية عن طريق سحب 70 ميكرولتر من PBS اللاهوائي المعقم في أنابيب طرد مركزي دقيقة سعة 1.5 ملليلتر تحمل أرقام الفئران.
أغلق الأنابيب بإحكام وأخرجها من الغرفة. لأداء غسل المهبل ، أولا ، ضع فأرا فوق قفص يمكنه الإمساك به بأقدامه الأمامية. ثم ، أمسك الجزء الأوسط من الذيل برفق وارفعه بحيث تكون الأرباع الخلفية مرتفعة قليلا وتتعرض فتحة المهبل.
بعد سحب 50 ميكرولتر من PBS من أنبوب الغسيل المسمى ، أدخل طرف الماصة برفق من مليمترين إلى ثلاثة ملليمترات في تجويف المهبل لغسله باستخدام PBS عن طريق السحب للداخل والخارج ثلاث إلى أربع مرات. بعد ذلك ، انقل مادة الغسيل مرة أخرى إلى أنبوب الغسيل الأصلي مع 20 ميكرولتر المتبقية من PBS غير المستخدمة. مباشرة بعد هذا الغسل المهبلي ، قم بتلقيح كل فأر عن طريق نقل 20 ميكرولتر عن طريق المهبل من التعليق البكتيري أو التحكم في السيارة.
بالنسبة لتجارب التلقيح المشترك مع سلالتين بكتيريتين مختلفتين ، قم بالتلقيح بشكل منفصل باستخدام 10 ميكرولتر من كل معلق بكتيري ، بدلا من خلط السلالات مسبقا. لمنع الحجم المعطى من التراكم على الفور عند مقدمة المهبل ، استمر في رفع الجزء الخلفي للفأر لمدة 10 إلى 20 ثانية. انقل الفأر الملقح إلى قفص جديد أو مع زملائه في القفص الملقح بالفعل ، وكرر الإجراء مع الفئران الأخرى.
بعد تلقيح جميع الفئران ، احصل على وحدات تشكيل مستعمرة ما بعد اللقاح عن طريق طلاء التخفيفات التسلسلية للقاحة في الغرفة اللاهوائية. لجمع أعضاء الفأر ، قم بإعداد أنابيب جمع الأعضاء سعة خمسة ملليلتر في الغرفة اللاهوائية عن طريق إضافة ملليلتر واحد من PBS اللاهوائي المعقم إلى كل أنبوب للمهبل وعنق الرحم. أضف 750 ملليلتر من PBS إلى الأنابيب المحددة لقرون الرحم.
لجمع الغسيل النهائي عند التضحية ، قم بإعداد مجموعة أخرى من أنابيب غسل المهبل كما هو موضح سابقا. أيضا ، لشطف وتعقيم أدوات التشريح ، قم بإعداد دورق سعة 50 ملليلتر من الماء منزوع الأيونات وكأس زجاجية سعة 50 ملليلتر من 70 إلى 90٪ من الإيثانول. مباشرة قبل أو بعد التضحية بالفئران ، قم بإجراء الغسيل النهائي كما هو موضح سابقا.
بعد التضحية ، رش بطن وظهر الفأر بنسبة 70٪ من الإيثانول. بعد ذلك ، استخدم مقص الإيثانول المعقم والمجفف لفتح تجويف الحوض البطني للماوس بجروح رأسية. بعد ذلك ، استخدم الملقط لسحب الجلد.
لفضح الجهاز التناسلي ، ادفع الأمعاء برفق خارج تجويف الجسم إلى جانب الحقل المفتوح وأزل المثانة من الماوس للوصول إلى الجزء السفلي من الجهاز التناسلي. بعد ذلك ، قص مركز عظم العانة بمقص دون قطع المهبل. بعد ذلك ، استخدم مجموعتين من الملقط للإمساك بكل جانب من الحوض وسحب الحوض مفتوحا بشكل جانبي لكشف الجزء السفلي من المهبل تحته.
أمسك عنق الرحم برفق بالملقط واسحبه لأعلى لفضح القولون. بعد ذلك ، استخدم مقص صغير لتحرير المهبل من الأنسجة الضامة الخارجية. حرر المهبل بعناية من القولون دون ثقب الأمعاء.
عندما يتم تحرير المهبل بالكامل من القولون ، استخدم المقص لإحاطة المهبل عند المقدمة ثم قصه لإزالته من جسم الفأر. الحفاظ على قبضة لطيفة على عنق الرحم ، اسحبه لأعلى لجعل قرون الرحم أكثر وضوحا وقطع مباشرة أسفل المبيضين على الجانبين الأيمن والأيسر لتحرير قرون الرحم. بعد ذلك ، قم بإزالة الجهاز التناسلي من جسم الفأر وضعه في طبق بتري معقم.
ثم ، باستخدام شفرة حلاقة ، افصل قرون الرحم وعنق الرحم والمهبل. ضع كل منديل في أنبوب التجميع المسمى الخاص به. لتجانس الأعضاء ، اجعل الخالط المحمول جاهزا في خزانة السلامة البيولوجية.
أولا ، قم بإعداد مجموعة من ثلاثة أنابيب سعة 50 ملليلتر بالماء منزوع الأيونات ، و 70٪ من الإيثانول ، و PBS ، على التوالي ، لغسل شفرات الخالط بعد تجانس كل عضو. لتنظيف الخالط ، اغمس الشفرة في أنبوب الماء وقم بتشغيل الجهاز بأقصى سرعة لمدة ثلاث ثوان تقريبا. ثم هز الشفرة على منشفة ورقية لإزالة الماء الزائد.
شطف الشفرة على التوالي في 70 ٪ من الإيثانول و PBS. بعد الشطف الأولي ، قم بخفض مسبار الخالط إلى أسفل الأنبوب مع الأعضاء لاحتجاز الأنسجة تحته. بعد ذلك ، قم بتشغيل الخالط لطحن الأنسجة وحرك المسبار برفق لأعلى ولأسفل حوالي خمس مرات ، مع إبقائه مغمورا.
قم بإيقاف تشغيل الخالط وإزالته وتأكد بصريا من تعطيل الأنسجة بالكامل. بعد التجانس ، قم بتدوير العينة مرة أخرى إلى الغرفة اللاهوائية وقم بإجراء التخفيف التسلسلي لاستعادة CFU. باتباع هذا البروتوكول ، يمكن استعادة البكتيريا القابلة للحياة وتعداد وحدات تشكيل المستعمرة من الغسول المهبلي بنجاح للسلالات البكتيرية ، Gardnerella vaginalis ، Prevotella bivia ، و Fusobacterium nucleatum.
علاوة على ذلك ، فإن عدد وحدات تشكيل مستعمرة Gardnerella vaginalis التي تم الحصول عليها من الغسول المهبلي يرتبط بتلك المستعادة من تجانس الأنسجة المهبلية. كشفت هذه الطريقة أيضا أن عيار Prevotella bivia وأنسجة رحم الفأر كانت أعلى بشكل ملحوظ أثناء العدوى المشتركة مع Gardnerella vaginalis مقابل عدوى Prevotella mono. علاوة على ذلك ، يمكن استخدام هذه الطريقة بنجاح لمقارنة الثبات المهبلي لسلالة Fusobacterium nucleatum الطافرة مع النوع البري في 24 و 72 ساعة بعد التلقيح.
للتحقيق في الاستجابة المناعية للتلقيح البكتيري المهبلي ، يمكن إجراء فحوصات السيتوكين على تجانس الأنسجة. بدلا من ذلك ، يمكن حفظ الأنسجة للفحص النسيجي لتقييم علامات الالتهاب.
