Des communautés bactériennes intracellulaires, ou CCI, ont été observées chez des souris qui ont reçu des infections urinaires expérimentales, ou UTI. Ils ont également été vus dans les sédiments urinaires des patients atteints d’infection urinaire humaine. La technique que nous décrivons aujourd’hui est un moyen d’isoler les CIP simples des souris infectées expérimentalement.
La technique de micropipetting de bouche est la seule technique actuellement disponible pour isoler des bactéries intracellulaires des vessies infectées de souris. Pour préparer des pipettes de bouche en verre, pincez fermement les deux extrémités d’un tube capillaire en verre et faites pivoter uniformément le milieu du tube d’avant en arrière le long de son axe au-dessus d’une source de flamme ouverte. Lorsque le verre devient mou, retirez le capillaire de la source de chaleur et retirez immédiatement le verre.
La longueur finale idéale du capillaire tiré est de trois à cinq centimètres de plus qu’un capillaire sanspulled pour assurer un diamètre interne approprié pour isoler les cellules épithéliales simples de réservoir souple. Lorsque le verre est refroidi, vérifiez si le milieu du capillaire en verre est plus étroit et que l’intérieur du tube est encore creux. Ramasser la grande extrémité du capillaire tiré d’une main, utiliser des forceps pour saisir le capillaire à son point le plus étroit, en s’assurant que les forceps sont brandi avec suffisamment de force pour saisir fermement le capillaire sans l’écraser.
Tordez rapidement les forceps pour casser le capillaire tiré au point le plus étroit. Ensuite, placez le capillaire de la taille d’une micropipette buccale dans une boîte de Pétri de 100 millimètres et stérilisez le plat pendant 30 minutes. Pour récolter la vessie, placez une souris en position supine et stérilisez la région abdominale avec 70% d’éthanol.
À l’aide de forceps stérilisés à l’éthanol et de ciseaux chirurgicaux, faites une incision transversale initiale d’un centimètre au-dessus de l’ouverture urétrale et élargissez l’incision en diagonale vers les membres supérieurs de la souris pour créer une coupe en forme de V le long de l’antérieur entier de la souris qui expose le contenu du péritoine. À l’aide de nouveaux outils stérilisés, poussez doucement vers le bas sur les coussinets graisseux près de la région pelvienne de la souris pour faire dépasser la vessie et saisir la vessie exposée à l’apex. En gardant une prise ferme sur la vessie, coupez les uretères et l’urètre pour libérer la vessie et insérez la pointe d’un arbre de forceps arrondis dans l’ouverture de la vessie où elle vient d’être incisée.
Relâchez les forceps saisissant l’apex et gardant les forceps arrondis presque complètement fermés, utilisez une deuxième paire de forceps pour tirer doucement l’extrémité extérieure de la bouche de la vessie loin des forceps arrondis et autour et au-dessus de l’autre bout des forceps arrondis pour tourner la vessie à l’extérieur. Ensuite, utilisez la deuxième paire de forceps pour amadouer doucement la vessie inversée de la pointe des forceps en un millilitre de PBS froid. Et grattez doucement la couche cellulaire épithéliale interne à l’extérieur de la vessie inversée avec deux paires de forceps propres.
Lorsque toutes les cellules ont été grattées, insérez l’extrémité non pulvérisée d’un capillaire en verre tiré dans le bouchon en caoutchouc d’un tube aspirateur et adaptez étroitement l’extrémité étroite d’une pointe de pipette d’un millilitre dans l’autre extrémité ouverte du tube. S’adapter étroitement à l’extrémité étroite d’une pipette aspirante de deux millilitres dans l’extrémité ouverte et plus large de la pointe de pipette d’un millilitre et placer la suspension cellulaire grattée sous un microscope disséquant. À l’aide d’un grossissement de 20 à 40 X, identifiez les CCI comme de gros agrégats fluorescents et trempez l’extrémité fine du capillaire en verre dans un nouveau tube de PBS pendant une seconde afin de réduire l’absorption du volume indésirable par l’action capillaire.
Lorsqu’un BAC d’intérêt a été localisé, apportez lentement l’extrémité ouverte du tube capillaire vers le BAC et appliquez une très petite force d’aspiration à la pipette aspirante pour guider le BAC dans le capillaire en verre. Ensuite, déplacez le capillaire vers un tube de centrifugeuse vide de 1,5 millilitre et appliquez une légère pression positive pour expulser la gouttelette et le BAC dans le tube. En plus de la confirmation de la présence d’un seul BAC isolé dans le tube de collecte au microscope disséquant, la pureté du BAC isolé peut être confirmée par microscopie confocale.
Les cellules isolées devraient tacher e.coli et uroplakin et devraient avoir entre 50 et 120 micromètres de taille. Après isolement, la présence et la viabilité des cellules bactériennes dans le BAC individuel peuvent être confirmées par la quantification unitaire de formation de colonies ou la réaction quantitative en chaîne de polymése pour les équivalents génomiques. Notamment, les cellules épithéliales non infectées isolées avec le même protocole ne démontrent pas de quantités quantifiables de bactéries.
De plus, l’analyse quantitative de la réaction en chaîne de la transcription inverse confirme la présence de gènes bactériens dans une gamme de CCI isolés et mis en commun individuellement. Assurez-vous toujours qu’une micropipette buccae peut ramasser et expulser le liquide facilement. N’hésitez pas à changer le capillaire ou tout l’appareil si la micropipette buccae se sent occluse.
Cette technique de micropipetting de bouche nous permet d’étudier directement et spécifiquement les populations intracellulaires qui se forment pendant un UTI expérimental. Sans cette technique, ces populations intracellulaires seraient contaminées et en infériorité numérique par les bactéries extracellulaires. D’autres agents infectieux peuvent être plus facilement aérosolisés ou transmis que l’E.coli que nous avons utilisé dans cette application.
Dans ces cas, certains contrôles supplémentaires peuvent donc être justifiés, comme l’ajout d’un filtre ou l’extension du tube, selon l’application utilisée. Les CCI isolés à l’aide de cette technique de micropipetting buccique peuvent ensuite être utilisés dans d’autres analyses en aval d’une seule cellule, comme le QRTPCR ou le séquençage de l’ARN.
