L’administration de médicaments au cerveau restait un défi. Le développement de grands panels de nouveaux nanomatériaux pour améliorer l’administration au cerveau souligne la nécessité d’un véritable microsystème in vitro pour prédire la pénétration cérébrale dans le cadre des essais précliniques. Le principal avantage de cette technique est de glacer les conditions réelles de la douleur libre de la barrière hémato-encéphalique à l’intérieur du même système permettant les communications cellulaires nécessaires à l’induction du phénotype de la barrière hémato-encéphalique.
De plus, chaque type de cellule peut être isolé séparément pour une analyse moléculaire plus approfondie. Le modèle peut être utilisé pour une vaste gamme d’expériences dans des conditions saines et pathologiques et représente un outil précieux pour les évaluations précliniques des transports de molécules et de particules, ainsi que pour le trafic inter et intracellulaire. La procédure sera présentée par le Dr Clemence Deligne et le Dr Eleonora Rizzi.
Commencez par coder les puits avec 500 microlitres de solution de poly-L-Lysine de deux microgrammes par centimètre carré. Incuber pendant la nuit ou pendant au moins une heure à 37 degrés Celsius et retirer soigneusement la solution de Poly-L-Lysine avec une pipette en verre reliée à un système d’aspiration. Puis rincer deux fois à l’eau stérile.
Pour recueillir les astrocytes, lavez d’abord les astrocytes une fois avec 10 millilitres de 1X PBS CMF chaud. Incuber pendant trois minutes avec 10 millilitres de solution chaude d’EDTA à 20% de trypsine à 37 degrés Celsius sous 5% de dioxyde de carbone et 21% d’oxygène. Détacher mécaniquement les cellules du ballon et transférer la suspension dans un tube conique contenant cinq millilitres de FCS chaud non dilué.
Centrifuger la suspension à 190 fois G pendant cinq minutes à 20 degrés Celsius. Re-suspendre la pastille de cellule dans cinq millilitres de milieu astrocytaire chaud, puis diluer 20 microlitres de la suspension cellulaire avec 80 microlitres de 1X PBS CMF. Comptez les cellules à l’aide d’une chambre de comptage manuelle au microscope.
Plaque d’environ 40 000 cellules par centimètre carré dans chaque puits pré-L-Lysine pré-codé dans un volume de 1,5 millilitres de milieu astrocytaire chaud. Placez les filtres à insert inversés à la périphérie d’une capsule couverte de 25 millimètres de haut et ajoutez 250 microlitres de solution de collagène de type un aux filtres d’insertion. Incuber à température ambiante pendant une heure.
Ensuite, retirez délicatement la solution de collagène de type un avec une pipette en verre reliée à un système d’aspiration. Lavez deux fois avec 250 microlitres de DMEM à haute teneur en glucose à température ambiante et retirez soigneusement toute la solution des filtres à insert. Lavez les péricytes deux fois avec 10 millilitres de 1X PBS CMF chaud et incuber les cellules avec deux millilitres de trypsine chaude.
Observez les cellules au microscope pour surveiller l’action de la trypsine. Lorsque les cellules commencent à se détacher, retirez la trypsine, puis ajoutez cinq millilitres de milieu basal ou ECM des cellules endothéliales chaudes aux cellules et commencez la dissociation mécanique. Diluer 20 microlitres de la suspension cellulaire avec 80 microlitres de 1X PBS CMF et compter les cellules à l’aide d’une chambre de comptage manuelle au microscope comme indiqué précédemment.
Semer 44 500 cellules par centimètre carré sur les filtres à insert inversés pré-codés dans un volume de 250 microlitres. Gardez les filtres à insert dans un incubateur humidifié à 37 degrés Celsius pendant trois heures sous 5% de dioxyde de carbone et 21% d’oxygène. Utilisez une pince à épiler stérile pour retourner soigneusement les filtres d’insertion dans une plaque de 12 puits contenant 1,5 millilitre d’ECM chaude par puits.
Les filtres d’insertion sont maintenant prêts à être revêtus de l’autre côté. Enduisez la face supérieure et les filtres d’insertion de 500 microlitres d’hydrogel à base de matrice extracellulaire. Placez les filtres à insert dans un incubateur humidifié à 37 degrés Celsius sous 5% de dioxyde de carbone et 21% d’oxygène pendant une heure.
Lavez-les une fois avec 500 microlitres de DMEM à haute teneur en glucose à température ambiante. Lavez la culture de cellules endothéliales une fois avec 10 millilitres de 1X PBS CMF chaud et incuber les cellules avec deux millilitres de trypsine tiède. Retirez la trypsine lorsque les cellules commencent à se détacher, puis ajoutez cinq millilitres d’ECM chaude et commencez la dissociation mécanique.
Diluer 20 microlitres de la suspension cellulaire avec 80 microlitres de 1X PBS CMF et compter les cellules à l’aide d’une chambre de comptage manuelle. Ensemencer les cellules endothéliales à une densité de 71 500 cellules par centimètre carré sur les filtres à insert précodés dans un volume de 500 microlitres d’ECM chaud. Remplacez le milieu astrocytaire par 1,5 millilitre d’ECM chaud par puits.
Transférez ensuite les filtres d’insertion ensemencés dans les puits contenant les astrocytes. Placez les systèmes de cellules tri-culture dans un incubateur humidifié à 37 degrés Celsius sous 5% de dioxyde de carbone et 21% d’oxygène. Retirez soigneusement le fluide des compartiments supérieur et inférieur à l’aide d’une pipette en verre reliée à un système d’aspiration.
Remplacez le milieu par un ECM chaud dans un volume de 500 microlitres dans le compartiment supérieur et de 1,5 millilitre dans le compartiment inférieur. Renouvelez le support tous les deux jours jusqu’au sixième jour en répétant la même procédure. Enfin, remettez les cellules dans un incubateur humidifié à 37 degrés Celsius sous 5% de dioxyde de carbone et 21% d’oxygène.
Les données d’immunocytochimie ont confirmé l’expression de marqueurs conventionnels tels que le récepteur bêta du facteur de croissance dérivé des plaquettes et Desmine pour les péricytes, et la protéine acide fibrillaire gliale pour les astrocytes. Ainsi, après six jours de culture avec les péricytes et les astrocytes, la monocouche de cellules endothéliales de type cérébral ou BLECs visualisée avec la coloration de la jonction adhérente de Ve-Cadhérine présente une localisation continue des protéines TJ CLD5 et Z-01 aux frontières cellulaires. La perméabilité paracellulaire du BLECS aux marqueurs d’intégrité fluorescents de la BHE, à la fluorescéine de sodium et au dextrane FITC est illustrée ici.
L’accumulation intracellulaire de R123 dans les BLEC a montré une augmentation significative de la présence de l’inhibiteur de la pompe à efflux Elacridar par rapport à la condition de contrôle avec son absence. Cela indique la présence de molécules actives de pompe à efflux, à savoir la glycoprotéine P et la protéine de résistance au cancer du sein ou BCRP dans les BLEC. L’expression génique des protéines à jonction serrée, des transporteurs et des récepteurs à grosses molécules normalisés par l’expression de RPLP0 est illustrée ici.
Ici, les valeurs supérieures à un correspondent à une expression génique plus élevée dans le modèle de triple culture. La ligne rouge correspond à une valeur de un où le niveau d’expression des deux modèles est équivalent. L’image représentative montre le niveau protéique des protéines à jonction serrée, transporteurs, dans les récepteurs à grosses molécules normalisés par l’expression de la bêta-actine.
Le transport de nanogels polymères neutres à base de NIPAM marqués par fluorescence a été évalué. Au temps zéro, des nanogels polymères ont été placés dans le compartiment luminal à une concentration de 0,1 milligramme par millilitre. Après 24 heures d’incubation, 5,82% des nanogels polymères ont été trouvés dans le compartiment abluminal, prouvant leur capacité à traverser les BLECs.
Le revêtement et l’ensemencement corrects des péricytes sur le filtre inversé sont essentiels. Le maintien de la stérilité et de l’intégrité des structures est important pour éviter la contamination du système de culture cellulaire.
