模拟人血脑屏障的三重培养细胞系统

药物输送到大脑仍然是一个挑战。开发大型新型纳米材料以改善对大脑的输送，突出了在临床前测定框架中预测大脑渗透的真实体外微系统的需求。该技术的主要优点是在同一系统内冰冻血脑屏障的游离疼痛细胞实际，允许诱导血脑屏障表型所需的细胞细胞通讯。

此外，每种细胞类型可以单独分离以进行进一步的分子分析。该模型可用于健康和病理条件下的广泛实验，是分子和颗粒转运以及细胞间和细胞内运输的临床前评估的宝贵工具。演示该程序的将是Clemence Deligne博士和Eleonora Rizzi博士。

首先用500微升每平方厘米2微克的聚-L-赖氨酸溶液对孔进行编码。在 37 摄氏度下孵育过夜或至少一小时，并用连接到吸气系统的玻璃移液管小心地取出聚-L-赖氨酸溶液。然后用无菌水冲洗两次。

要收集星形胶质细胞，首先用10毫升温热的1X PBS CMF洗涤星形胶质细胞一次。将它们与10毫升温热的20%胰蛋白酶EDTA溶液在37摄氏度下在5%二氧化碳和21%氧气下孵育三分钟。机械地将细胞从烧瓶中分离，并将悬浮液转移到含有5毫升温热的非稀释FCS的锥形管中。

将悬浮液在 190 倍 G 下在 20 摄氏度下离心五分钟。将细胞沉淀重新悬浮在5毫升温热的星形胶质细胞培养基中，然后用80微升1X PBS CMF稀释20微升细胞悬液。在显微镜下使用手动计数室对细胞进行计数。

在每个聚-L-赖氨酸预编码孔中，将每平方厘米约40， 000个细胞铺在1.5毫升温热的星形胶质细胞培养基中。将恢复的插入式过滤器放在有盖的 25 毫米高培养皿的外围，并向插入过滤器中加入 250 微升胶原蛋白 1 型溶液。在室温下孵育一小时。

然后用连接到吸气系统的玻璃移液管小心地去除胶原蛋白一型溶液。在室温下用250微升DMEM高葡萄糖洗涤两次，然后小心地从插入过滤器中取出所有溶液。用10毫升温热的1X PBS CMF洗涤周细胞两次，并用两毫升温热的胰蛋白酶孵育细胞。

在显微镜下观察细胞以监测胰蛋白酶的作用。当细胞开始分离时，去除胰蛋白酶，然后向细胞中加入五毫升温热的内皮细胞基础培养基或ECM，并开始机械解离。用80微升1X PBS CMF稀释20微升细胞悬液，并使用显微镜下的手动计数室对细胞进行计数，如前所示。

在预先编码的还原插入过滤器上以250微升的体积播种44，500个每平方厘米的细胞。将插入式过滤器在 37 摄氏度的加湿培养箱中在 5% 二氧化碳和 21% 氧气下保持 3 小时。使用无菌镊子小心地将插入式过滤器恢复到每孔含有 1.5 毫升温 ECM 的 12 孔板中。

插入式过滤器现在可以在另一侧涂覆了。在上侧和插入过滤器上涂上500微升基于细胞外基质的水凝胶。将插入式过滤器置于37摄氏度的加湿培养箱中，在5%二氧化碳和21%氧气下放置一小时。

在室温下用500微升DMEM高葡萄糖洗涤一次。用10毫升温热的1X PBS CMF洗涤内皮细胞培养物一次，并用两毫升温热的胰蛋白酶孵育细胞。当细胞开始分离时取出胰蛋白酶，然后加入五毫升温热的ECM并开始机械解离。

用80微升1X PBS CMF稀释20微升细胞悬液，并使用手动计数室对细胞进行计数。在预编码的插入过滤器上以每平方厘米71，500个细胞的密度接种内皮细胞，体积为500微升的温ECM。用每孔1.5毫升温热的ECM替换星形胶质细胞培养基。

然后将接种的插入过滤器转移到含有星形胶质细胞的孔中。将三培养细胞系统置于37摄氏度的加湿培养箱中，置于5%二氧化碳和21%氧气下。使用与吸液系统连接的玻璃移液器从上部和底部隔室小心地取出培养基。

用温热的ECM替换培养基，上隔间容量为500微升，底部隔间体积为1.5毫升。通过重复相同的过程，每隔一天更新培养基，直到第六天。最后将细胞放回37摄氏度的加湿培养箱中，在5%二氧化碳和21%氧气下。

免疫细胞化学数据证实了常规标志物的表达，例如血小板衍生生长因子受体β和Desmine用于周细胞，神经胶质纤维酸性蛋白用于星形胶质细胞。因此，在用周细胞和星形胶质细胞培养六天后，用Ve-钙粘蛋白的贴壁连接染色可视化的脑样内皮细胞或BLECS的单层在细胞边界显示TJ蛋白CLD5和Z-01的连续定位。此处显示了BLECS对荧光BBB完整性标志物，荧光素钠和FITC葡聚糖的细胞旁通透性。

与不存在的对照条件相比，BLECS中的R123细胞内积累表现出外排泵抑制剂Elacridar的存在显着增加。这表明在BLEC中存在活性外排泵分子，即P糖蛋白和乳腺癌耐药蛋白或BCRP。此处显示了通过RPLP0表达标准化的紧密连接蛋白，转运蛋白和大分子受体的基因表达。

在这里，大于 1 的值对应于三重培养模型中较高的基因表达。红线对应于一个值 1，其中两个模型的表达式级别相等。代表性图像显示了通过β肌动蛋白表达归一化的大分子受体中紧密连接蛋白（转运蛋白）的蛋白质水平。

评估了荧光标记的基于NIPAM的中性聚合物纳米凝胶的传输。在零时间，聚合物纳米凝胶以0.1毫克/毫升的浓度放置在腔内室中。孵育24小时后，在铝室中发现了5.82%的聚合物纳米凝胶，证明了它们能够穿过BLEC。

在恢复的过滤器上正确包被和接种周细胞至关重要。重要的是保持结构的无菌性和完整性，以避免污染细胞培养系统。