Ce protocole est important car il démontre comment préparer des nanoparticules polymères, des acides nucléiques encapsulés en une seule étape. Les principaux avantages de cette technique sont la polyvalence, car elle peut être appliquée à différents acides nucléiques et types de cellules. L’utilisation de procédures simples pour la préparation des particules, telles que le pipetage de haut en bas, et la possibilité d’étendre la stabilité des nanoparticules et des conditions du tambour par lyophilisation.
Laura Olmo, Coral Garcia-Fernandez, Maria Stampa Lopez-Pinto et Maria Navalon-Lopez, doctorante de notre laboratoire et Marta Diaz-Caballero, post-doctorante pour notre laboratoire, feront la démonstration de la procédure. Pour la formation de polyplexes, décongelez les polymères préalablement préparés, le peptide C6, les esters poly bêta-aminés et vortexez la solution. Après avoir pipeté le mélange de polymère de haut en bas, préparer une solution de 12,5 millimolaires dans de l’acétate de sodium.
Vortex la solution et attendez 10 minutes. Ensuite, préparez l’ARNm à 0,5 milligramme par millilitre et mélangez-le par pipetage. Vortex la solution de polymère à nouveau, puis mélanger la solution de matériel génétique dans la solution de polymère dans un rapport de un à un dans un tube de microcentrifugation et incuber le tube à 25 degrés Celsius pendant 30 minutes dans un thermobloc.
Après l’incubation, précipiter le mélange avec une à deux eau sans RNase en ajoutant l’échantillon à un tube de microcentrifugation contenant l’eau, puis pour inclure les excipients, ajouter un tas de 20 millimolaires et une solution de saccharose à 4% dans le même volume que le mélange d’ARNm et d’esters poly bêta-aminés, et mélangé par pipetage. Pour la lyophilisation après avoir congelé la solution de polyplex à moins 80 degrés Celsius pendant une heure, effectuez le séchage primaire, puis stockez immédiatement les polyplexes à moins 20 degrés Celsius pour éviter la réhydratation. Pour la remise en suspension polyplexe, retirez les nanoparticules lyophilisées du congélateur à moins 20 degrés Celsius et ajoutez rapidement la quantité correspondante d’eau hydrogénée profonde pour disperser à nouveau le solide et atteindre la concentration souhaitée.
Pipetter doucement jusqu’à la remise en suspension totale et une fois dissous, pipeter vigoureusement de haut en bas en évitant les bulles. Après 24 heures de transfection pour évaluation qualitative par microscopie à fluorescence, placez la plaque de 96 puits contenant les cellules Hela transfectées sur le microscope et commencez à visualiser en utilisant l’objectif 10 fois. Tout d’abord, appliquez une balance des blancs pour créer une référence d’arrière-plan pour le logiciel, puis acquérez une image pour la superposer à l’image de fluorescence pendant l’analyse.
Passez le mode microscope en mode réflexion et déplacez la roue filtrante vers le laser bleu pour visualiser l’EGFP. Ensuite, acquérez des images pour toutes les conditions ou puits en utilisant le même temps d’exposition. Pour l’évaluation quantitative par cytométrie en flux, laver les cellules Hela transfectées dans une plaque de 96 puits en utilisant 100 microlitres de PBS par puits.
Après avoir aspiré le PBS à 25 microlitres de trypsine par puits et incuber à 37 degrés Celsius pendant cinq minutes. Une fois les cellules détachées, ajoutez le milieu précédemment récupéré pour inactiver la trypsine, puis fixez les cellules en ajoutant 31,25 microlitres de 10% de formol par puits et en incubant pendant 20 minutes. Allumez ensuite le cytomètre en flux et le logiciel, puis configurez les conditions appropriées pour l’expérience, y compris le type de volume d’échantillon de plaque et d’autres paramètres tels que l’agitation et le rinçage entre les échantillons.
Configurez les paramètres appropriés pour quantifier le pourcentage de cellules transfectées positivement en visualisant d’abord les données de flux sur la lumière diffusée vers l’avant par rapport à la lumière diffusée latéralement pour distinguer les cellules des débris. Et puis tracer un autre nuage de points, en comparant l’amplitude par rapport à la hauteur à la porte et discriminer les cellules individuelles. Un jour avant la transfection, plaque 10 000 cellules JAWS II par puits dans une plaque de 96 puits pour une incubation de nuit.
Le lendemain, transfectez les cellules avec 0,6 microgramme d’ARNm par puits et incubez la plaque pendant 24 heures dans un incubateur à air sec à 37 degrés Celsius et 5% de dioxyde de carbone. Le lendemain, lavez les cellules restantes dans le puits avec 25 microlitres de PBS. Après avoir aspiré le PBS à 25 microlitres de trypsine et incubé la plaque pendant cinq minutes à 37 degrés Celsius pour détacher les cellules.
Arrêtez la réaction de trypsine en ajoutant le média précédemment récupéré sur le puits correspondant. Ensuite, centrifugez la plaque, aspirez le support et fixez les cellules en ajoutant 50 microlitres de PBS et 2,5% de formol par puits, puis en incubant la plaque à quatre degrés Celsius pendant 20 minutes, centrifugez la plaque. Ajoutez ensuite 50 microlitres de PBS et 3% de BSA par puits et incubateur pendant 30 minutes à quatre degrés Celsius.
Après l’incubation, centrifugez à nouveau la plaque, puis ajoutez 50 microlitres de l’anticorps ovalbumine de souris dans pbS et 3% BSA et incubateur pendant 30 minutes à quatre degrés Celsius. Répétez l’étape de centrifugation, puis lavez les cellules avec 50 microlitres de PBS. Après avoir aspiré le PBS, ajoutez les anticorps secondaires et incubez pendant une heure à quatre degrés Celsius.
Après l’incubation, répétez les étapes de centrifugation et de lavage. Ensuite, remettez en suspension les cellules et 100 microlitres de PBS et 2,5% de formol pour l’analyse de cytométrie en flux. La caractérisation physico-chimique de l’ARNm GFP frais et lyophilisé encapsulant des nanoparticules ne montre aucune différence significative de taille et d’indice de polydispersité.
La microscopie électronique à transmission des polyplexes confirme la formation de nanoparticules sphériques et mono dispersées d’environ 50 nanomètres de diamètre. Les données d’efficacité d’encapsulation d’un peptide Lego et de poly bêta-aminoesters modifiés polyplexes encapsulant la GFP, ou ovalbumine, ne montrent aucune différence significative selon le type d’ARNm. Une analyse qualitative de l’expression de l’EGFP, 24 heures après la transaction dans la lignée cellulaire JAWS II est présentée ici.
Quantitativement par rapport au contrôle négatif. Le pourcentage de cellules GFP positives est significativement plus élevé et comparable à un témoin positif effectué avec un réactif de transfection classique. L’oligopeptide chargé d’ARNm ovalbumine et les nanoparticules d’ester poly bêta-amino-aminé modifiées peuvent activer les cellules dendritiques, comme en témoigne l’expression significativement plus élevée des marqueurs membranaires CD11b et CD86 dans les cellules transfectées par rapport aux cellules non transfectées.
Notre plateforme de vaccination basée sur l’utilisation de l’ARNm comme principe actif, ainsi que nos polymères exclusifs peuvent être adaptés pour être utilisés en prophylaxie ainsi que pour les thérapies contre le cancer. Nous pouvons utiliser notre technologie pour mettre en évidence cette contribution dans les immunothérapies contre le cancer. puisque nous pouvons encapsuler des antigènes associés à la tumeur dans nos nanoparticules et faire un changement dans les traitements contre le cancer.
