L’analyse cryo-EM à particule unique est devenue une technique de routine dans la boîte à outils du biologiste structurel applicable à un large éventail d’échantillons, y compris les protéines membranaires, les fibrilles amyloïdes, les protéines de liaison aux acides nucléiques et les virus. Une fois la préparation des échantillons terminée et les grilles chargées au microscope, la collecte de données peut être effectuée à distance dans de nombreuses installations cryo-EM telles que le laboratoire de biostructure d’Astbury et eBIC. Les principaux obstacles à la détermination réussie de la structure résident souvent dans les étapes de préparation des échantillons et de criblage de la grille, avec de multiples itérations parfois nécessaires tout au long de ce processus.
Ici, nous démontrerons le criblage à distance de la grille et l’acquisition de données monoparticules. Dans l’onglet chargeur automatique de l’interface utilisateur du microscope, appuyez sur la boîte de dialogue des options à l’aide de la flèche et appuyez sur le bouton d’inventaire. Cela vérifiera séquentiellement chaque position dans la cassette pour déterminer si une cartouche est présente.
L’inventaire s’exécutera sur chaque emplacement séquentiellement. Lorsque tous les emplacements occupés sont mappés, l’inventaire s’arrête. Mettez en surbrillance la grille à transférer dans la colonne du microscope et cliquez sur Charger.
L’étiquette de la fente passera du bleu au jaune une fois que la grille aura été chargée avec succès sur la scène. Pour filtrer les grilles, ouvrez le logiciel EPU. Sur la page de préparation, sélectionnez optiques et paramètres d’acquisition, puis sélectionnez le préréglage de l’atlas dans le menu déroulant.
Choisissez les préréglages de réglage de faisceau appropriés et appuyez sur set pour pousser les paramètres au microscope. Appuyez pour ouvrir les vannes de colonne et insérez l’écran de grippe. Vérifiez qu’un faisceau est visible et suffisamment étalé et centré pour couvrir le détecteur.
Si nécessaire, accédez à une région plus mince de la grille à l’aide du joystick ou des panneaux de main virtuels pour contrôler les mouvements de la scène en X et Y.Soulevez l’écran de grippe et prenez une image à l’aide du bouton de prévisualisation de l’EPU. Dans EPU, accédez à la page de l’atlas et appuyez sur Nouvelle session. Sélectionnez le format d’image MRC et entrez un nom de dossier et un emplacement appropriés pour enregistrer la session de filtrage, puis cliquez sur Appliquer.
Sélectionnez le filtrage dans le menu de gauche. Cochez les cases à côté de chaque grille pour obtenir un montage d’atlas, puis démarrez la session de projection dans EPU. Un atlas est acquis pour chaque grille vérifiée et les carrés de grille disponibles sont répertoriés à la fin.
Chaque atlas peut être consulté en le mettant en évidence sur la page de projection. Une fois terminé, examinez les atlas collectés et identifiez les grilles appropriées pour évaluer la qualité de l’échantillon à des grossissements plus élevés. Mettez en surbrillance la grille choisie dans le menu de filtrage EPU et cliquez sur Exemple de charge.
Dans le menu de sélection de l’atlas, sélectionnez la grille actuellement chargée et déplacez la scène vers un carré de grille contenant les trous remplis en cliquant avec le bouton droit de la souris sur l’emplacement souhaité sur l’image de la grille et en sélectionnant Déplacer l’étape ici. Revenez à la page de préparation de l’EPU et sélectionnez le préréglage carré de grille. Ouvrez la page des fonctions automatiques de l’EPU et exécutez l’inclinaison auto-eucentrique par étage avec le préréglage carré de la grille pour déplacer l’échantillon à la hauteur eucentrique.
Dans la préparation de l’EPU, prenez une nouvelle image d’aperçu carré de grille. Notez les valeurs de gris sur différents trous indiquant différentes épaisseurs de glace. Déplacez la scène sur un trou en cliquant avec le bouton droit de la souris et déplacez la scène ici.
Sélectionnez le trou ou la hauteur eucentrique prédéfinie, puis cliquez sur Aperçu. Sélectionnez le préréglage d’acquisition de données et définissez un grossissement qui permet une identification facile des particules. Réglez le décalage de mise au point sur négatif de trois à cinq micromètres.
Itérez par étapes pour réévaluer une gamme d’épaisseurs de glace pour la distribution, l’orientation et la contamination des particules à travers le réseau. Selon la disponibilité du microscope, passez directement à la collecte de données ou les grilles peuvent être retirées du microscope pour une collecte future, y compris sur d’autres sites. Collectez un atlas s’il n’est pas disponible lors de la projection en configurant les paramètres de l’atlas et en sélectionnant la grille pour acquérir l’atlas.
Acquérez l’atlas et cliquez sur l’emplacement de la grille pour voir la sortie. Une fois l’atlas terminé, définissez chacun des préréglages de réglage du faisceau en fonction des besoins expérimentaux du projet. Effectuez des étalonnages de décalage d’image.
Configurez la session EPU en sélectionnant la configuration de la session de page EPU, puis en sélectionnant Nouvelle session ou Nouvelle dans les préférences. Après avoir sélectionné une nouvelle session, une fenêtre contextuelle apparaîtra offrant une option pour utiliser les paramètres précédents. Les paramètres se chargeront automatiquement de la session EPU précédente à la session EPU en cours.
Vous pouvez également sélectionner nouveau dans les préférences et choisir un fichier avec des préférences enregistrées pour précharger ces informations dans l’EPU actuel. Remplissez le nom de la session avec quelque chose d’informatif. Dans Type, sélectionnez manuel.
Pour le mode d’acquisition, sélectionnez un centrage précis des trous ou une acquisition plus rapide si la collection de décalage d’image sans aberration est disponible et souhaitée. Sélectionnez le format d’image souhaité, puis sélectionnez le dossier de stockage et EPU créera un répertoire avec le nom de la session. Sélectionnez la grille appropriée en fonction de l’espacement des trous de grille utilisé et appuyez sur Appliquer.
Sélectionnez un carré de grille initial et définissez un modèle d’acquisition. Accédez à la sélection carrée. Si tous les carrés sont verts, cliquez sur Désélectionner tout en haut à gauche.
Ouvrez les vignettes en cliquant avec le bouton droit de la souris, puis en sélectionnant Ouvrir la vignette. Ajoutez ou choisissez un carré de grille en cliquant sur Sélectionner, puis en cliquant avec le bouton droit de la souris et en sélectionnant Déplacer l’étape vers le carré de la grille. Accédez à la sélection des trous et appuyez sur auto-eucentrique.
Attendez qu’une image carrée de grille soit prise. Si la fonction automatique échoue, cela peut être dû au fait que la hauteur est considérablement réduite. Il peut être ajusté manuellement à l’aide de l’écran de grippe à un grossissement carré de grille.
Pour mesurer la taille des trous, déplacez et ajustez les cercles jaunes afin qu’ils soient au-dessus des trous avec une taille et un espacement corrects. Appuyez sur Trouver des trous. Vérifiez que les trous ont été trouvés correctement.
Si ce n’est pas le cas, modifiez la taille du trou et appuyez à nouveau sur Rechercher des trous. Si ce processus échoue systématiquement, envisagez de passer à un nombre inférieur ou à une taille de point plus brillante au grossissement carré de la grille. Utilisez l’histogramme de qualité de la glace filtrante sur la droite pour ajuster la sélection des trous.
Cela peut être utile pour exclure les zones avec de la glace épaisse et de la glace mince. On s’en souviendra pour les futurs carrés de grille sélectionnés au cours de la session. Optimisez la sélection des trous avec les outils du menu de sélection en haut.
Par exemple, cliquez sur Supprimer les trous près de la barre de grille. Accédez à la définition du modèle et appuyez sur Acquérir. Cliquez sur Rechercher et centrer le trou.
Modifiez le délai après le décalage de l’étape et le délai après le décalage de l’image à une à cinq secondes, puis, si disponible, vérifiez que la valeur maximale du décalage de l’image est souhaitée. Cliquez sur Ajouter une zone d’acquisition et cliquez n’importe où sur l’image. Déplacez la zone d’acquisition à l’emplacement souhaité.
Ajoutez la plage de défocalisation en haut à droite. Une liste de mise au point typique pour un projet de protéine membranaire est négative de 0,8 à négative de trois micromètres de mise au point, puis ajoute d’autres zones d’acquisition, en les organisant de manière à ce que les zones d’acquisition ne soient pas doublement exposées avec le faisceau. Cliquez sur Ajouter une zone de mise au point automatique et cliquez n’importe où sur l’image.
Déplacez la zone de mise au point automatique vers le carbone entourant un trou. La pratique standard consiste à faire la mise au point automatique après le centrage lors de l’utilisation d’AFIS ou tous les cinq à 15 micromètres en fonction de la variation de hauteur Z sur le carré. Cliquez sur Ajouter une zone de mesure de dérive.
Mesure de dérive effectuée une fois par carré de grille avec un seuil défini de 0,05 nanomètre par seconde comme réglage standard. La zone de mesure de la dérive peut chevaucher directement la zone de mise au point automatique. Assurez-vous qu’aucune zone de dérive ou de mise au point automatique ne chevauche une zone d’acquisition.
Revenez à la sélection carrée et sélectionnez les carrés à acquérir sur la grille. Utilisez le nombre de zones d’acquisition et le taux d’acquisition de données attendu pour prédire le nombre de zones d’acquisition requises. Lorsque tous les carrés souhaités sont sélectionnés, appuyez sur Préparer tous les carrés.
Une fois chaque carré collecté, naviguez entre les carrés de la grille et affinez les trous à l’aide du pinceau de sélection. Déplacez-vous vers un emplacement de scène au-dessus de l’échantillon et utilisez les fonctions automatiques pour définir la hauteur eucentrique. Effectuez des alignements de microscope à l’aide d’un logiciel de microscope comme décrit précédemment et dans le texte.
Effectuez un alignement sans coma dans les fonctions automatiques avant de réinsérer et de centrer l’ouverture de l’objectif et de corriger l’astigmatisme de l’objectif avec l’EPU. Assurez-vous que les deux alignements convergent vers des valeurs appropriées. Avant de commencer l’acquisition automatisée, assurez-vous que la turbopompe du chargeur automatique est éteinte et que l’ouverture de l’objectif est insérée si nécessaire.
Dans l’acquisition automatisée, appuyez sur Démarrer l’exécution pour commencer l’acquisition automatisée des données. En utilisant ce protocole, les grilles cassées ou sèches peuvent être filtrées et jetées au stade de l’atlas. Un gradient de glace est observé sur la majorité des grilles.
Lors du criblage, une distribution idéale des particules est monodispersée d’une gamme d’orientations de particules visibles. Si la glace est trop mince, elle peut fondre lorsqu’elle est éclairée par le faisceau d’électrons, provoquant un mouvement excessif dans la micrographie. Ceci est le plus souvent observé lorsqu’il y a du détergent dans le tampon.
La glace doit être vitrée, de sorte que les zones de la grille où la majorité des images montrent de la glace cristalline ont été exclues. Un résumé graphique des données a été inclus pour évaluer la qualité des micrographies et décider si des modifications à la collecte de données sont nécessaires. Les sélecteurs de particules tels que crYOLO fonctionnent suffisamment bien pour un premier passage des données, ce qui permet une progression vers la moyenne des classes 2D.
Les classes qui montrent les détails de la structure secondaire doivent être choisies pour l’analyse 3D tandis que les particules indésirables doivent être éliminées. Un sous-ensemble de particules peut être utilisé pour générer un modèle initial pour la classification et le raffinement 3D. Dans le cas de RagAB, l’ensemble de données contenait trois conformateurs distincts qui peuvent être séparés lors de la classification 3D.
Il est important de se rappeler que le succès de l’acquisition des données et des étapes ultérieures d’analyse d’images dépend de l’obtention et de l’identification de grilles bien optimisées pendant la phase de criblage. Une fois qu’une carte de densité EM 3D est obtenue, elle peut être interprétée plus avant en ajustant et en affinant un modèle de protéine ou en construisant un modèle atomique de novo. L’analyse cryo-EM à particule unique permet une détermination structurée de nombreuses cibles qui n’étaient pas possibles auparavant.
Notamment, ces flux de travail ont récemment été utilisés pour résoudre des structures de macromolécules liées à la COVID-19.
