Die Einzelpartikel-Kryo-EM-Analyse ist zu einer Routinetechnik im Werkzeugkasten des Strukturbiologen geworden, die auf eine Vielzahl von Proben anwendbar ist, darunter Membranproteine, Amyloidfibrillen, Nukleinsäure-bindende Proteine und Viren. Sobald die Probenvorbereitung abgeschlossen und die Gitter in das Mikroskop geladen sind, kann die Datenerfassung in vielen Kryo-EM-Einrichtungen wie dem Astbury Biostructure Laboratory und eBIC aus der Ferne durchgeführt werden. Große Hindernisse für eine erfolgreiche Strukturbestimmung liegen oft in den Phasen der Probenvorbereitung und des Rasterscreenings, wobei manchmal mehrere Iterationen durch diesen Prozess erforderlich sind.
Hier demonstrieren wir Remote Grid Screening und Einzelpartikeldatenerfassung. Öffnen Sie auf der Registerkarte Auto-Loader der Benutzeroberfläche des Mikroskops das Optionsdialogfeld mit dem Pfeil und drücken Sie die Inventartaste. Dadurch wird jede Position in der Kassette nacheinander überprüft, um festzustellen, ob eine Patrone vorhanden ist.
Das Inventar wird auf jedem Slot nacheinander ausgeführt. Wenn alle belegten Slots zugeordnet sind, stoppt das Inventar. Markieren Sie das Raster, das in die Mikroskopspalte übertragen werden soll, und klicken Sie auf Last.
Das Slot-Label wird von blau nach gelb, sobald das Gitter erfolgreich auf die Bühne geladen wurde. Um die Raster zu überprüfen, öffnen Sie die EPU-Software. Wählen Sie auf der Vorbereitungsseite die Erfassungsoptik und -einstellungen aus und wählen Sie dann die Atlasvorgabe aus dem Dropdown-Menü aus.
Wählen Sie die entsprechenden Strahleinstellungsvoreinstellungen und drücken Sie set, um die Parameter an das Mikroskop zu übertragen. Drücken Sie, um die Säulenventile zu öffnen und das Grippesieb einzusetzen. Überprüfen Sie, ob ein Strahl sichtbar und ausreichend verteilt und zentriert ist, um den Detektor abzudecken.
Navigieren Sie bei Bedarf mit dem Joystick oder virtuellen Handpanels zu einem dünneren Bereich des Rasters, um die Bühnenbewegungen in X und Y zu steuern.Heben Sie den Grippebildschirm an und nehmen Sie ein Bild mit der Vorschautaste in EPU auf. Gehen Sie in EPU zur Atlasseite und drücken Sie neue Sitzung. Wählen Sie das MRC-Bildformat aus, geben Sie einen geeigneten Ordnernamen und Speicherort für die Screening-Sitzung ein, und klicken Sie dann auf Übernehmen.
Wählen Sie Screening aus dem Menü auf der linken Seite. Aktivieren Sie die Kontrollkästchen neben jedem Raster, um eine Atlasmontage zu erhalten, und starten Sie dann die Screening-Sitzung in EPU. Für jedes geprüfte Gitter wird ein Atlas erstellt und die verfügbaren Gitterquadrate werden nach Fertigstellung aufgelistet.
Jeder Atlas kann angezeigt werden, indem er auf der Screening-Seite hervorgehoben wird. Wenn Sie fertig sind, überprüfen Sie die gesammelten Atlanten und identifizieren Sie die Gitter, die für die Beurteilung der Probenqualität bei höheren Vergrößerungen geeignet sind. Markieren Sie das ausgewählte Raster im Menü EPU-Screening, und klicken Sie auf Beispiel laden.
Wählen Sie im Atlas-Screening-Menü das derzeit geladene Raster aus und verschieben Sie die Bühne in ein Gitterquadrat, das die gefüllten Löcher enthält, indem Sie mit der rechten Maustaste über die gewünschte Position im Rasterbild klicken und hier Stufe verschieben auswählen. Kehren Sie zur EPU-Vorbereitungsseite zurück und wählen Sie die Voreinstellung für das Rasterquadrat aus. Öffnen Sie die EPU-Autofunktionsseite und führen Sie auto-euzentrisch durch Stufenneigung mit der Voreinstellung des Rasterquadrats aus, um das Sample auf euzentrische Höhe zu verschieben.
Nehmen Sie in der EPU-Vorbereitung ein neues Rasterquadrat-Vorschaubild auf. Beachten Sie die Grauwerte in verschiedenen Löchern, die unterschiedliche Eisdicken anzeigen. Bewegen Sie die Bühne mit der rechten Maustaste über ein Loch und verschieben Sie die Stufe hier.
Wählen Sie die Loch- oder euzentrische Höhenvorgabe aus, und klicken Sie dann auf Vorschau. Wählen Sie die Voreinstellung für die Datenerfassung und stellen Sie eine Vergrößerung ein, die eine einfache Identifizierung der Partikel ermöglicht. Stellen Sie den Defokussierungsversatz auf negativ drei bis fünf Mikrometer ein.
Durchlaufen Sie Schritte, um einen Bereich der Eisdicke für die Partikelverteilung, -orientierung und -kontamination im gesamten Gitter neu zu bewerten. Abhängig von der Verfügbarkeit des Mikroskops fahren Sie direkt mit der Datenerfassung fort oder Gitter können für die zukünftige Sammlung auch an anderen Standorten aus dem Mikroskop entfernt werden. Sammeln Sie einen Atlas, wenn einer nicht verfügbar ist, indem Sie Atlaseinstellungen einrichten und das Raster auswählen, um atlas zu erfassen.
Erfassen Sie den Atlas und klicken Sie auf den Netzstandort, um die Ausgabe zu sehen. Sobald der Atlas fertig ist, definieren Sie jede der Voreinstellungen für die Strahleinstellung entsprechend den experimentellen Anforderungen des Projekts. Führen Sie Bildverschiebungskalibrierungen durch.
Richten Sie die EPU-Sitzung ein, indem Sie die EPU-Seite Sitzung einrichten und dann entweder neue Sitzung oder neu aus den Einstellungen auswählen. Nachdem Sie neue Sitzung ausgewählt haben, erscheint ein Popup-Fenster mit der Option, vorherige Einstellungen zu verwenden. Die Einstellungen werden automatisch von der vorherigen zur aktuellen EPU-Sitzung geladen.
Alternativ können Sie "Neu" aus den Voreinstellungen auswählen und eine Datei mit gespeicherten Voreinstellungen auswählen, um diese Informationen vorab in die aktuelle EPU zu laden. Füllen Sie den Sitzungsnamen mit etwas Informativem aus. Wählen Sie unter Typ die Option Manuell aus.
Wählen Sie für den Erfassungsmodus eine genaue Lochzentrierung oder eine schnellere Erfassung, wenn eine aberrationsfreie Bildverschiebungssammlung verfügbar und gewünscht ist. Wählen Sie das gewünschte Bildformat, dann den Speicherordner und EPU erstellt ein Verzeichnis mit dem Sitzungsnamen. Wählen Sie das entsprechende Raster aus, je nachdem, welcher Rasterlochabstand verwendet wird, und klicken Sie auf Übernehmen.
Wählen Sie ein anfängliches Rasterquadrat aus und legen Sie eine Erfassungsvorlage fest. Gehen Sie zur Quadratischen Auswahl. Wenn alle Quadrate grün sind, klicken Sie oben links auf Auswahl aufheben.
Öffnen Sie Kacheln, indem Sie mit der rechten Maustaste klicken und dann Kachel öffnen auswählen. Fügen Sie ein Rasterquadrat hinzu oder wählen Sie es aus, indem Sie auf Auswählen klicken, dann mit der rechten Maustaste klicken und Bühne in Rasterquadrat verschieben auswählen. Gehen Sie zur Lochauswahl und drücken Sie auto-euzentrisch.
Warten Sie, bis ein Rasterquadratbild aufgenommen wurde. Wenn die Autofunktion fehlschlägt, kann dies daran liegen, dass die Höhe erheblich abweicht. Es kann manuell mit dem Grippeschutz bei Gitterquadratvergrößerung eingestellt werden.
Um die Lochgröße zu messen, bewegen und passen Sie die gelben Kreise so an, dass sie sich mit der richtigen Größe und dem richtigen Abstand über den Löchern befinden. Drücken Sie auf Löcher finden. Überprüfen Sie, ob die Löcher korrekt gefunden wurden.
Wenn nicht, ändern Sie die Lochgröße und drücken Sie erneut auf Löcher suchen. Wenn dieser Prozess konsequent fehlschlägt, sollten Sie in Betracht ziehen, bei Gitterquadratvergrößerung zu einer niedrigeren Zahl oder einer helleren Spotgröße zu wechseln. Verwenden Sie das Filter-Eisqualitätshistogramm auf der rechten Seite, um die Lochauswahl anzupassen.
Dies kann nützlich sein, um Bereiche mit dickem Eis und dünnem Eis auszuschließen. Dies wird für zukünftige Gitterquadrate, die während der Sitzung ausgewählt werden, gespeichert. Optimieren Sie die Bohrungsauswahl mit den Werkzeugen im Auswahlmenü oben.
Klicken Sie beispielsweise auf Bohrungen in der Nähe der Rasterleiste entfernen. Gehen Sie zur Vorlagendefinition und drücken Sie auf Erwerben. Klicken Sie auf Bohrloch suchen und zentrieren.
Ändern Sie die Verzögerung nach der Stufenverschiebung und die Verzögerung nach der Bildverschiebung auf ein bis fünf Sekunden, und überprüfen Sie dann, falls verfügbar, den maximalen Bildverschiebungswert wie gewünscht. Klicken Sie auf Erfassungsbereich hinzufügen und klicken Sie auf eine beliebige Stelle auf das Bild. Verschieben Sie den Erfassungsbereich an den gewünschten Speicherort.
Fügen Sie den Defokusbereich oben rechts hinzu. Eine typische Defokussierungsliste für ein Membranproteinprojekt ist eine negative Defokussierung von 0,8 bis negativen drei Mikrometern, dann fügen Sie andere Erfassungsbereiche hinzu und ordnen Sie sie so an, dass Bereiche der Erfassung nicht doppelt mit dem Strahl belichtet werden. Klicken Sie auf Autofokusbereich hinzufügen und klicken Sie auf eine beliebige Stelle im Bild.
Verschieben Sie den Autofokusbereich auf das Carbon, das ein Loch umgibt. Standardpraxis ist der Autofokus nach der Zentrierung bei Verwendung von AFIS oder alle fünf bis 15 Mikrometer, abhängig von der Z-Höhenvariation über das Quadrat. Klicken Sie auf Driftmessbereich hinzufügen.
Die Driftmessung wird einmal pro Gitterquadrat mit einem festgelegten Schwellenwert von 0,05 Nanometern pro Sekunde als Standardeinstellung durchgeführt. Der Driftmessbereich kann sich direkt mit dem Autofokusbereich überlappen. Stellen Sie sicher, dass sich weder der Drift- noch der Autofokusbereich mit einem Erfassungsbereich überlappen.
Gehen Sie zurück zur Quadratauswahl und wählen Sie die Quadrate für die Erfassung im Raster aus. Verwenden Sie die Anzahl der Erfassungsbereiche und die erwartete Datenerfassungsrate, um vorherzusagen, wie viele Erfassungsbereiche erforderlich sind. Wenn alle gewünschten Quadrate ausgewählt sind, drücken Sie alle Quadrate vorbereiten.
Sobald jedes Quadrat gesammelt ist, navigieren Sie zwischen den Gitterquadraten und verfeinern Sie die Löcher mit dem Auswahlpinsel. Bewegen Sie sich zu einer Bühnenposition über der Probe und verwenden Sie auto-Funktionen, um die euzentrische Höhe einzustellen. Führen Sie Mikroskopausrichtungen mit Mikroskopsoftware durch, wie zuvor und im Text beschrieben.
Führen Sie eine komafreie Ausrichtung innerhalb der Autofunktionen durch, bevor Sie die Objektivblende wieder einsetzen und zentrieren und den Objektivastigmatismus mit EPU korrigieren. Stellen Sie sicher, dass beide Ausrichtungen zu geeigneten Werten konvergieren. Bevor Sie mit dem automatischen Erfassungslauf beginnen, stellen Sie sicher, dass die Turbopumpe des automatischen Laders ausgeschaltet ist und die Objektivöffnung bei Bedarf eingesetzt ist.
Bei der automatisierten Erfassung drücken Sie den Startlauf, um mit der automatisierten Datenerfassung zu beginnen. Mit diesem Protokoll können gebrochene oder trockene Gitter im Atlasstadium gescreent und verworfen werden. Ein Gradient von Eis wird über die meisten Gitter beobachtet.
Während des Screenings wird eine ideale Partikelverteilung monodispersiert, wobei eine Reihe von Partikelorientierungen sichtbar sind. Wenn Eis zu dünn ist, kann es schmelzen, wenn es mit dem Elektronenstrahl beleuchtet wird, was zu einer übermäßigen Bewegung in der Mikroaufnahme führt. Dies wird am häufigsten beobachtet, wenn sich Reinigungsmittel im Puffer befindet.
Das Eis muss glasig sein, so dass Bereiche des Gitters, in denen die Mehrheit der Bilder kristallines Eis zeigt, ausgeschlossen wurden. Eine grafische Zusammenfassung der Daten wurde aufgenommen, um die Qualität der Mikroaufnahme zu bewerten und zu entscheiden, ob Änderungen an der Datenerhebung erforderlich sind. Partikelpicker wie crYOLO funktionieren ausreichend gut für einen ersten Durchlauf der Daten und ermöglichen den Übergang zur 2D-Klassenmittelung.
Klassen, die sekundäre Strukturdetails zeigen, sollten für die 3D-Analyse ausgewählt werden, während Junk-Partikel verworfen werden sollten. Eine Teilmenge von Partikeln kann verwendet werden, um ein erstes Modell für die 3D-Klassifizierung und -Verfeinerung zu generieren. Im Fall von RagAB enthielt der Datensatz drei verschiedene Konformere, die bei der 3D-Klassifizierung getrennt werden können.
Es ist wichtig, sich daran zu erinnern, dass der Erfolg bei der Datenerfassung und den nachfolgenden Bildanalyseschritten davon abhängt, dass während der Screening-Phase gut optimierte Gitter erhalten und identifiziert werden. Sobald eine 3D-EM-Dichtekarte erhalten ist, kann sie durch Anpassen und Verfeinern eines Proteinmodells oder Erstellen eines Atommodells de novo weiter interpretiert werden. Die Kryo-EM-Einzelpartikelanalyse ermöglicht eine strukturierte Bestimmung vieler Targets, die bisher nicht möglich waren.
Insbesondere wurden diese Workflows kürzlich verwendet, um Strukturen von COVID-19-bedingten Makromolekülen zu lösen.
