The author thanks R. Boss, A. Cosandey, C. Fournier, I. Ivanovic, and J. Naskova for their excellent work.

1. Staphylococcus aureus <ol><li> Étaler 10 pi de S. aureus culture mère ou une colonie cultivée sur un milieu sélectif sur des plaques de gélose Columbia contenant du sang de mouton à 5% (BA). </li><li> Incuber aérobies à 37 ° C pendant 18 h à 24 h. </li></ol> 2. Extraction de l&#39;ADN <ol><li> Préparer un tampon contenant du Tris TEL-HCl 10 mM et 10 mM de Na2EDTA, pH 8,5. Préparer des aliquotes et autoclave à 121 ° C pendant 15 min. </li><li> Collecter une colonie de BA à l&#39;aide d&#39;une anse stérile en matière plastique ou d&#39;un cure-dent en bois stérile et remettre en suspension dans 100 ul TEL. Utiliser 1,5 ml tubes avec bouchons à vis. </li><li> Incuber à 95 ° C pendant 10 min. Ensuite, placez les échantillons immédiatement sur de la glace. </li><li> Diluer les échantillons 1: 100 dans H 2 O approprié pour la PCR (= ADN matrice pour la PCR). Les échantillons non dilués et dilués peuvent être conservés à -20 ° C pendant 1 mois. </li></ol> 3. RS-PCR <ol><li&gt; Pour chaque échantillon , la pipette dans un tube de PCR 1,5 ul de H 2 O, 12,5 pi de Taq Master Mix, 2 ul G1 amorce 10 pM, 2 ul L1 amorce 10 pM, et 7 ul de l&#39; ADN matrice qui correspond à environ 30 ng de pureté DNA 2. </li><li> Exécuter le programme de cyclage suivant dans un thermocycleur standard de PCR: 15 min 95 ° C, suivie par 27 cycles comprenant 94 ° C pendant 1 min, suivie d&#39;une rampe 2 min et recuit à 55 ° C pendant 7 min. Après encore 2 min rampe, étendre à 72 ° C pendant 2 min. Se terminer par PCR par une extension finale à 72 ° C pendant 10 min suivi par un refroidissement à 4 ° C. REMARQUE: Les produits de PCR peuvent être conservés à -20 ° C pendant 5 jours. </li><li> Pour chaque série de RS-PCR comprend un contrôle positif, à savoir, un échantillon avec un génotype connu (normalement GTB), et un contrôle négatif (H 2 O). </li></ol> 4. Electrophorèse <ol><li> Utilisez un kit commercial d&#39;électrophorèse miniaturisé pour l&#39;ADN (kit MED) ensembleavec un Bioanalyseur connecté à un PC et le logiciel installé. Étudier les manuels correspondants du fabricant avec soin. </li><li> Mettre en place la station d&#39;amorçage de la puce et ajuster le clip de seringue selon le manuel du fabricant. </li><li> Préparer le mélange gel colorant selon le manuel du fabricant. </li><li> Chargement du mélange gel-dye (selon le manuel du fabricant). <ol><li> Equilibrer le mélange gel colorant à la température ambiante pendant 30 min avant utilisation. </li><li> Mettez nouvelle puce à ADN sur la station puce d&#39;amorçage. Pipette 9 pi de gel colorant dans le G. bien marqué </li><li> Assurez-vous que le piston est positionné à 1 ml, puis fermer la station puce d&#39;amorçage. Appuyez sur le piston jusqu&#39;à ce qu&#39;il soit maintenu par la pince de seringue. Attendre exactement pendant 30 secondes, puis relâchez le clip de la seringue. </li><li> Attendre 5 sec. Tirez lentement le piston pour 1 ml poste. </li><li> station d&#39;amorçage Open puce et pipette 9 pi de gel colorant dans les deux puits marqués &#39;G&#39;. </li></ol></li><li> Chargement du Marker <ol><li> Pipette 5 pi de marqueur dans l&#39;ensemble des 12 puits d&#39;échantillon et à bien l&#39;échelle. Ne laissez pas l&#39;un de ces 13 puits vides. </li></ol></li><li> Chargement du Ladder et les échantillons. <ol><li> Pipette 1 pi d&#39;échelle d&#39;ADN pour le bien-marqué du signe de l&#39;échelle. </li><li> 1 ul d&#39;échantillon (puits utilisés) ou 1 pi d&#39;eau déminéralisée (puits non utilisés). </li><li> Mettre la puce horizontalement dans l&#39;adaptateur et le vortex pendant 1 min à 2400 rpm. </li><li> Exécutez la puce dans le Bioanalyseur à moins de 5 min. </li></ol></li><li> Exécution de l&#39;analyse <ol><li> Démarrez le Bioanalyseur et l&#39;ordinateur connecté. Ouvrez le logiciel. </li><li> Ouvrez le couvercle du Bioanalyseur et placez la puce dans le support de puce (la puce correspond à une seule façon). Fermez le couvercle avec précaution. </li><li> Dans le cadre de l&#39; instrument du logiciel sélectionnez &quot;Electrophoresis&quot;&gt; &quot;ADNdb&quot;&gt; &quot;DNA 7500&quot;. Acceptez le préfixe du fichier en cours du logiciel ou de le modifier.</li><li> Cliquez sur le bouton de démarrage présente dans le logiciel. Entrez les noms des échantillons dans le logiciel. Lorsque la course à puce est terminée (après environ 30 min) , la Fin du message Run apparaît dans le logiciel de Bioanalyseur. </li><li> Retirer la puce et nettoyer les électrodes de la Bioanalyseur selon les instructions du fabricant. </li></ol></li></ol> 5. Déduire le Génotype du profil Electrophoresis <ol><li> Chargez le logiciel Mahal (logiciel est disponible gratuitement auprès des auteurs). </li><li> des données de référence à l&#39;importation dans le logiciel Mahal: &quot;Fichier&quot;&gt; &quot;Importer des données de référence&quot; </li><li> Ouvrez l&#39;électrophorèse exécuter dans le contexte des données du logiciel Bioanalyseur. Sélectionnez un profil d&#39;électrophorèse d&#39;un échantillon. </li><li> Vérifiez les pics pertinents. <ol><li> Utilisez le logiciel Mahal pour vérifier les pics pertinents: &quot;Outils&quot;&gt; &quot;Fluorescence moyenne&quot;. Insérez dans la boîte &quot;Fluorescence&quot;les valeurs de fluorescence ont indiqué que les unités de fluorescence (FU), car ils peuvent être lus à partir du logiciel bioanalyser. Insérez les 4 (3) pics avec la plus haute fluorescence dans l&#39;ordre croissant et séparés par des virgules. Exemple: 126130132137. NOTE: Si tous ces pics FU sont indiqués par le logiciel Bioanalyseur, ils doivent être estimés en les lisant à partir de la parcelle. </li></ol></li><li> Appuyez sur le bouton «Calculer». Un pic est pertinent si la fluorescence observée dépasse la valeur indiquée dans la case «hauteur du pic Minimal&quot;. </li><li> Déduire le génotype. <ol><li> Insérer dans les textbox Mahal &quot;Peaks d&#39;entrée (pb)&quot; les tailles pb de tous les pics pertinents dans l&#39;ordre croissant et séparés par des virgules. Exemple: 440.462.519.579.637. NOTE: Si toutes ces dimensions maximales sont indiquées par le logiciel Bioanalyseur, ils doivent être estimés en les lisant à partir de la parcelle. </li></ol></li><li> Appuyez sur le bouton «Calculer». </li><li> Dans la listeboîte, chercher le minimum carré Mahalanobis distance &quot;D2M&quot;. Si la valeur de P droit correspondant à il est ≥0.05 alors la probabilité est ≥5% que l&#39;hypothèse nulle H 0 est rejetée (H 0: l&#39;observé et le profil de référence sont identiques) ce qui signifie que le profil observé est accepté d&#39;être identique à le profil de référence du génotype indiqué. </li><li> Si D2M est minime , mais le champ de la valeur P correspondant est vide, rejeter H 0 avec une probabilité &lt;5%. NOTE: Cela signifie que les profils sont inégaux bien D2M est minime. Un tel résultat peut résulter de conditions d&#39;électrophorèse non-moyenne. <ol><li> Pour corriger ces écarts, insérer dans la zone de texte &quot;Observé Peak (pb)&quot; la valeur 395 et appuyez sur le bouton &quot;Calculer&quot;. Vérifiez à nouveau pour D2M minimale et une ≥0.05 P de valeur correspondant. En cas d&#39;échec, essayez les valeurs 405, 415, et 425. REMARQUE: Parfois, les petites étapes sont encoreindiqué. Si toujours pas réussi, le profil observé est pas présent dans les données de référence, il peut être un nouveau génotype ou variante. </li></ol></li><li> Divers Profils <ol><li> Répéter les étapes 05.06 à 05.09 pour chaque profil d&#39;électrophorèse séparément. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Sears, P. M., McCarthy, K. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Management+and+treatment+of+staphylococcal+mastitis.">Management and treatment of staphylococcal mastitis.</a> Vet.Clin.North Am.Food Anim.Pract. 19 (1), 171-185 (2003).</li><li>Fournier, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bovine+Staphylococcus+aureus:+association+of+virulence+genes,+genotypes+and+clinical+outcome.">Bovine Staphylococcus aureus: association of virulence genes, genotypes and clinical outcome.</a> Res.Vet.Sci. 85 (3), 439-448 (2008).</li><li>Cosandey, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Staphylococcus+aureus+genotype+B+and+other+genotypes+isolated+from+cow+milk+in+European+countries.">Staphylococcus aureus genotype B and other genotypes isolated from cow milk in European countries.</a> J.Dairy Sci. 99 (1), 529-540 (2016).</li><li>Boss, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bovine+Staphylococcus+aureus:+Subtyping,+evolution,+and+zoonotic+transfer.">Bovine Staphylococcus aureus: Subtyping, evolution, and zoonotic transfer.</a> J.Dairy Sci. 99 (1), 515-528 (2016).</li><li>Graber, H. U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mastitis-related+subtypes+of+bovine+Staphylococcus+aureus+are+characterized+by+different+clinical+properties.">Mastitis-related subtypes of bovine Staphylococcus aureus are characterized by different clinical properties.</a> J.Dairy Sci. 92 (4), 1442-1451 (2009).</li><li>Heiniger, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kosten-Nutzen-Analyse+einer+Intervention+zur+Verbesserung+der+Eutergesundheit+in+Schweizer+Milchviehbetrieben.">Kosten-Nutzen-Analyse einer Intervention zur Verbesserung der Eutergesundheit in Schweizer Milchviehbetrieben.</a> Schweiz.Arch.Tierheilkd. 156 (10), 473-481 (2014).</li><li>Hamann, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Definition+of+the+physiological+cell+count+threshold+based+on+changes+in+milk+composition.">Definition of the physiological cell count threshold based on changes in milk composition.</a> IDF Mastitis Newsletter. 25, 9-12 (2003).</li><li>Hwang, S. 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C., Day, N. P., Davies, C. E., Peacock, S. J., Spratt, B. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multilocus+sequence+typing+for+characterization+of+methicillin-resistant+and+methicillin-susceptible+clones+of+Staphylococcus+aureus.">Multilocus sequence typing for characterization of methicillin-resistant and methicillin-susceptible clones of Staphylococcus aureus.</a> J.Clin.Microbiol. 38 (3), 1008-1015 (2000).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

L&#39;étape la plus critique de toute la procédure est quand il y a un excès d&#39;ADN dans RS-PCR (&gt; 30 ng pur ADN / dosage) 2. En général, la résolution d&#39;un profil est optimale si tous ses sommets commencent et se terminent à la ligne de base. Si deux pics sont trop rapprochés, la résolution est incomplète. Dans ces conditions, le logiciel peut conduire à bioanalyser inappropriée identification des pics de telle sorte que l&#39;identification manuelle est nécessaire. Tous les pics visiblement séparés et pertinents exprimés en pb ou FU sont incluses pour d&#39;autres analyses. ADN matrice Trop pour RS-PCR se traduit par des pics larges et donc à pic résolution chevauchement et une altération des pics. En outre, la migration est le plus important ralentissement au pic des tailles qui sont faussement augmenté de sorte que le génotype ne peut plus être déduite. Enfin, le nombre de pics pertinents est plus grand. Pour les profils de plus de 3 pics, le pic de fluorescence maximale ne devrait pas dépasser 150 FU. Génotypage par RS-PCR comme décrit est limitée par le fait que l&#39;investissement dans les machines est nécessaire et le logiciel libre Mahal est nécessaire. En effet, une machine standard de PCR et le bioanalyseur sont nécessaires. Le premier est plutôt pas cher de nos jours, alors que le second est plus cher. La résolution de l&#39;électrophorèse à base d&#39;agarose ne suffit pas, même si haute résolution agarose est utilisé. Dans ces conditions, il est seulement possible de faire la distinction entre GTB, GTC, et tous les autres génotypes. Les coûts pour l&#39;électrophorèse en utilisant le kit MED ou une électrophorèse sur agarose, cependant, sont similaires. Le kit MED avec le Bioanalyseur plus performant que l&#39;électrophorèse agarose standard dans une manière que cette dernière méthode est pratique, simple, et les données obtenues est présent sous forme électronique qui simplifie le stockage et une analyse plus poussée considérablement. Principalement tous les bioanalyzers disponibles dans le commerce sont appropriés pour ce type d&#39;analyse à condition que le electrophoretrésolution ic est adéquate et la taille obtenue des bandes est exacte et impartiale. La résolution de RS-PCR pour les souches bovines de S. aureus est élevé. Il est aussi bon que spa dactylographie, et mieux que MLST et ECP 4,14. En outre, par rapport à toutes les autres méthodes de typage couramment utilisés pour le sous - typage S. aureus (spa dactylographie, MLST, ECP), son débit d&#39;échantillons est élevé: l&#39; extraction d&#39;ADN est facile et rapide, 96 échantillons peuvent être traités en un seul passage RCR (normalement O / N) et l&#39; électrophorèse et le génotype inférant est simple. L&#39;analyse complète des 96 échantillons nécessite une nuit pour la PCR et un jour pour l&#39;électrophorèse et l&#39;évaluation. D&#39; autres avantages de RS-PCR par Fournier et al. 2 sont les faibles coûts, en particulier par rapport à MLST qui nécessite sept gènes à séquencés dans les deux directions 15. En outre, RS-PCR est la seule méthode prédire contagiosité et la pathogénicité des souches deS. aureus impliqués dans la mammite bovine 2,5, prédicteurs clés en médecine vétérinaire clinique. Enfin, RS-PCR seul est suffisant pour étudier l&#39;épidémiologie de S. bovine aureus 3,4,5,14. L&#39; interprétation des données est simple , même dans un contexte international en tant que quelques génotypes majeurs sont observés 2,3. Pour les comparaisons épidémiologiques entre les bovins et les souches humaines, RS-PCR et le spa typage ensemble sont préférables car cette dernière méthode est largement utilisée pour le typage des souches humaines de sorte que beaucoup de données sont disponibles. MLST, cependant, est apte à évaluer la clonalité des souches 15 et pour les analyses phylogénétiques 4. Pour le dépannage concernant le cycleur PCR, kit MED et le Bioanalyseur, les manuels correspondants doivent être consultés. Dans le cas de la méthode RS-PCR, le dépannage est massivement simplifiée si les contrôles de PCR positifs et négatifs appropriés sont included dans chaque série. Si le contrôle positif est négatif, le mélange de PCR n&#39;a pas été composé de manière adéquate et / ou l&#39;ADN de contrôle a été dégradé. Si le contrôle négatif (H 2 O) a généré une ou plusieurs bandes, le mélange de PCR a été contaminé par un peu d&#39; ADN. Dans les deux cas, les profils ne doivent pas être interprétées et RS-PCR doit être répétée. Si l&#39;interprétation est impossible en raison d&#39;un problème électrophorétique, électrophorèse doit être répété en utilisant une nouvelle puce. problèmes électrophorétiques sont normalement caractérisés par la migration inadéquate et l&#39;alignement de l&#39;un ou les deux bandes de marqueur résultant de chargement inapproprié et la manipulation de la puce. Si le profil d&#39;électrophorèse obtenu ne peut pas être interprété par le logiciel Mahal, le fichier de profil généré par le logiciel de Bioanalyseur est envoyé à l&#39;auteur pour une évaluation plus poussée. Normalement, l&#39;ADN matrice trop a été utilisé pour RS-PCR ou le profil représente un nouveau génotype ou variant génotypique.

Staphylocoques (S. aureus) est connu comme le pathogène le plus important dans le monde responsable de l&#39; infection intra - mammaire (IMI) chez les bovins 1. L&#39;étude menée par Fournier et al. 2 démontré chez les vaches suisses, les études réalisées par Cosandey et al. 3 et Boss et al. 4 vaches de 12 pays européens que S. aureus isolé de bovin IMI est un groupe génétiquement hétérogène. Par amplification par PCR de la région d&#39;espaceur intergénique 16S-23S ARNr (RS-PCR), un total de 17 génotypes ont été initialement détecté dans 101 isolats épidémiologiquement indépendants 2. Génotype B et le génotype C (GTC) étaient les plus fréquentes (80%), tandis que les 15 autres génotypes (SMT) se sont produits rarement, chaque prise de 1 à 4% de tous les isolats. Au niveau européen 3, GTB, GTC, GTF, GTI et GTR étaient les génotypes les plus importants , comprenant 76% de toutes les souches analysées (n = 456). GTB était situé en Europe centrale wconsidérant que les autres génotypes ont été largement diffusés. Les 24% restants des souches inclus 41 génotypes, beaucoup d&#39;entre eux, cependant, ont été observés une seule fois. Les études menées par Fournier et al. 2, Cosandey et al. 3, et Graber et al. 5 ont démontré en outre que les génotypes étaient fortement associés à leur modèle de gène de virulence, ainsi que le suisse au niveau européen. Les autres études ont révélé des différences massives dans la prévalence IMI chez S. aureus GTB, GTC et les autres génotypes 2,5: compte tenu de GTB, jusqu&#39;à 87% des vaches dans un troupeau ont été infectées par ce génotype. Dans le cas du GTC et des autres génotypes, cependant, l&#39;IMI a été trouvé que dans 1 à 2 vaches d&#39;un troupeau. IMI causée par S. aureus, se traduit normalement par une inflammation des glandes mammaires correspondant et une augmentation des cellules inflammatoires dans le lait. En conséquence, la coopération de cellules somatiquesunts dans le lait (SCC), l&#39;indicateur clé de la qualité du lait dans la plupart des pays, est augmenté conduisant à un prix du lait a diminué ou même l&#39;arrêt de la livraison. En plus de l&#39;interface RS-PCR de Fournier et al. 2, d&#39; autres méthodes de typage ont été décrites pour le sous - typage des souches bovines de S. aureus 8-11. Deux plus communs comprennent le typage spa 12 et Multi Locus Sequence Typing (MLST) 13. L&#39;ancien est basée sur le séquençage d&#39; ADN de la région d&#39;espacement variable du gène codant spa pour la protéine A staphylococcique, alors que celui - ci nécessite une séquencement de 7 gènes de ménage. Cela signifie qu&#39;un 12 et 13 sept PCR, respectivement, doivent être réalisées, suivies d&#39; une purification de l&#39; amplicon, une réaction de séquençage et l&#39; analyse en utilisant un équipement spécifique. Par rapport à RS-PCR, ces méthodes nécessitent un effort supplémentaire considérable dans le laboratoire résultant en un débit d&#39;échantillons faibles et des coûts élevés. lele débit est particulièrement faible pour les ECP. Compte tenu de la résolution de ces méthodes pour les souches bovines de S. aureus, RS-PCR est au moins aussi bon que spa tapant 4 et mieux que MLST 4 ou ECP 15. Toutes ces méthodes , y compris la dactylographie binaire 13 ont démontré leur efficacité dans l&#39; obtention d&#39; un éclairage supplémentaire sur la pathogenèse de bovins IMI causée par S. aureus, mais à cause des restrictions mentionnées ils sont moins appropriés pour les grandes investigations cliniques. En outre, le génotypage par RS-PCR comme décrit par Fournier et al. 2 permet la prédiction fiable de l&#39;épidémiologie et le potentiel pathogène de S. aureus impliqué dans l&#39; IMI bovine, deux valeurs clés de la médecine vétérinaire clinique.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="616">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Tris(hydroxymethyl)-aminomethan</td>
			<td style="width:100px;">Merck</td>
			<td style="width:119px;">1.08382.0500</td>
			<td style="width:181px;">Mw =121.14g/mol</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Titriplex III</td>
			<td style="width:100px;">Merck</td>
			<td style="width:119px;">1.08418.0250</td>
			<td>Mw = 372.24g/mol; Substance is equivalent to Na2EDTA&#183;2H2O</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Hydrochloric acid 5mol/l</td>
			<td style="width:100px;">Merck</td>
			<td style="width:119px;">1.09911.0001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Columbia agar+5% sheep blood</td>
			<td style="width:100px;">bioM&#233;rieux</td>
			<td style="width:119px;">43049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Agilent DNA7500 Kit</td>
			<td style="width:100px;">Agilent Technologies</td>
			<td style="width:119px;">5067-1504</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Agilent 2100 Bioanalyzer</td>
			<td style="width:100px;">Agilent Technologies</td>
			<td style="width:119px;">G2940CA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Agilent 2100 expert sofware</td>
			<td style="width:100px;">Agilent Technologies</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">HotStarTaq master mix&#160;</td>
			<td style="width:100px;">Qiagen</td>
			<td align="right" style="width:119px;">203445</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Primer L1</td>
			<td style="width:100px;">Mycrosinth</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>5&#39;CAA GGC ATC CAC CGT3&#39;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Primer G1</td>
			<td style="width:100px;">Mycrosinth</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>5&#39;GAA GTC GTA ACA AGG3&#39;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

genotyping of staphylococcus aureus by ribosomal spacer pcr (rs-pcr)

The ribosomal spacer PCR (RS-PCR) is a highly resolving and robust genotyping method for S. aureus that allows a high throughput at moderate costs and is, therefore, suitable to be used for routine purposes. For best resolution, data evaluation and data management, a miniaturized electrophoresis system is required. Together with such an electrophoresis system and the in-house developed software (freely available here) assignment of the pattern of bands to a genotype is standardized and straight forward. DNA extraction is simple (boiling prep), setting-up of the reactions is easy and they can be run on any standard PCR machine. PCR cycling is common except prolonged ramping and elongation times. Compared to spa typing and Multi Locus Sequence Typing (MLST), RS-PCR does not require DNA sequencing what simplifies the analysis considerably and allows a high throughput. Furthermore, the resolution for bovine strains of S. aureus is at least as good as spa typing and better than MLST or pulsed-field gel electrophoresis (PFGE). The RS-PCR data base includes presently a total of 141 genotypes and variants. The method is highly associated with the virulence gene pattern, contagiosity and pathogenicity of S. aureus strains involved in bovine mastitis. S. aureus genotype B (GTB) is contagious and causes herds problems causing large costs in the Switzerland and other European countries. All the other genotypes observed in Switzerland infect individual cows and quarters. Genotyping by RS-PCR allows the reliable prediction of the epidemiological and the pathogenic potential of S. aureus involved in bovine intramammary infection (IMI), two key factors for clinical veterinary medicine. Because of these beneficial properties together with moderate costs and a high sample throughput the goal of this publication is to give a detailed, step-by-step protocol for easily establishing and running RS-PCR for genotyping S. aureus in other laboratories.

Définition d&#39;un génotype et ses variants Un profil électrophorétique différent dans plus d&#39;une bande de tous les génotypes identifiés est considéré comme un nouveau génotype. Les nouveaux génotypes sont nommés et étendus selon Fournier et al. 5 conduisant à des génotypes de la RGT à la GTZ, suivis par les génotypes GTAA à GTAZ et GTBA à GTBZ et GTCA à GTCC à l&#39; heure actuelle. Variation en un groupe est considéré comme une variante génotypique. Il est indiqué en chiffres romains en exposant après le nom du génotype (par exemple, GTRI, GTRII). Au total, il existe actuellement 141 génotypes et variantes dans la base de données de référence. Dans les conditions décrites ci - dessus, RS-PCR par Fournier et al. 5 est hautement reproductible au génotype des souches de S. aureus. L&#39;identification définitive d&#39;ungénotype ou variante connue est toujours possible si les problèmes techniques peuvent être exclus. Un résultat typique est présenté à la figure 1 montrant l&#39;électrophorèse sur 12 produits RS-PCR et présenté dans le mode de gel de pseudo par le logiciel de bioanalyser. Chaque voie est caractérisée par un motif de deux ou plusieurs bandes de PCR et d&#39;une bande de marquage en avant et une bande de marqueur à la fin. Un double-clic dans une ruelle ouvre le profil électrophorétique correspondant, effectivement mesuré dans une fenêtre séparée. Le logiciel Bioanalyseur permet, entre autres possibilités, les pics observés en cours de lecture que la taille en unités fluorescentes FU (Figure 2) ou en pb (figure 3) dans lequel un pic correspond exactement à une bande dans le mode pseudo-gel. Lecture Peak FU est nécessaire pour évaluer les pics pertinents d&#39;un profil dans le logiciel Mahal (figure 4), la lecture en pb pour inférer le génotype. pics Irrelevant sont définis dans le logiciel Mahal comme petit poisks dont la fluorescence observée FU est inférieure à 40% de la moyenne géométrique des 4 (3) avec des pics de fluorescence la plus élevée. Ils sont normalement observés lorsqu&#39;il y a un excès d&#39;ADN RS-PCR (&gt; 30 ng de l&#39; ADN pur / dosage) 2. A titre d&#39;exemple, le génotype de l&#39; échantillon 211 présente sur la figure 1 est déduite. L&#39; analyse visuelle du profil électrophorétique sur la figure 2 (logiciel bioanalyser) et l&#39; analyse avec le logiciel Mahal utilisant l&#39;outil pour tester les pics pertinents ont révélé 6 pics pertinents ayant des dimensions maximales de 395 pb, 432 pb, 453 pb, 505 pb, 567 pb, et 622 pb (figure 3). Ces valeurs sont remplis et séparés par des virgules dans le champ &quot;Peaks d&#39;entrée (pb)&quot; du logiciel Mahal (Figure 4). Pour corriger les écarts spécifiques à exécution, la valeur 415 a été inséré dans la zone de texte &quot;Observé Peak (pb)&quot; (Figure 4). Après avoir appuyé sur le &quot;Cbouton alculez &quot;, une liste est présentée ordonnée par le génotype avec le Mahalanobis D2M de distance au carré entre le profil génotypique demandées et indiquées. Faites défiler la liste à la recherche de D2M minimal. Dans le cas présent, D2M minimale est égale à 4.499 (Figure 4) une valeur de P ≥0.05, ce qui signifie que le profil demandées ne diffère pas sensiblement de celle du GTB. Des variantes de génotypes sont indiqués comme _I à _XV dans le logiciel Mahal. Dans le cas du génotype B, il existe trois variantes GBT I, GBT II et III GBT indiqué comme b_i, B_II et B_III dans le logiciel (Figure 4). Une puce de la trousse MED permet aux produits d&#39;analyse de 12 RS-PCR à la fois. Si moins de produits sont disponibles, les puits restants doivent être chargés avec de l&#39;eau déminéralisée. Les résultats peuvent être interprétés si les contrôles iNCLUS RS-PCR sont appropriés. <img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/54623/54623fig1.jpg" /> Figure 1. Pseudo-gel représentant 12 produits RS-PCR et leurs génotypes inférées. Douze souches différentes de S. aureus ont été analysés par RS-PCR en utilisant le kit MED conjointement avec un Bioanalyseur et le logiciel inclus. La voie sur le côté gauche montre le marqueur ou «échelle» pour la taille étalonnage du système en pb. Sur le haut des graphiques, les noms des échantillons et les génotypes correspondants sont inculpés qui ont été obtenus par le logiciel Mahal. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54623/54623fig1large.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> <img alt="Figure 2" src="/files/ftp_upload/54623/54623fig2.jpg" /> Figure 2. profil électrophorétique de sample 161 présente sur la figure 1. En plus des pics de la fluorescence mesurée est indiquée dans le FU. Pics visuellement distinguables qui ne sont pas détectés par la nécessité d&#39; un logiciel de Bioanalyseur à estimer en les lisant à partir de l&#39;intrigue comme effectué pour le pic avec une valeur de fluorescence estimée de 113 FU (en bleu). <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54623/54623fig2large.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> <img alt="Figure 3" src="/files/ftp_upload/54623/54623fig3.jpg" /> Figure 3. Le profil électrophorétique de l&#39; échantillon 211 présente dans la figure 1. En plus des pics de leur taille est indiquée en pb. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54623/54623fig3large.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> <img alt="Figure 4" src = &quot;/ files / ftp_upload / 54623 / 54623fig4.jpg&quot; /&gt; Figure 4. Capture d&#39; écran du logiciel Mahal. Dans la zone de texte &quot;Peaks d&#39;entrée (pb)&quot; les tailles de pointe de l&#39; échantillon 211 de la figure 3 sont remplis. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54623/54623fig4large.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a>

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Genotyping of Staphylococcus aureus by Ribosomal Spacer PCR RS-PCR

Here, ribosomal spacer PCR (RS-PCR) is used together with a miniaturized electrophoresis system as a fast and high resolution method for genotyping S. aureus at moderate costs allowing a high throughput.

génotypage des<em&gt; Staphylococcus aureus</em&gt; par Ribosomal Spacer PCR (RS-PCR)

The ribosomal spacer PCR (RS-PCR) is a highly resolving and robust genotyping method for S. aureus that allows a high throughput at moderate costs and is, ...

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Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Genotyping of Staphylococcus aureus by Ribosomal Spacer PCR (RS-PCR)

9.5K vues.  Agroscope. Here, ribosomal spacer PCR (RS-PCR) is used together with a miniaturized electrophoresis system as a fast and high resolution method for genotyping S. aureus at moderate costs allowing a high throughput.

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The Use of Drip Flow and Rotating Disk Reactors for Staphylococcus aureus Biofilm Analysis

Most microbes in nature are thought to exist as surface-associated communities in biofilms.1 Bacterial biofilms are encased within a matrix and attached to a surface.2 Biofilm formation and development are commonly studied in the laboratory using batch systems such as microtiter plates or flow systems, such as flow-cells. These methodologies are useful for screening mutant and chemical libraries (microtiter plates)3 or growing biofilms for visualization (flow cells)4. Here we present detailed protocols for growing Staphylococcus aureus in two additional types of flow system biofilms: the drip flow biofilm reactor and the rotating disk biofilm reactor.
Drip flow biofilm reactors are designed for the study of biofilms grown under low shear conditions.5 The drip flow reactor consists of four parallel test channels, each capable of holding one standard glass microscope slide sized coupon, or a length of catheter or stint. The drip flow reactor is ideal for microsensor monitoring, general biofilm studies, biofilm cryosectioning samples, high biomass production, medical material evaluations, and indwelling medical device testing.6,7,8,9
The rotating disk reactor consists of a teflon disk containing recesses for removable coupons.10 The removable coupons can by made from any machinable material. The bottom of the rotating disk contains a bar magnet to allow disk rotation to create liquid surface shear across surface-flush coupons. The entire disk containing 18 coupons is placed in a 1000 mL glass side-arm reactor vessel. A liquid growth media is circulated through the vessel while the disk is rotated by a magnetic stirrer. The coupons are removed from the reactor vessel and then scraped to collect the biofilm sample for further study or microscopy imaging. Rotating disc reactors are designed for laboratory evaluations of biocide efficacy, biofilm removal, and performance of anti-fouling materials.9,11,12,13

The Use of Drip Flow and Rotating Disk Reactors for Staphylococcus aureus Biofilm Analysis

Protocols for utilizing open system flow biofilms with drip flow reactors and rotating disk reactors are presented in detail.

L&#39;utilisation des flux de goutte et des réacteurs de disque rotatif pour Staphylococcus aureus Analyse du biofilm

Most microbes in nature are thought to exist as surface-associated communities in biofilms.1  Bacterial biofilms are encased within a matrix and attached ...

Recherche

Immunologie et infection

Subcutaneous Infection of Methicillin Resistant Staphylococcus Aureus (MRSA)

MRSA is a worldwide threat to public health, and MRSA skin and soft-tissue infections now account for more than half of all soft-tissue infections in the United States. Among soft-tissue infections, myositis, pyomyositis, and necrotizing fasciitis have been increasingly reported in association with MRSA arising from the community. To understand the interplay between MRSA and host immunity leading to more severe infection, the availability of animal models is critical, permitting the study of host and bacterial factors. Several infection models have been introduced to assess the pathogenesis of S. aureus during superficial skin infection. Here, we describe a subcutaneous infection model that examines the skin, subcutaneous, and muscle pathologies.

Subcutaneous Infection of Methicillin Resistant Staphylococcus Aureus MRSA

Murine skin and soft tissue infection model is utilized for assessing the virulence function of methicillin resistant Staphylococcus aureus (MRSA) and the host immunological responses. Here, we presented a subcutaneous infection model for skin and soft tissue infection.

Infection sous-cutanée du Staphylococcus aureus résistant à la méthicilline (SARM)

MRSA is a worldwide threat to public health, and MRSA skin and soft-tissue infections now account for more than half of all soft-tissue infections in the ...

Experimental Endocarditis Model of Methicillin Resistant Staphylococcus aureus (MRSA) in Rat

Endovascular infections, including endocarditis, are life-threatening infectious syndromes1-3. Staphylococcus aureus is the most common world-wide cause of such syndromes with unacceptably high morbidity and mortality even with appropriate antimicrobial agent treatments4-6. The increase in infections due to methicillin-resistant S. aureus (MRSA), the high rates of vancomycin clinical treatment failures and growing problems of linezolid and daptomycin resistance have all further complicated the management of patients with such infections, and led to high healthcare costs7, 8. In addition, it should be emphasized that most recent studies with antibiotic treatment outcomes have been based in clinical settings, and thus might well be influenced by host factors varying from patient-to-patient. Therefore, a relevant animal model of endovascular infection in which host factors are similar from animal-to-animal is more crucial to investigate microbial pathogenesis, as well as the efficacy of novel antimicrobial agents. Endocarditis in rat is a well-established experimental animal model that closely approximates human native valve endocarditis. This model has been used to examine the role of particular staphylococcal virulence factors and the efficacy of antibiotic treatment regimens for staphylococcal endocarditis. In this report, we describe the experimental endocarditis model due to MRSA that could be used to investigate bacterial pathogenesis and response to antibiotic treatment.

Experimental Endocarditis Model of Methicillin Resistant Staphylococcus aureus MRSA in Rat

Experimental rat endocarditis model due to methicillin-resistant S. aureus.

Modèle endocardite expérimentale de résistant à la méthicilline<em&gt; Staphylococcus aureus</em&gt; (SARM) chez le rat

Endovascular infections, including endocarditis, are life-threatening infectious syndromes1-3. Staphylococcus aureus is the most common world-wide cause ...

Staphylococcus aureus Growth using Human Hemoglobin as an Iron Source

S. aureus is a pathogenic bacterium that requires iron to carry out vital metabolic functions and cause disease. The most abundant reservoir of iron inside the human host is heme, which is the cofactor of hemoglobin. To acquire iron from hemoglobin, S. aureus utilizes an elaborate system known as the iron-regulated surface determinant (Isd) system1. Components of the Isd system first bind host hemoglobin, then extract and import heme, and finally liberate iron from heme in the bacterial cytoplasm2,3. This pathway has been dissected through numerous in vitro studies4-9. Further, the contribution of the Isd system to infection has been repeatedly demonstrated in mouse models8,10-14. Establishing the contribution of the Isd system to hemoglobin-derived iron acquisition and growth has proven to be more challenging. Growth assays using hemoglobin as a sole iron source are complicated by the instability of commercially available hemoglobin, contaminating free iron in the growth medium, and toxicity associated with iron chelators. Here we present a method that overcomes these limitations. High quality hemoglobin is prepared from fresh blood and is stored in liquid nitrogen. Purified hemoglobin is supplemented into iron-deplete medium mimicking the iron-poor environment encountered by pathogens inside the vertebrate host. By starving S. aureus of free iron and supplementing with a minimally manipulated form of hemoglobin we induce growth in a manner that is entirely dependent on the ability to bind hemoglobin, extract heme, pass heme through the bacterial cell envelope and degrade heme in the cytoplasm. This assay will be useful for researchers seeking to elucidate the mechanisms of hemoglobin-/heme-derived iron acquisition in S. aureus and possibly other bacterial pathogens.

Staphylococcus aureus Growth using Human Hemoglobin as an Iron Source

Here we describe a growth assay for Staphylococcus aureus using hemoglobin as the sole source of available nutrient iron. This assay establishes the role of bacterial factors involved in hemoglobin-derived iron acquisition.

Croissance Staphylococcus aureus en utilisant l&#39;hémoglobine humaine comme source de fer

S. aureus is a pathogenic bacterium that requires iron to  carry out vital metabolic functions and cause disease. The most abundant  reservoir of iron ...

Multiplex PCR Assay for Typing of Staphylococcal Cassette Chromosome Mec Types I to V in Methicillin-resistant Staphylococcus aureus

Staphylococcal Cassette Chromosome mec (SCCmec) typing is a very important molecular tool for understanding the epidemiology and clonal strain relatedness of methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA), particularly with the emerging outbreaks of community-associated MRSA (CA-MRSA) occurring on a worldwide basis. Traditional PCR typing schemes classify SCCmec by targeting and identifying the individual mec and ccr gene complex types, but require the use of many primer sets and multiple individual PCR experiments. We designed and published a simple multiplex PCR assay for quick-screening of major SCCmec types and subtypes I to V, and later updated it as new sequence information became available. This simple assay targets individual SCCmec types in a single reaction, is easy to interpret and has been extensively used worldwide. However, due to the sophisticated nature of the assay and the large number of primers present in the reaction, there is the potential for difficulties while adapting this assay to individual laboratories. To facilitate the process of establishing a MRSA SCCmec assay, here we demonstrate how to set up our multiplex PCR assay, and discuss some of the vital steps and procedural nuances that make it successful.

Multiplex PCR Assay for Typing of Staphylococcal Cassette Chromosome Mec Types I to V in Methicillin-resistant Staphylococcus aureus

We demonstrate a simple multiplex PCR assay for quick-screening and typing of Staphylococcal Cassette Chromosome mec (SCCmec) types I-V for methicillin-resistant Staphylococcus aureus, and provide some of the vital steps and procedural nuances that make it successful for adapting this assay to individual laboratories.

PCR multiplex pour le typage des staphylocoques Cassette Chromosome Mec types I 

Staphylococcal Cassette Chromosome mec (SCCmec) typing  is a very important molecular tool for understanding the epidemiology and  clonal strain ...

Studying Interactions of Staphylococcus aureus with Neutrophils by Flow Cytometry and Time Lapse Microscopy

We present methods to study the effect of phenol soluble modulins (PSMs) and other toxins produced and secreted by Staphylococcus aureus on neutrophils. To study the effects of the PSMs on neutrophils we isolate fresh neutrophils using density gradient centrifugation. These neutrophils are loaded with a dye that fluoresces upon calcium mobilization. The activation of neutrophils by PSMs initiates a rapid and transient increase in the free intracellular calcium concentration. In a flow cytometry experiment this rapid mobilization can be measured by monitoring the fluorescence of a pre-loaded dye that reacts to the increased concentration of free Ca2+. Using this method we can determine the PSM concentration necessary to activate the neutrophil, and measure the effects of specific and general inhibitors of the neutrophil activation.	
	To investigate the expression of the PSMs in the intracellular space, we have constructed reporter fusions of the promoter of the PSM&alpha; operon to GFP. When these reporter strains of S. aureus are phagocytosed by neutrophils, the induction of expression can be observed using fluorescence microscopy.

Studying Interactions of Staphylococcus aureus with Neutrophils by Flow Cytometry and Time Lapse Microscopy

We present methods to study the effect of PSMs and other toxins secreted by Staphylococcus aureus on neutrophils using flow cytometry and fluorescence microscopy.

L&#39;étude des interactions de<em&gt; Staphylococcus aureus</em&gt; Avec des neutrophiles par cytométrie en flux et microscopie Time Lapse

We present methods to study the effect of phenol soluble modulins (PSMs)  and other toxins produced and secreted by Staphylococcus  aureus on neutrophils. ...

Targeting Biofilm Associated Staphylococcus aureus Using Resazurin Based Drug-susceptibility Assay

Most pathogenic bacteria are able to form biofilms during infection, but due to the difficulty of manipulating and assessing biofilms, the vast majority of laboratory work is conducted with planktonic cells. Here, we describe a peg plate biofilm assay as performed with Staphylococcus aureus. Bacterial biofilms are grown on pegs attached to a 96-well microtiter plate lid, washed through gentle submersion in buffer, and placed in a drug challenge plate. After subsequent incubation they are again washed and moved to a final recovery plate, in which the fluorescent dye resazurin serves as a viability indicator. This assay offers greatly increased ease-of-use, reliability, and reproducibility, as well as a wealth of data when conducted as a kinetic read. Moreover, this assay can be adapted to a medium-throughput drug screening approach by which an endpoint fluorescent readout is taken instead, offering a path for drug discovery efforts.

Targeting Biofilm Associated Staphylococcus aureus Using Resazurin Based Drug-susceptibility Assay

Most bacterial infections produce a biofilm. By virtue of their environment, biofilm associated bacteria are often phenotypically drug resistant. Novel antibacterial molecules that kill bacteria in biofilms are thus a high priority. We establish an assay to quickly screen for antimicrobial compounds that are effective at eradicating biofilms.

Ciblage biofilm Associated<em&gt; Staphylococcus aureus</em&gt; Utilisation de résazurine Basé Essai de sensibilité aux médicaments

Most pathogenic bacteria are able to form biofilms during infection, but due to the difficulty of manipulating and assessing biofilms, the vast majority ...

High-throughput Detection of Respiratory Pathogens in Animal Specimens by Nanoscale PCR

Nanoliter scale real-time PCR uses spatial multiplexing to allow multiple assays to be run in parallel on a single plate without the typical drawbacks of combining reactions together. We designed and evaluated a panel based on this principle to rapidly identify the presence of common disease agents in dogs and horses with acute respiratory illness. This manuscript describes a nanoscale diagnostic PCR workflow for sample preparation, amplification, and analysis of target pathogen sequences, focusing on procedures that are different from microliter scale reactions. In the respiratory panel presented, 18 assays were each set up in triplicate, accommodating up to 48 samples per plate. A universal extraction and pre-amplification workflow was optimized for high-throughput sample preparation to accommodate multiple matrices and DNA and RNA based pathogens. Representative data are presented for one RNA target (influenza A matrix) and one DNA target (equine herpesvirus 1). The ability to quickly and accurately test for a comprehensive, syndrome-based group of pathogens is a valuable tool for improving efficiency and ergonomics of diagnostic testing and for acute respiratory disease diagnosis and management.

High-throughput testing of DNA and RNA based pathogens by nanoscale PCR is described using a syndromic canine and equine respiratory PCR panel.

À haut débit de détection de pathogènes dans respiratoires Spécimens animaux par Nanoscale PCR

Nanoliter scale real-time PCR uses spatial multiplexing to allow multiple assays to be run in parallel on a single plate without the typical drawbacks of ...

Methodology for the Study of Horizontal Gene Transfer in Staphylococcus aureus

One important feature of the major opportunistic human pathogen Staphylococcus aureus is its extraordinary ability to rapidly acquire resistance to antibiotics. Genomic studies reveal that S. aureus carries many virulence and resistance genes located in mobile genetic elements, suggesting that horizontal gene transfer (HGT) plays a critical role in S. aureus evolution. However, a full and detailed description of the methodology used to study HGT in S. aureus is still lacking, especially regarding natural transformation, which has been recently reported in this bacterium. This work describes three protocols that are useful for the in vitro investigation of HGT in S. aureus: conjugation, phage transduction, and natural transformation. To this aim, the cfr gene (chloramphenicol/florfenicol resistance), which confers the Phenicols, Lincosamides, Oxazolidinones, Pleuromutilins, and Streptogramin A (PhLOPSA)-resistance phenotype, was used. Understanding the mechanisms through which S. aureus transfers genetic materials to other strains is essential to comprehending the rapid acquisition of resistance and helps to clarify the modes of dissemination reported in surveillance programs or to further predict the spreading mode in the future.

Methodology for the Study of Horizontal Gene Transfer in Staphylococcus aureus

We describe here three different protocols for the in vitro investigation of conjugation, transduction, and natural transformation in Staphylococcus aureus.

Méthodologie de l&#39;étude du transfert horizontal de gènes dans<em&gt; Staphylococcus aureus</em

One important feature of the major opportunistic human pathogen Staphylococcus aureus is its extraordinary ability to rapidly acquire resistance to ...

A Mouse Model to Assess Innate Immune Response to Staphylococcus aureus Infection

Staphylococcus aureus (S. aureus)&#160;infections, including methicillin resistant stains, are an enormous burden on the healthcare system. With incidence rates of S. aureus infection climbing annually, there is a demand for additional research in its&#160;pathogenicity. Animal models of infectious disease advance our understanding of the host-pathogen response and lead to the development of effective therapeutics. Neutrophils play a primary role in the innate immune response that controls S. aureus infections by forming an abscess to wall off the infection and facilitate bacterial clearance; the number of neutrophils that infiltrate an S. aureus skin infection often correlates with disease outcome. LysM-EGFP mice, which possess the enhanced green fluorescent protein (EGFP) inserted in the Lysozyme M (LysM) promoter region (expressed primarily by neutrophils), when used in conjunction with in vivo whole animal fluorescence imaging (FLI) provide&#160;a means of quantifying neutrophil emigration noninvasively and longitudinally into wounded skin. When combined with a bioluminescent S. aureus strain and sequential in vivo whole animal bioluminescent imaging (BLI), it is possible to longitudinally monitor both the neutrophil recruitment dynamics and in vivo bacterial burden at the site of infection in anesthetized mice from onset of infection to resolution or death. Mice are more resistant to a number of virulence factors produced by S. aureus that facilitate effective colonization and infection in humans. Immunodeficient mice provide a more sensitive animal model to examine persistent S. aureus infections and the ability of therapeutics to boost innate immune responses. Herein, we characterize responses in LysM-EGFP mice that have been bred to MyD88-deficient mice (LysM-EGFP&#215;MyD88-/- mice) along with wild-type LysM-EGFP mice to investigate S. aureus skin wound infection. Multispectral simultaneous detection enabled study of neutrophil recruitment dynamics by using in vivo FLI, bacterial burden by using in vivo BLI, and wound healing longitudinally and noninvasively over time.

A Mouse Model to Assess Innate Immune Response to Staphylococcus aureus Infection

An approach is described for real-time detection of the innate immune response to cutaneous wounding and Staphylococcus aureus infection of mice. By comparing LysM-EGFP mice (which possess fluorescent neutrophils) with a LysM-EGFP crossbred immunodeficient mouse strain, we advance our understanding of infection and the development of approaches to combat infection.

Un modèle de souris pour évaluer réponse immunitaire innée à l’infection par Staphylococcus aureus

Staphylococcus aureus (S. aureus)&#160;infections, including methicillin resistant stains, are an enormous burden on the healthcare system. With incidence ...