Test de mort cellulaire : libération du chromium pour mesurer la cytotoxicité

Source : Frances V. Sjaastad^1,2, Whitney Swanson^2,3, et Thomas S. Griffith^1,2,3,4
1 Microbiologie, immunologie et programme d'études supérieures en biologie du cancer, Université du Minnesota, Minneapolis, MN 55455
² Center for Immunology, Université du Minnesota, Minneapolis, MN 55455
³ Département d'urologie, Université du Minnesota, Minneapolis, MN 55455
⁴ Centre du cancer maçonnique, Université du Minnesota, Minneapolis, MN 55455

Une des principales fonctions des cellules du système immunitaire est d'enlever les cellules cibles qui ont été infectées par des virus ou ont subi une transformation en une cellule tumorale. Les tests in vitro pour mesurer la capacité cytotoxique des cellules immunitaires sont un aliment de base dans les laboratoires depuis de nombreuses années. Ces essais ont été utilisés pour déterminer la capacité des lymphocytes T, des cellules NK, ou de toute autre cellule immunitaire à tuer les cellules cibles d'une manière spécifique à l'antigène ou non spécifique. Les ligands de la mort (p. ex. Fas ligand ou TRAIL), les cytokines (p. ex. IFNg ou TNF) ou les granules cytotoxiques (p. ex., perforine/granzyme B) exprimés par les cellules effectrices sont quelques façons d'intenter l'induit de la mort cellulaire cible. Avec l'explosion de la recherche d'immunothérapie de tumeur ces dernières années, il y a l'intérêt croissant dans trouver des agents pour augmenter l'activité cytotoxique des cellules immunitaires pour améliorer des résultats patients. Inversement, certaines maladies sont marquées par l'activité surexubérante de l'activité cytotoxique des cellules immunitaires, ce qui entraîne des efforts pour identifier les agents pour tempérer ces réponses. Ainsi, avoir un test dans lequel l'utilisateur peut facilement intégrer un certain nombre de cellules effectrices différentes, cellules cibles, et / ou modificateurs de réponse dans la conception expérimentale peut servir de moyen précieux d'évaluer rapidement la capacité cytotoxique des cellules effectrices et / ou la réactivité de la cellule cible.

Ces essais in vitro impliquent le mélange de différentes populations cellulaires, ainsi que l'utilisation d'un nombre relativement faible de cellules effectrices et cibles. Ainsi, l'une des nécessités de l'analyse est d'étiqueter les cellules cibles d'une manière qui peut facilement être détectée et quantit, permettant à l'utilisateur de déterminer ensuite la « lyse spécifique pour cent » médiée par les cellules effectrices. La radioactivité - en particulier, le chrome 51 (⁵¹Cr) sous la forme de Na₂⁵¹CrO₄- est un moyen peu coûteux d'étiqueter rapidement et non spécifiquement les protéines cellulaires dans les cellules cibles (1). L'étiquetage court et les temps d'assiduité total réduisent le risque de changements significatifs dans le nombre et/ou le phénotype des cellules cibles, ce qui pourrait influencer le résultat de l'effort. Lors de la perte de l'intégrité de la membrane des cellules cibles en raison de l'activité cytotoxique des cellules effectrices, les ⁵¹protéines cellulaires étiquetées Cr dans les cellules cibles sont libérées dans le supernatant de culture, devenant disponibles pour Quantification. Comme avec tout analyse examinant la fonction des cellules immunitaires in vitro,il ya un certain nombre de considérations importantes à envisager d'améliorer la performance de l'expérience. Une des caractéristiques les plus critiques est d'utiliser l'effecteur sain (pour l'activité cytotoxique maximale) et la cible (pour la réactivité maximale et la mort spontanée minimale /⁵¹Cr libération) cellules. Le contact entre l'effet et les cellules cibles est nécessaire (ce qui conduit à l'utilisation courante de plaques rondes de 96 puits pour encourager le contact cellule-cellule) (2). Enfin, l'analyse des données dépend de l'inclusion de populations de cellules cibles de contrôle positives et négatives.

Le protocole suivant exposera les étapes pour effectuer un jeu standard de libération ^{de 51}Cr pour mesurer la capacité cytotoxique d'une population de cellules effectrices, bien qu'une version non radioactive utilisant europium ait été récemment développée. ^{51 Annonces} Cr est un puissant émetteur de rayonnement. Par conséquent, l'utilisation de cet analyse nécessite une formation appropriée en matière de sécurité des rayonnements, un espace de laboratoire dédié, un compteur gamma et l'élimination d'échantillons radioactifs.

La séquence générale des événements dans cet état d'œil est la suivante : 1) préparer ⁵¹cibles étiquetées Cr; 2) préparer les cellules effectrices et les ajouter à la plaque pendant que les cellules cibles sont étiquetées; 3) ajouter des cibles étiquetées à la plaque; 4) plaque incubée; 5) les supernatants de récolte ; et 6) analyser les données après l'exécution d'échantillons sur le comptoir. Les échantillons sont généralement préparés en triple, puis en moyenne pour tenir compte de toute différence subtile de pipetage.

Un EPI approprié est important pour cet avertissement. Plus précisément, l'utilisateur doit porter une blouse de laboratoire et des gants. Des lunettes de sécurité peuvent être requises en fonction du laboratoire ou de l'établissement. Il devrait y avoir un large blindage au plomb pour un stockage sûr et l'utilisation de la ⁵¹Cr pendant toutes les étapes. Enfin, il devrait y avoir un espace de laboratoire et de l'équipement dédiés réservés à l'utilisation de ⁵¹Cr, y compris toutes les signalisations appropriées pour indiquer où les échantillons avec ⁵¹Cr sont conservés et un compteur Geiger équipé d'une sonde gamma pour étudier l'espace pour possible contamination.

Dans cet exercice de laboratoire, nous déterminerons la capacité des cellules mononucléaires périphériques humaines de sang (PBMCs), (CpG stimulées contre non stimulées) pour tuer des cellules de mélanome, utilisant la ligne humaine de cellules de mélanome WM793 comme modèle et l'essai de libération de chrome.

Aperçu de la procédure

Le typique ⁵¹Cr-release pour mesurer la mort cellulaire implique les étapes suivantes:

1. Tout d'abord, les cellules cibles sont étiquetées avec Na₂[⁵¹Cr]O₄. Cela les distingue des cellules effectrices dans l'assay.
2. Pendant que les cellules cibles sont étiquetées, les cellules effectrices sont collectées et, en utilisant la technique de dilution en série, une titration décroissante des cellules effectrices est générée dans une plaque d'essais de 96 puits en bas rond.
3. À la fin de l'étiquetage des cellules cibles, les cellules sont d'abord lavées, puis un nombre fixe de cellules sont ajoutés à la plaque d'assay qui contient déjà une série de dilutions de cellules effectrices.
4. Ensuite, le mélange de cellules cibles-effecteurs est incubé pendant une période de temps définie afin de permettre une interaction cellulaire suffisante avec les cellules cibles, afin de médiatiser la lyse cellulaire.
5. Enfin, les supernatants de culture sont récoltés et récoltés dans des tubes. La quantité de ⁵¹Cr est quantitée à l'aide d'un compteur gamma.
6. À la fin, les données sont recueillies et utilisées pour calculer la « lyse cellulaire spécifique au pourcentage » des cellules cibles.

1. Étiquetage des cellules cibles avec ⁵¹Cr

1. Pour commencer, préparer les cellules cibles, (ici- ligne cellulaire du mélanome humain WM793), dans une suspension de cellule unique.
2. Pour ce faire, d'abord retirer les médias de la flacon de culture tissulaire.
3. Ensuite, lavez les cellules avec 5 ml de 1X PBS.
4. Trypsiniser les cellules en ajoutant 1 ml de trypsine à la plaque pendant 2 min.
5. Appuyez doucement sur le flacon pour desserrer les cellules de la surface du flacon.
6. Ajouter 5 ml de milieu RPMI au flacon et pipet le milieu de haut en bas pour détacher les cellules.
7. Recueillir la suspension cellulaire dans un tube conique de 15 ml et centrifuger la suspension cellulaire pendant 5 min à 1200 tr/min. Decant le supernatant.
8. Ajouter 10 ml de support à la pastille et légèrement pipet le média de haut en bas pour mettre les cellules en suspension.
9. Déterminer la concentration cellulaire à l'aide d'un hémocytomètre.
10. Transférer 1x10⁶ cellules dans un nouveau tube conique de 15 ml.
11. Centrifugelant la suspension cellulaire pendant 5 min à 1200 tr/min et décant le supernatant.
12. Vortex brièvement le tube pour resuspendre la pastille cellulaire dans le petit volume de milieu laissé derrière.
13. Ajouter 100 'Ci de ⁵¹Cr directement à la suspension de la cellule cible WM793.
    Note: Il devrait y avoir un espace de laboratoire dédié mis en place pour la radioactivité particulière. En outre, il devrait y avoir un large blindage au plomb pour un stockage et une utilisation sécuritaires du ⁵¹Cr pendant toutes les étapes ainsi qu'une signalisation appropriée pour indiquer où les échantillons avec ⁵¹Cr sont conservés. Un compteur Geiger équipé d'une sonde à crêpes est également nécessaire, pour l'arpentage de l'espace pour une contamination possible.
14. Ajouter un petit morceau de ruban radioactif au tube pour indiquer que le tube est maintenant radioactif.
15. Placez le tube dans un incubateur à 37 oC avec un bouclier de plomb et incubez pendant 1 h. Faites glisser le tube toutes les 15-20 minutes pour augmenter l'apport cellulaire cible du chrome.
16. Après la période d'incubation, laver les cellules cibles avec 5 ml de FBS pour enlever tout excès ^{de 51}Cr.
17. Centrifuger les cellules à 1200 tr/min pendant 5 min. Décant radioactif FBS laver dans un conteneur de déchets approprié.
18. Resuspendre la pastille et laver une deuxième fois avec FBS. Vérifiez la radioactivité incorporée à l'aide d'un compteur Geiger.
19. Resuspendre la pastille dans un milieu complet de 10 ml, ce qui lui a procuré une concentration cellulaire de 10⁵ cellules/ml.
    Note: L'étape de comptage cellulaire après l'étiquetage ⁵¹Cr est omise ici en grande partie pour des raisons de sécurité. On peut supposer que la concentration de cellules WM793 est la même qu'avant l'étiquetage ⁵¹Cr.

2. Préparation des cellules effectrices

1. Une variété de cellules effectrices peuvent être utilisées, telles que les lymphocytes T humains ou de souris et les cellules NK. Dans cet exemple, des PBMC, isolés du sang entier par centrifugation standard de gradient de densité (à une concentration de 5x10^6),ont été utilisés.
2. Pour commencer, ajoutez 100 l de milieu de culture tissulaire à chaque puits de l'une des rangées (ici rangée A, Voir tableau 1) d'une plaque à fond rond de 96 puits. Ici, aucune cellule effectrice n'est ajoutée, et elles serviront de « blanc » pour déterminer la « libération minimale/spontanée ^{de 51}Cr » des cellules cibles.

Tableau 1 : ⁵¹Cr release assay layout: Row A- Target cells (10⁴ cells/ 100 'L) incubated with media only (generates 'blank' for determining the "minimum/spontaneous ⁵¹Cr release"). Lignes B à C- puits contenant différents effecteurs : ratios de cellules cibles (E:T), allant de 50:1 à 1,5:1. Ligne H- cellules cibles (10⁴ cellules/100 l) incubées avec 1% NP-40 (NP-40 lyses les cellules cibles, générant "maximum ou total ⁵¹Cr libération"). Chaque rapport E:T est testé en triplicate pour chaque condition expérimentale. Colonne 1-3- PBMC non stimulés et colonne 4-6- CPG-stimulé PBMCs.

3. Ensuite, générer une dilution des cellules sérielles 2X des PBMC (en triple pour chaque condition expérimentale), pour obtenir une concentration de cellules effectrices allant de 5x10⁵ à 15 625 cellules/100 L de médias (ici les lignes B à G).
   Note: Dans cet exemple, l'effecteur de départ : le ratio de cellule cible (E : T) est de 50:1. Toutefois, ce ratio peut être ajusté en fonction des spécificités expérimentales.
4. Laissez la dernière rangée vide (ici la rangée H) en n'ajoutant aucune cellule effectrice à ces puits. (Cette ligne sera utilisée pour générer le « nombre total de comptes/min, ou (c. p. m) » ou le « communiqué maximum ⁵¹Cr »).
5. Placez la plaque dans un incubateur à 37 oC jusqu'à ce que les cellules cibles soient prêtes à être ajoutées.

3. Ajout de ⁵¹cellules cibles WM793 étiquetées Cr à l'Assay

1. Après la période d'incubation, retirer les cellules cibles de l'incubateur et laver avec 5 ml de FBS pour enlever tout excès ^{de 51}Cr.
2. Centrifuger les cellules à 1200 tr/min pendant 5 min, à l'aide d'une centrifugeuse désignée.
3. Retirez le lavage FBS (supernatant radioactif) dans un contenant de déchets approprié.
4. Répétez l'étape de lavage en rependant la pastille dans un frais de 5 ml de FBS.
5. Centrifuger les cellules à nouveau à 1200 tr/min pendant 5 min.
6. Enfin, resuspendre la pastille en 10 ml de milieu complet.
7. Verser la suspension cellulaire WM793 ⁵¹étiquetée Cr (10⁵ cellules/mL) dans un réservoir de réactif jetable.
8. Ensuite, ajoutez 100 L de ces cellules cibles étiquetées, à chaque puits de la plaque de cellules effectrice s'il y a 96 puits, à l'aide d'une pipette multicanal.
9. Ensuite, ajoutez 100 OL de 1 % De NP-40 (dans l'eau) à la rangée de puits dépourvus de toute cellule effectrice (ici rangée H). 1% NP-40 lysera les cellules cibles, et donc ces puits serviront de contrôles pour déterminer le "nombre total / min, ou (c. p. m)" ou le maximum ⁵¹Cr libération.
10. Fixez le couvercle à la plaque en ajoutant un petit morceau de ruban perméable au gaz de chaque côté de la plaque et placez un morceau de ruban radioactif sur le couvercle pour indiquer qu'il contient ⁵¹Cr.
11. En bref, centrifuger la plaque à 1200 tr/min. Si une seule plaque expérimentale est utilisée, ajouter une plaque d'équilibre à la centrifugeuse.
    Note: Il est important d'utiliser une centrifugeuse marquée pour manipuler des échantillons radioactifs.
12. Retirer la plaque de la centrifugeuse.
13. Placer la plaque dans un incubateur à 37 oC avec un petit morceau de plomb protégeant la plaque pour plus de sécurité. Incuber pendant 16 h pour permettre la lyse cellulaire cible.
    Note: La période d'incubation peut varier de 4 à 18 h selon les cellules effectrices utilisées et le mécanisme potentiel de mise à mort utilisé.

4. Récolte des Supernatants

1. À la fin de la période d'incubation, retirer soigneusement le ruban adhésif autour du bord de la plaque et retirer le couvercle.
2. Ensuite, placez le cadre de récolte sur la plaque, en veillant à confirmer que les petits disques de filtre sont en place pour chacun des bouchons de coton. Cela assurera la collecte d'un supernatant sans cellules.
3. Maintenant, appuyez lentement et doucement sur les bouchons de coton dans les puits.
4. Après environ 10 secondes, relâchez la pression sur les bouchons de coton, puis transférez les bouchons de coton sur des lanières de tube.
5. Placez chacun de ces tubes dans un tube FACS secondaire.
6. Enfin, chargez les tubes FACS sur le compteur gamma et exécutez les échantillons pour quantifier la quantité de ⁵¹Cr libérées dans chaque condition. Les échantillons sont généralement mesurés pendant 1 minute, ce qui permet une détermination facile des « comptes/minute ».
7. Enregistrez soigneusement l'ordre dans lequel les tubes ont été chargés dans le comptoir.

5. Analyse des données

1. Ici, des PBMC non stimulés ont été ajoutés aux trois premières colonnes, et des PBMC stimulés par le CpG (CpG ODN, (1 g/mL) pendant 24 h) ont été ajoutés aux colonnes 4-6. Voir tableau 2.

Tableau 2 : ⁵¹données d'analyse de sortie Cr : Valeurs de données 'comptes par minute' / 'c. p. m', valeurs moyennes c. p. m, et valeurs de lyse spécifiques pour cent calculées.

2. Les données recueillies (comptes par minute, c.-à-d. c.p.m) ont été saisies dans les cellules d'une feuille de calcul de la même manière que les échantillons ont été disposés dans la plaque d'origine.
3. Tout d'abord, les moyennes des tripliciats ont été calculées. Tableau 2 - cellules I3 à P3, pour les PBMC non stimulés et les cellules I6 à P6, pour les PBMC stimulés par le CpG.
4. Une fois les moyennes déterminées, le pourcentage de lyse spécifique pour chaque condition a été calculé à l'aide de la formule suivante-
   
   
5. Le pourcentage de lyse spécifique a été calculé pour chaque condition (tableau 2 - cellules J4 à O4, pour les PBMC non stimulés et J7 à O7, pour les PBMC non stimulés).

Dans cet exemple, les cellules effectrices stimulées par le CpG (figure 1, cercles noirs)ont tué les cellules cibles plus efficacement, à mesure que le rapport entre les cellules effectrices et les cellules cibles augmentait. Cette augmentation n'a pas été observée dans les PBMC non stimulés(cercles blancs),ce qui indique que la stimulation du CpG est nécessaire pour l'augmentation observée de la lyse cellulaire cible.

Figure 1: ⁵¹Cr essai scatter plot: Activité tumoricidale par les PBMCs humains, non stimulés (cercles blancs) et après stimulation avec CpG (cercles noirs), testé s'est effectué à l'effecteur différent: ratios de cellules cibles (E: T) ratios (allant de . 50:1 à 1.5:1).

Le spoque décrit ici a une flexibilité considérable, comme une variété de cellules effectrices et cibles peuvent être utilisés en fonction de la question posée. Par exemple, la spécificité des cellules effectrices peut être déterminée en utilisant différentes cellules cibles ou le mécanisme de l'abattage des cellules effectrices peut être déterminé en utilisant des cellules déficientes en protéines spécifiques ou en utilisant des inhibiteurs spécifiques des protéines. Un problème majeur avec l'assay de libération ^{de 51}Cr est le potentiel pour un taux de libération spontanée élevé par les cellules cibles. Lorsqu'il est cultivé seul (sans cellules effectrices), la libération spontanée de ⁵¹Cr par les cellules cibles ne devrait idéalement pas dépasser 30 % de la libération totale (« maximale ») par les cellules cibles immédiatement lyse. Des taux de libération spontanée plus élevés peuvent être dus à l'utilisation de cellules cibles malsaines, soit en raison d'une mauvaise santé (p. ex., culture prolongée d'une lignée cellulaire) ou d'une période d'étiquetage trop longue.