Method Article
En utilisant le polymère cationique à faible coût polyéthylénimine (PEI), nous avons produit des particules lentivirales pour l’expression stable des shRNA dans les cellules souches embryonnaires humaines H9 (CSEh) et les cellules progénitrices neurales (NPC) dérivées de H9 transduites transitoirement à haute efficacité.
Le protocole actuel décrit l’utilisation de particules lentivirales pour l’administration d’ARN courts en épingle à cheveux (shRNA) à la fois aux cellules souches embryonnaires humaines (CSEh) ainsi qu’aux cellules progénitrices neurales (NPC) dérivées des CSEh à haute efficacité. Les particules lentivirales ont été générées en co-transfectant des cellules HEK293T à l’aide de vecteurs d’entrée (porteurs d’ARNh) ainsi que de plasmides d’emballage (pAX et pMD2.G) à l’aide du polymère cationique à faible coût polyéthylénimine (PEI). Les particules virales ont été concentrées par ultracentrifugation, ce qui a donné des titres moyens supérieurs à 5 x 107. Les CSEh et les CNP pourraient être infectés à des rendements élevés à l’aide de ces particules lentivirales, comme le montrent la sélection de la puromycine et l’expression stable dans les CSEh, ainsi que l’expression transitoire de GFP dans les CNP. De plus, l’analyse par transfert western a montré une réduction significative de l’expression des gènes ciblés par les shRNA. En outre, les cellules ont conservé leur pluripotence ainsi que leur potentiel de différenciation, comme en témoigne leur différenciation ultérieure en différentes lignées de SNC. Le protocole actuel traite de la livraison des shRNA; cependant, la même approche pourrait être utilisée pour l’expression ectopique des ADNc pour les études de surexpression.
Les cellules souches embryonnaires humaines (CSEh) dérivées de la masse cellulaire interne du blastocyste sont pluripotentes et peuvent être différenciées en différents types de cellules en fonction de facteurs externes dans des conditions in vitro 1,2. Afin d’exploiter pleinement le potentiel des CSEh, il est impératif de disposer de méthodes d’administration rapides et fiables des gènes pour ces cellules. Classiquement, les techniques utilisées peuvent être classées en deux types : les systèmes d’administration de gènes non viraux et viraux 3,4. Les systèmes d’administration de gènes non viraux les plus fréquemment utilisés sont la lipofection, l’électroporation et la nucléofection. Les systèmes d’administration non virale sont avantageux en raison de moins de mutations d’insertion et d’une diminution globale de l’immunogénicité 5,6. Cependant, ces méthodes entraînent une faible efficacité de transfection et une courte durée d’expression génique transitoire, ce qui est une limitation majeure pour les études de différenciation à long terme7. L’électroporation se traduit par une meilleure efficacité de transfection par rapport à la lipofection; cependant, il en résulte plus de 50% de mort cellulaire 8,9,10. En utilisant la nucléofection, la survie cellulaire et l’efficacité de la transfection peuvent être améliorées en combinant la lipofection et l’électroporation, mais l’approche nécessite des tampons spécifiques aux cellules et un équipement spécialisé et, par conséquent, devient assez coûteuse pour les applications à grande échelle11,12.
En revanche, les vecteurs viraux ont montré une amélioration de l’efficacité de la transfection, ainsi qu’une faible cytotoxicité globale, après la transduction. De plus, les gènes délivrés sont exprimés de manière stable et, par conséquent, rendent cette méthode idéale pour les études à long terme13. Parmi les vecteurs viraux les plus couramment utilisés pour l’administration de gènes dans les CSEh figurent les vecteurs lentiviraux (LVS), qui peuvent donner une efficacité de transduction de plus de 80% en utilisant des particules virales à titre élevé14,15. La lipofection et la précipitation de CaPO4 sont parmi les méthodes les plus couramment utilisées pour transfecter transitoirement les cellules HEK293T ou ses dérivés avec des vecteurs de transfert de gènes ainsi que des plasmides d’emballage pour produire des particules lentivirales16. Bien que la lipofection entraîne une bonne efficacité de transfection et une faible cytotoxicité, la technique est entravée par son coût, et la mise à l’échelle pour obtenir des particules lentivirales à titre élevé serait très coûteuse. La précipitation de CaPO4 entraîne des rendements de transfection relativement similaires à ceux obtenus à l’aide de la lipofection. Bien que rentables, les précipitations de CaPO4 entraînent une mort cellulaire importante après les transfections, ce qui rend difficile la normalisation et évite les variations d’un lot àl’autre 17. Dans ce scénario, le développement d’une méthode qui donne une efficacité de transfection élevée, une faible cytotoxicité et un rapport coût-efficacité est crucial pour la production de particules lentivirales à titre élevé à utiliser dans les CSEh.
La polyéthylèneénamine (PEI) est un polymère cationique qui peut transfecter les cellules HEK293T à haute efficacité sans trop de cytotoxicité et a un coût négligeable par rapport aux méthodes basées sur la lipofection18. Dans cette situation, PEI peut être utilisé pour des applications à grande échelle de la production de LVS à titre élevé grâce à la concentration de particules lentivirales provenant de surnageants de culture à l’aide de diverses techniques. L’article présenté décrit l’utilisation de l’Î.-P.-É. pour transfecter les cellules HEK293T et la concentration de vecteurs lentiviraux à l’aide de l’ultracentrifugation à travers un coussin de saccharose. En utilisant cette méthode, nous obtenons régulièrement des titres bien au-dessus de 5 x 107 UI / mL avec de faibles variations de lot à lot. La méthode est simple, simple et rentable pour les applications à grande échelle pour l’administration de gènes aux CSEh et aux cellules dérivées des CSEh.
1. Transfection de cellules HEK293T à l’aide d’un réactif PEI ou Lipofectamine 3000
2. Collecte LVS et ultracentrifugation
3. Mesure de titre LVS pour vecteurs basés sur pLKO.1
4. Mesure du titre LVS pour les vecteurs pll3.7
5. Infection des CSEh et sélection stable
6. Transduction des cellules progénitrices neurales (PNJ) dérivées de H9
REMARQUE: Les NPC ont été dérivés de cellules H9 à l’aide d’un protocole d’inhibition à double Smad, comme décrit précédemment19.
Après le transfert de gènes, une viabilité élevée des CSEh est inévitablement requise. Malgré les efforts et l’optimisation des protocoles pour réduire la mort cellulaire après l’électroporation des CSEh, plus de 50% de la mort cellulaire est encore observée après l’électroporation de ces cellules, ainsi qu’une faible efficacité de transfection20. Le transfert de gènes à médiation lentivirale entraîne non seulement une grande efficacité du transfert de gènes, mais démontre également des niveaux élevés de viabilité cellulaire après la transduction. Les résultats ci-dessous présentent deux approches : l’une utilisant la GFP comme rapporteur et l’expression transitoire dans les NPC dérivés des CSEh et l’autre utilisant la puromycine pour la sélection stable des CSEh pour les expériences de différenciation à long terme.
Dans la première série d’expériences, des particules lentivirales ont été produites en co-transfectant des shRNA portant le vecteur pll3.7 avec GFP comme rapporteur avec des plasmides d’emballage lentiviraux de deuxième génération psPAX2.0 et pMD2.G. Les particules lentivirales ont été collectées après 48 h et 72 h après la transfection et concentrées par ultracentrifugation. La figure 1A montre l’expression abondante de GFP dans les cellules HEK293T après 72 h de transfection. L’expression de protéines virales a également entraîné la formation de syncytie de cellules HEK293T où des cellules individuelles sont fusionnées, comme le montrent les flèches de la figure 1A. Les titres ont été déterminés à l’aide de l’analyse FACS. Nous avons également comparé les titres lentiviraux à l’aide du réactif PEI et Lipofectamine 3000 à faible coût et n’avons trouvé aucune différence significative entre les deux en termes de titres viraux (Figure 2A). Ensuite, les PNJ dérivés des H9 HESC ont été infectés deux fois avec ces particules lentivirales contenant du GFP à un MOI de 6 et récoltés pour analyse après 72 h. La figure 1B montre l’expression marquée de GFP dans les PNJ après l’infection. Comme indiqué ci-dessus, pour les expériences de différenciation à long terme, il est impératif d’avoir des CSEh qui expriment de manière stable les shRNA. Dans une tentative de créer des lignées cellulaires stables exprimant l’ARNh pour divers gènes, nous avons utilisé des vecteurs à base de plKO.1 et des shRNA clonés conformément aux recommandations du fabricant. Ensuite, des particules lentivirales ont été produites comme décrit ci-dessus, et les titres ont été déterminés à l’aide d’un kit commercial de mesure de titre lentiviral à l’aide de méthodes basées sur la qPCR (Figure 2B). Les CSEh ont été infectés par des particules lentivirales à un MOI de 10 et sélectionnés à l’aide de la sélection de puromycine. La figure 3 montre les résultats d’une sélection stable des CSEh après transduction. Après 5 jours de sélection avec 0,8 μg/mL de puromycine, les cellules transfectées lentivirales ont montré une viabilité cellulaire de plus de 80% par rapport aux cellules non transduites, où aucune cellule n’a survécu au traitement. Après la sélection, les cellules H9 transduites de manière stable ont été élargies, cryoconservées et analysées à l’aide du transfert Western pour tester l’efficacité de l’élimination des gènes.
Dans notre laboratoire, nous avons créé plusieurs lignées cellulaires stables de CSEh H9 exprimant des shRNA pour différents gènes en utilisant l’approche ci-dessus. Ici, nous avons présenté les résultats de l’un d’entre eux, qui est le gène L-2-hydroxyglutarate déshydrogénase (L2HGDH) en utilisant l’analyse par transfert western. Une expression abondante de L2HGDH est observée dans les cellules transduites avec une colonne vertébrale vectorielle vide. Cependant, aucune expression de L2HGDH n’est observée dans les cellules transduites avec un vecteur porteur de shRNA pour L2HGDH, ce qui montre l’efficacité de la génération stable d’une lignée cellulaire H9 hESCs avec une expression réduite de L2HGDH, qui peut être utilisée pour d’autres études de différenciation (Figure 4).
Figure 1 : Expression de la GFP dans les cellules HEK293T et les PNJ infectés par le virus. (A) Les shRNA ont été clonés dans un vecteur pll3.7 porteur de GFP comme rapporteur et co-transfectés avec des plasmides d’emballage dans des cellules HEK293T à l’aide de PEI. L’expression GFP élevée montre une efficacité de transfection efficace après 72 h de transfection. Les flèches indiquent la formation de syncytie dans les cellules HEK293T, où des groupes de cellules HEK293T individuelles ont fusionné en raison de l’expression de protéines virales. (B) Les PNJ dérivés de H9 ont été infectés deux fois à un MOI de 6 avec des particules lentivirales contenant du GFP comme rapporteur, et l’expression du GFP a été observée à 72 h après l’infection. Barre d’échelle = 50 μm. Veuillez cliquer ici pour afficher une version agrandie de cette figure.
Figure 2: Mesures du titre LVS. (A) Les titres viraux pour les vecteurs à base de pll3,7 ont été mesurés à l’aide de l’analyse FACS en quantifiant les cellules positives %GFP pour les dilutions virales qui ont donné 2% à 20% de cellules GFP positives. (B) Les titres viraux des vecteurs à base de pLKO.1 ont été déterminés à l’aide d’un kit de titre de lentivirus qPCR commercial, conformément aux recommandations du fabricant. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : Établissement de lignées hESC H9 exprimant des shRNA stables. Les shRNA ont été clonés en vecteurs lentiviraux à base de pLKO.1 porteurs du gène de sélection de la puromycine. Les CSEh H9 ont été infectés par des particules lentivirales à un MOI de 10 et sélectionnés à l’aide de puromycine. En utilisant 0,8 μg/mL de puromycine pendant 5 jours, 100% des cellules non infectées ont été tuées, tandis que la plupart des cellules ont survécu au traitement dans le groupe infecté par le virus. Ces cellules ont été agrandies sans sélection clonale pour la cryoconservation et une analyse plus approfondie. Barre d’échelle = 50 μm. Veuillez cliquer ici pour afficher une version agrandie de cette figure.
Figure 4 : Une analyse représentative par transfert de Western pour l’élimination stable du gène L2HGDH dans les CSEh H9. Les lysats cellulaires totaux provenant de cellules témoins négatives (H9, puro non coupées), ainsi que de cellules exprimant de manière stable des shRNA contre L2HGDH (H9, sh-L2HGDH) ont été soumis à un transfert western à l’aide de l’anticorps anti-L2HGDH. Comme le montre la figure, aucune expression de L2HGDH n’a été observée dans les CSEh H9 exprimant de manière stable les shRNA pour L2HGDH. Une bande non spécifique a été observée juste au-dessus de la bande spécifique correspondant au poids moléculaire correct de 46-48 kDa (indiqué par un triangle) pour l’anticorps L2HGDH. Anti-GAPDH a été utilisé comme contrôle de chargement. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
La capacité de modifier génétiquement les cellules souches à des fins d’étude ou cliniques est limitée à la fois par la technologie et la compréhension de base de la biologie des CSEh. Les techniques qui ont montré un potentiel important dans les CSE de souris, comme la lipofection et l’électroporation, ne sont pas très efficaces pour les CSEh, qui sont notoirement difficiles pour l’administration de gènes par les méthodes conventionnelles20. Cette notion a conduit non seulement à l’optimisation des techniques existantes, mais aussi au développement de nouvelles méthodes pour augmenter l’efficacité de la transfection dans les CSEh. Ces nouveaux développements se sont concentrés sur l’administration efficace et stable de gènes aux CSEh tout en maintenant un effet minimal sur la croissance, la pluripotence et le potentiel de différenciation des CSEh sur des périodes prolongées. Parmi les différents nouveaux développements qui répondent à ces critères stricts figure le transfert de gènes à médiation lentivirale vers lesCSEh 21,22. Pour la production de particules lentivirales exprimant un certain gène, le gène souhaité est cloné dans l’un des vecteurs de transfert et est transfecté dans les cellules HEK293T avec des plasmides d’emballage pour récolter un surnageant de culture cellulaire contenant des particules lentivirales. Pour être utilisé dans les CSEh, il est essentiel de concentrer ces particules virales en utilisant diverses techniques pour produire des titres élevés de virus au moins dans la gamme de 1 x 107-1 x 108 UI / mL. En général, de grands volumes de LVS sont concentrés de 200x à 500x le volume d’origine pour obtenir ces titres. Cela signifie que l’utilisation d’une méthode très rentable sans compromettre l’efficacité de la transfection dans les cellules HEK293T est une condition préalable à l’utilisation systématique de ces méthodes en laboratoire. La présente méthode décrit l’utilisation du polymère cationique PEI comme méthode rentable pour produire de grands volumes de LVS avec une efficacité de transfection similaire aux méthodes basées sur la lipofection, qui sont considérées comme de référence. En utilisant la méthode présentée, nous pouvons obtenir des titres LVS moyens bien au-dessus de 5 x 107 UI / mL après un facteur de concentration de 200x le volume d’origine. En utilisant ces particules LVS, nous avons pu établir plusieurs lignées cellulaires stables de H9 hESC exprimant des shRNA pour plusieurs gènes en infectant les cellules à des MIO élevés. La méthode présentée ici contourne l’utilisation de méthodes fastidieuses et chronophages de sélection et d’expansion clonales tout en obtenant des rendements de knockdown proches de 100%, comme le montre l’un des résultats représentatifs du transfert western pour l’élimination du gène L2HGDH à la figure 4. Voici quelques-unes des recommandations pour une approche réussie.
L’utilisation d’un faible nombre de passage de cellules HEK293T est nécessaire (idéalement inférieur à 30) pour les titres viraux élevés. La confluence des cellules HEK293T est un autre facteur important à cet égard. Les cellules HEK293T doivent être confluentes à au moins 80 % avant la transfection, car le contact cellule-cellule réduit considérablement la cytotoxicité et améliore la production de virus. Les vecteurs utilisés doivent être préparés à l’aide de kits d’isolement de plasmides sans endotoxines suivis d’une précipitation d’éthanol et reconstitués à une concentration minimale de 1 mg/mL avant utilisation pour la transfection. Il pourrait y avoir des variations de lot à lot de solutions de l’Île-du-Prince-Édouard préparées à différentes dates. Pour cette raison, chaque lot de solution PEI doit d’abord être testé pour la performance en utilisant des vecteurs GFP, et la solution doit être stockée à −20 °C dans des aliquotes à usage unique pour éviter les cycles répétés de gel-dégel. Pour les titres élevés, la collecte du surnageant LVS après 72 h de transfection des cellules HEK293T n’est recommandée que si les cellules sont saines et attachées. La filtration du surnageant contenant du LVS augmente considérablement la solubilité du LVS après ultracentrifugation. Il n’est pas conseillé de conserver le surnageant LVS à 4 °C pendant plus de 5 jours, car cela entraînerait une réduction significative des titres de virus. Le gradient de saccharose pendant l’ultracentrifugation est nécessaire pour des titres optimaux. Les températures doivent être maintenues à près de 4 °C pendant toutes les étapes de l’ultracentrifugation. L’incubation pendant la nuit de particules de LVS concentrées dans le DPBS est nécessaire pour une remise en suspension complète. La centrifugation après la remise en suspension du LVS élimine les débris cellulaires (le cas échéant) car elle peut provoquer une cytotoxicité lorsqu’elle est utilisée sur des cellules cibles. Après l’infection des cellules H9, il est important de remplacer les milieux contenant le virus par des milieux de croissance frais après 8 h, car une incubation prolongée avec le virus entraînerait une mort cellulaire importante des CSEh H9. La sélection de la puromycine ne doit être commencée que lorsque la confluence est supérieure à 80%.
La méthode décrite ci-dessus a été adaptée à l’origine pour l’expression des shRNA. Une approche similaire pourrait être utilisée pour l’expression ectopique des ADNc à cloner en vecteurs d’expression. Cependant, une limitation majeure de l’administration de gènes à médiation lentivirale est la contrainte de taille. À mesure que la taille augmente, l’emballage des vecteurs lentiviraux n’est pas optimal, ce qui entraîne une réduction des titres viraux23. Les recherches futures devraient viser à optimiser le protocole pour surmonter ces contraintes.
Les auteurs déclarent qu’il n’y a pas de conflit d’intérêts.
Ce travail a été soutenu par des subventions de recherche de l’Université des Émirats arabes unis (UAEU), la subvention n ° 31R170 (Zayed Center for Health Sciences) et # 12R010 (subvention UAEU-AUA). Nous remercions le professeur Randall Morse (Wadsworth Center, Albany, NY) de nous avoir aidés à éditer le manuscrit pour le style et la grammaire.
Toutes les données sont disponibles sur demande.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
2-Mercaptoethanol | Invitrogen | 31350010 | |
38.5 mL, Sterile + Certified Free Open-Top Thinwall Ultra-Clear Tubes | Beckman Coulter | C14292 | |
Accutase | Stem Cell Technologies | 7920 | |
bFGF Recombinant human | Invitrogen | PHG0261 | |
Bovine serum albumin FRAC V | Invitrogen | 15260037 | |
Corning Matrigel Basement Membrane Matrix, LDEV-free | Corning | 354234 | |
Cyclopamine | Stem Cell Technologies | 72074 | |
DMEM media | Invitrogen | 11995073 | |
DMEM Nutrient mix F12 | Invitrogen | 11320033 | |
DPBS w/o: Ca and Mg | PAN Biotech | P04-36500 | |
Fetal bovie serum | Invitrogen | 10270106 | |
GAPDH (14C10) Rabbit mAb Antibody | CST | 2118S | |
Gentle Cell Dissociation Reagent | Stem Cell Technologies | 7174 | |
HyClone Non Essential Amino Acids (NEAA) 100X Solution | GE healthcare | SH30238.01 | |
L Glutamine, 100X | Invitrogen | 2924190090 | |
L2HGDH Polyclonal antibody | Proteintech | 15707-1-AP | |
L2HGDH shRNA | Macrogen | Seq: CGCATTCTTCATGTGAGAAAT | |
Lipofectamine 3000 kit | Thermo Fisher | L3000001 | |
mTesR1 complete media | Stem Cell Technologies | 85850 | |
Neurobasal medium 1X CTS | Invitrogen | A1371201 | |
Neuropan 2 Supplement 100x | PAN Biotech | P07-11050 | |
Neuropan 27 Supplement 50x | PAN Biotech | P07-07200 | |
Penicillin streptomycin SOL | Invitrogen | 15140122 | |
pLKO.1 TRC vector | Addgene | 10878 | |
pLL3.7 vector | Addgene | 11795 | |
pMD2.G | Addgene | 12259 | |
Polybrene infection reagent | Sigma | TR1003- G | |
Polyethylenimine, branched | Sigma | 408727 | |
psPAX2.0 | Addgene | 12260 | |
Purmorphamine | Tocris | 4551/10 | |
Puromycin | Invitrogen | A1113802 | |
ROCK inhibitor Y-27632 dihydrochloride | Tocris | 1254 | |
SB 431542 | Tocris | 1614/10 | |
Trypsin .05% EDTA | Invitrogen | 25300062 | |
XAV 939 | Tocris | 3748/10 |
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