Method Article
باستخدام البوليمر الكاتيوني منخفض التكلفة بولي إيثيلينيمين (PEI) ، أنتجنا جزيئات فيروسية لينتيفيروسية للتعبير المستقر عن shRNAs في الخلايا الجذعية الجنينية البشرية H9 (hESCs) والخلايا السلفية العصبية المشتقة من H9 (NPCs) بكفاءة عالية.
يصف البروتوكول الحالي استخدام الجسيمات الفيروسية اللينتيفيروسية لتوصيل الحمض النووي الريبي قصير الدبوس الشعري (shRNAs) إلى كل من الخلايا الجذعية الجنينية البشرية (hESCs) وكذلك الخلايا السلفية العصبية (NPCs) المشتقة من hESCs بكفاءة عالية. تم توليد جزيئات الفيروس العاصف عن طريق النقل المشترك لخلايا HEK293T باستخدام ناقلات الدخول (التي تحمل shRNAs) جنبا إلى جنب مع بلازميدات التعبئة والتغليف (pAX و pMD2.G) باستخدام بوليمر البوليمر الكاتيوني منخفض التكلفة بولي إيثيلينيمين (PEI). وتركزت الجسيمات الفيروسية باستخدام الطرد المركزي الفائق، مما أدى إلى متوسط عيارات أعلى من 5 × 107. يمكن أن تصاب كل من hESCs و NPCs بكفاءة عالية باستخدام هذه الجسيمات الفيروسية ، كما هو موضح في اختيار puromycin والتعبير المستقر في hESCs ، وكذلك تعبير GFP العابر في NPCs. علاوة على ذلك ، أظهر تحليل اللطخة الغربية انخفاضا كبيرا في التعبير عن الجينات التي تستهدفها shRNAs. بالإضافة إلى ذلك ، احتفظت الخلايا بتعدد قدراتها وكذلك إمكانات التمايز ، كما يتضح من تمايزها اللاحق إلى سلالات مختلفة من الجهاز العصبي المركزي. ويتناول البروتوكول الحالي تسليم الحمض النووي الريبوزي المرسال؛ ومع ذلك ، يمكن استخدام نفس النهج للتعبير خارج الرحم عن cDNAs لدراسات التعبير المفرط.
الخلايا الجذعية الجنينية البشرية (hESCs) المشتقة من كتلة الخلايا الداخلية للكيسة الأريمية متعددة القدرات ويمكن تمييزها إلى أنواع مختلفة من الخلايا اعتمادا على العوامل الخارجية في ظل ظروف المختبر 1,2. من أجل تسخير إمكانات hESCs بشكل كامل ، من الضروري أن يكون لديك طرق سريعة وموثوقة لتوصيل الجينات لهذه الخلايا. تقليديا ، يمكن تصنيف التقنيات المستخدمة على نطاق واسع إلى نوعين: أنظمة توصيل الجينات غير الفيروسية والفيروسية 3,4. أنظمة توصيل الجينات غير الفيروسية الأكثر استخداما هي lipofection و electroporation و nucleofection. تعد أنظمة التوصيل غير الفيروسية مفيدة بسبب عدد أقل من طفرات الإدخال وانخفاض إجمالي في المناعة 5,6. ومع ذلك ، فإن هذه الطرق تؤدي إلى انخفاض كفاءة النقل ومدة قصيرة من التعبير الجيني العابر ، وهو قيد رئيسي لدراسات التمايز طويلة الأجل7. يؤدي النقل الكهربائي إلى تحسين كفاءة النقل مقارنة ب lipofection. ومع ذلك ، فإنه يؤدي إلى أكثر من 50 ٪ من موت الخلايا8،9،10. باستخدام nucleofection ، يمكن تحسين بقاء الخلية وكفاءة النقل من خلال الجمع بين lipofection و electroporation ، ولكن النهج يحتاج إلى مخازن مؤقتة خاصة بالخلايا ومعدات متخصصة ، وبالتالي ، يصبح مكلفا للغاية للتطبيقات الموسعة11,12.
وعلى النقيض من ذلك، أظهرت النواقل الفيروسية تحسنا في كفاءة نقل العدوى، فضلا عن انخفاض السمية الخلوية عموما، بعد النقل. بالإضافة إلى ذلك ، يتم التعبير عن الجينات التي يتم تسليمها بثبات ، وبالتالي ، تجعل هذه الطريقة مثالية للدراسات طويلة الأجل13. من بين النواقل الفيروسية الأكثر استخداما لتوصيل الجينات إلى hESCs هي ناقلات الفيروسات الليفية (LVS) ، والتي يمكن أن تعطي أكثر من 80٪ من كفاءة النقل باستخدام جزيئات فيروسية عالية العيار14,15. يعد Lipofection و CaPO4 هطول الأمطار من بين الطرق الأكثر استخداما لنقل خلايا HEK293T أو مشتقاتها بشكل عابر مع ناقلات نقل الجينات جنبا إلى جنب مع بلازميدات التعبئة والتغليف لإنتاج جزيئات فيروسية16. على الرغم من أن lipofection يؤدي إلى كفاءة نقل جيدة وسمية خلوية منخفضة ، إلا أن هذه التقنية تعوقها تكلفتها ، وسيكون التوسع للحصول على جزيئات عالية العيار lentiviral مكلفا للغاية. ينتج عن هطول الأمطار CaPO4 كفاءة نقل مماثلة نسبيا لتلك التي تم الحصول عليها باستخدام lipofection. على الرغم من فعالية التكلفة ، إلا أن هطول الأمطار CaPO4 يؤدي إلى موت كبير للخلايا بعد عمليات النقل ، مما يجعل من الصعب توحيد وتجنب الاختلافات من دفعة إلى دفعة17. في هذا السيناريو ، يعد تطوير طريقة تعطي كفاءة نقل عالية ، وسمية خلوية منخفضة ، وفعالية من حيث التكلفة أمرا بالغ الأهمية لإنتاج جزيئات عالية التيتر lentiviral لاستخدامها في hESCs.
البولي إيثيلينيمين (PEI) هو بوليمر كاتيوني يمكنه نقل خلايا HEK293T بكفاءة عالية دون الكثير من السمية الخلوية وله تكلفة ضئيلة مقارنة بالطرق القائمة على lipofection18. في هذه الحالة ، يمكن استخدام جزيرة برنس إدوارد للتطبيقات الموسعة لإنتاج LVS عالي العيار من خلال تركيز جزيئات lentiviral من supernatants المستنبتة باستخدام تقنيات مختلفة. تصف المقالة المقدمة استخدام جزيرة برنس إدوارد لنقل خلايا HEK293T وتركيز ناقلات الفيروسات الوعائية باستخدام الطرد المركزي الفائق من خلال وسادة السكروز. باستخدام هذه الطريقة ، نحصل بانتظام على عيارات أعلى بكثير من 5 × 107 وحدة دولية / مل مع اختلافات منخفضة من دفعة إلى دفعة. هذه الطريقة بسيطة ومباشرة وفعالة من حيث التكلفة للتطبيقات الموسعة لتوصيل الجينات إلى hESCs والخلايا المشتقة من hESCs.
1. نقل خلايا HEK293T باستخدام كاشف جزيرة الأمير إدوارد أو ليبوفيكتامين 3000
2. جمع LVS والطرد المركزي الفائق
3. قياس عيار LVS للمتجهات المستندة إلى pLKO.1
4. قياس عيار LVS للمتجهات المستندة إلى pll3.7
5. عدوى hESCs واختيار مستقر
6. نقل الخلايا السلفية العصبية المشتقة من H9 (NPCs)
ملاحظة: تم اشتقاق NPCs من خلايا H9 باستخدام بروتوكول تثبيط Smad مزدوج ، كما هو موضح سابقا19.
بعد نقل الجينات ، هناك حاجة حتمية إلى جدوى عالية من hESCs. على الرغم من الجهود المبذولة وتحسين البروتوكولات للحد من موت الخلايا بعد الكهربية من hESCs ، لا يزال أكثر من 50 ٪ من موت الخلايا يلاحظ بعد الكهربية لهذه الخلايا ، جنبا إلى جنب مع انخفاض كفاءة النقل20. لا يؤدي نقل الجينات بوساطة الفيروس العدسي إلى كفاءة عالية في نقل الجينات فحسب ، بل يوضح أيضا مستويات عالية من صلاحية الخلايا بعد النقل. تقدم النتائج أدناه نهجين: أحدهما يستخدم GFP كمراسل وتعبير عابر في NPCs المشتقة من hESCs والآخر يستخدم البيوروميسين للاختيار المستقر ل hESCs لتجارب التمايز طويلة الأجل.
في المجموعة الأولى من التجارب ، تم إنتاج جزيئات lentiviral عن طريق المشاركة في نقل shRNAs التي تحمل ناقل pll3.7 مع GFP كمراسل إلى جانب الجيل الثاني من بلازميدات التعبئة والتغليف lentiviral psPAX2.0 و pMD2.G. تم جمع جزيئات الفيروس العاصف بعد 48 ساعة و 72 ساعة بعد النقل وتركزت باستخدام الطرد المركزي الفائق. يوضح الشكل 1A تعبير GFP الوفير في خلايا HEK293T بعد 72 ساعة من النقل. أدى التعبير عن البروتينات الفيروسية أيضا إلى تكوين خلايا HEK293T حيث يتم دمج الخلايا المفردة معا ، كما هو موضح في الأسهم في الشكل 1A. تم تحديد العيار باستخدام تحليل FACS. كما قارنا عيارات الفيروسات اللينتيفرية باستخدام كاشف PEI منخفض التكلفة وكاشف Lipofectamine 3000 ولم نجد فرقا كبيرا بين الاثنين من حيث العيار الفيروسي (الشكل 2A). بعد ذلك ، أصيبت NPCs المشتقة من H9 hESCs مرتين بهذه الجسيمات الفيروسية اللينتيفيروسية المحتوية على GFP في MOI من 6 وتم حصادها للتحليل بعد 72 h. يوضح الشكل 1B تعبيرا ملحوظا عن GFP في NPCs بعد الإصابة. كما نوقش أعلاه ، بالنسبة لتجارب التمايز طويلة الأجل ، من الضروري أن يكون لديك hESCs التي تعبر بثبات عن shRNAs. في محاولة لإنشاء خطوط خلايا مستقرة تعبر عن shRNA لمختلف الجينات ، استخدمنا ناقلات قائمة على plKO.1 واستنساخ shRNAs وفقا لتوصيات الشركة المصنعة. بعد ذلك ، تم إنتاج جزيئات lentiviral كما هو موضح أعلاه ، وتم تحديد العيار باستخدام مجموعة قياس عيار lentiviral التجارية باستخدام الطرق القائمة على qPCR (الشكل 2B). أصيبت hESCs بجزيئات فيروسية lentivirus في MOI من 10 وتم اختيارها باستخدام اختيار puromycin. ويبين الشكل 3 نتائج الاختيار المستقر للمركبات الهيدروكلورية فلورية والأوعية الدموية بعد النقل. بعد 5 أيام من الاختيار مع 0.8 ميكروغرام / مل بوروميسين ، أظهرت الخلايا المنقولة الفيروسية أكثر من 80 ٪ من صلاحية الخلايا مقارنة بالخلايا غير المنقولة ، حيث لم تنجو أي خلايا من العلاج. بعد الاختيار ، تم توسيع خلايا H9 المحولة بثبات ، وحفظها بالتجميد ، وتحليلها باستخدام اللطخة الغربية لفحص الضربة القاضية الفعالة للجينات.
في مختبرنا ، أنشأنا خطوط خلايا مستقرة متعددة من H9 hESCs تعبر عن shRNAs لجينات مختلفة باستخدام النهج أعلاه. هنا ، قدمنا نتائج واحدة من تلك ، وهو جين نازعة هيدروجيناز L-2-hydroxyglutarate (L2HGDH) باستخدام تحليل اللطخة الغربية. لوحظ التعبير الوفير عن L2HGDH في الخلايا المحولة مع العمود الفقري المتجه الفارغ. ومع ذلك، لم يلاحظ أي تعبير عن L2HGDH في الخلايا المحولة مع ناقل يحمل shRNAs ل L2HGDH، مما يدل على فعالية الجيل المستقر لخط خلية H9 hESCs مع انخفاض التعبير عن L2HGDH، والتي يمكن استخدامها لمزيد من دراسات التمايز (الشكل 4).
الشكل 1: التعبير عن GFP في خلايا HEK293T و NPCs المصابة بالفيروسات. (A) تم استنساخ shRNAs في ناقل pll3.7 يحمل GFP كمراسل وشارك في نقله مع بلازميدات التعبئة والتغليف في خلايا HEK293T باستخدام جزيرة برنس إدوارد. يظهر تعبير GFP العالي كفاءة النقل بعد 72 ساعة من النقل. تشير الأسهم إلى تكوين syncytia في خلايا HEK293T ، حيث اندمجت مجموعات من خلايا HEK293T الفردية معا بسبب التعبير عن البروتينات الفيروسية. (ب) أصيبت ال NPCs المشتقة من H9 مرتين في وزارة الداخلية من 6 بجسيمات فيروسية عدسية تحتوي على GFP كمراسل ، ولوحظ تعبير GFP في الساعة 72 بعد الإصابة. شريط المقياس = 50 ميكرومتر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: قياسات عيار LVS. (أ) تم قياس العيار الفيروسي للناقلات القائمة على pll3.7 باستخدام تحليل FACS عن طريق تحديد كمية الخلايا الإيجابية GFP ٪ لتلك التخفيفات الفيروسية التي أعطت 2٪ -20٪ من الخلايا الإيجابية GFP. (ب) تم تحديد العيار الفيروسي للنواقل القائمة على pLKO.1 باستخدام مجموعة عيار فيروس qPCR lentivirus التجارية، وفقا لتوصيات الشركة المصنعة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: إنشاء خطوط H9 hESC مستقرة تعبر عن shRNA . تم استنساخ shRNAs إلى ناقلات فيروسية عدسية قائمة على pLKO.1 تحمل جين اختيار البيروميسين. وأصيبت H9 hESCs بجسيمات فيروسية عدية في 10 MOI وتم اختيارها باستخدام البيروميسين. باستخدام 0.8 ميكروغرام / مل بوروميسين لمدة 5 أيام ، تم قتل 100٪ من الخلايا غير المصابة ، في حين نجت معظم الخلايا من العلاج في المجموعة المصابة بالفيروس. تم توسيع هذه الخلايا دون اختيار نسيلي للحفظ بالتبريد والمزيد من التحليل. شريط المقياس = 50 ميكرومتر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: تحليل لطخة غربية تمثيلية للضربة القاضية المستقرة للجين L2HGDH في H9 hESCs. تم إخضاع إجمالي التحلل الخلوي من خلايا التحكم السلبي (H9 ، puro uncut) ، وكذلك الخلايا التي تعبر بثبات عن shRNAs ضد L2HGDH (H9 ، sh-L2HGDH) لطخة غربية باستخدام الجسم المضاد L2HGDH. وكما هو مبين في الشكل، لم يلاحظ أي تعبير عن L2HGDH في H9 hESCs يعبر بشكل ثابت عن shRNAs ل L2HGDH. وقد لوحظ وجود نطاق غير محدد فوق النطاق المحدد المقابل للوزن الجزيئي الصحيح البالغ 46-48 كيلو دالو (المشار إليه بمثلث) للجسم المضاد L2HGDH. تم استخدام Anti-GAPDH كعنصر تحكم في التحميل. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
القدرة على تعديل الخلايا الجذعية وراثيا لأغراض الدراسة أو السريرية محدودة من خلال التكنولوجيا والفهم الأساسي لبيولوجيا hESCs. التقنيات التي أظهرت إمكانات كبيرة في ESCs الفئران ، مثل lipofection و electroporation ، ليست فعالة للغاية بالنسبة ل hESCs ، والتي تشتهر بصعوبة توصيل الجينات بالطرق التقليدية20. وقد أدى هذا المفهوم ليس فقط إلى تحسين التقنيات القائمة ولكن أيضا إلى تطوير أساليب جديدة لزيادة كفاءة النقل في HESCs. كان تركيز هذه التطورات الجديدة على توصيل الجينات بكفاءة واستقرار إلى hESCs مع الحفاظ على الحد الأدنى من التأثير على نمو hESCs ، وتعدد القدرات ، وإمكانات التمايز على مدى فترات طويلة. من بين التطورات الجديدة المختلفة التي تلبي هذه المعايير الصارمة هو نقل الجينات بوساطة فيروسية إلى hESCs21,22. لإنتاج جزيئات lentiviral التي تعبر عن جين معين ، يتم استنساخ الجين المطلوب في أحد ناقلات النقل ويتم نقله في خلايا HEK293T جنبا إلى جنب مع بلازميدات التعبئة والتغليف لحصاد السوبرنات زراعة الخلايا التي تحتوي على جزيئات lentivirus. لاستخدامها في hESCs ، من الضروري تركيز هذه الجسيمات الفيروسية باستخدام تقنيات مختلفة لإنتاج عيارات عالية من الفيروسات على الأقل في نطاق 1 × 107-1 × 108 وحدة دولية / مل. بشكل عام ، تتركز كميات كبيرة من LVS من 200x-500x الحجم الأصلي لتحقيق هذه العيارات. وهذا يعني أن استخدام طريقة فعالة للغاية من حيث التكلفة دون المساس بكفاءة النقل في خلايا HEK293T هو شرط أساسي لاستخدام هذه الطرق بشكل روتيني في المختبر. تصف الطريقة الحالية استخدام البوليمر الكاتيوني PEI كطريقة فعالة من حيث التكلفة لإنتاج كميات كبيرة من LVS مع كفاءة نقل مماثلة للطرق القائمة على lipofection ، والتي تعتبر المعيار الذهبي. باستخدام الطريقة المقدمة ، يمكننا الحصول على متوسط عيارات LVS أعلى بكثير من 5 × 107 وحدة دولية / مل بعد عامل تركيز يبلغ 200 ضعف الحجم الأصلي. باستخدام جزيئات LVS هذه ، تمكنا من إنشاء العديد من خطوط الخلايا المستقرة من H9 hESCs التي تعبر عن shRNAs للعديد من الجينات عن طريق إصابة الخلايا في MOIs عالية. تتجاوز الطريقة المعروضة هنا استخدام الطرق المملة والمستهلكة للوقت للانتقاء والتوسع في النسيلة مع الاستمرار في الحصول على كفاءات ضربة قاضية قريبة من 100٪ ، كما هو موضح في إحدى نتائج اللطخة الغربية التمثيلية للضربة القاضية الجينية L2HGDH في الشكل 4. وفيما يلي بعض التوصيات المتعلقة باتباع نهج ناجح.
مطلوب استخدام عدد مرور منخفض من خلايا HEK293T (من الناحية المثالية أقل من 30) للعيارات الفيروسية العالية. يعد التقاء خلايا HEK293T عاملا مهما آخر في هذا الصدد. يجب أن تكون خلايا HEK293T ملتقية بنسبة 80٪ على الأقل قبل النقل لأن ملامسة الخلايا الخلوية تقلل بشكل كبير من السمية الخلوية وتحسن إنتاج الفيروس. ويجب تحضير النواقل المستخدمة باستخدام مجموعات عزل البلازميد الخالية من السموم الداخلية متبوعة بهطول الإيثانول وإعادة تشكيلها بتركيز لا يقل عن 1 ملغم/مل قبل استخدامها في النقل. يمكن أن تكون هناك اختلافات من دفعة إلى أخرى من حلول جزيرة الأمير إدوارد المعدة في تواريخ مختلفة. ولهذا السبب، يجب أولا اختبار كل دفعة من حلول جزيرة الأمير إدوارد للتأكد من أدائها باستخدام متجهات GFP، ويجب تخزين المحلول عند -20 درجة مئوية في أليكوتات تستخدم لمرة واحدة لتجنب دورات التجميد والذوبان المتكررة. بالنسبة للعيارات العالية ، يوصى فقط بجمع LVS supernatant بعد 72 ساعة من نقل خلايا HEK293T فقط بشرط أن تكون الخلايا صحية ومرفقة. إن ترشيح المادة الفائقة المحتوية على LVSتزيد بشكل كبير من قابلية ذوبان LVS بعد الطرد المركزي الفائق. لا ينصح بتخزين supernatant LVS عند 4 درجات مئوية لأكثر من 5 أيام لأنه سيؤدي إلى انخفاض كبير في عيارات الفيروس. مطلوب تدرج السكروز أثناء الطرد المركزي الفائق للحصول على عيارات مثالية. يجب الحفاظ على درجات الحرارة بالقرب من 4 درجات مئوية خلال جميع خطوات الطرد المركزي الفائق. مطلوب حضانة بين عشية وضحاها لجزيئات LVS المركزة في DPBS لإعادة التعليق الكامل. يزيل الطرد المركزي بعد إعادة تعليق LVS الحطام الخلوي (إن وجد) لأنه يمكن أن يسبب السمية الخلوية عند استخدامه على الخلايا المستهدفة. بعد إصابة خلايا H9 ، من المهم استبدال الوسائط المحتوية على الفيروس بوسائط نمو جديدة بعد 8 ساعات لأن الحضانة المطولة بالفيروس ستؤدي إلى موت خلوي كبير ل H9 hESCs. يجب أن يبدأ اختيار البيروميسين فقط عندما يكون الالتقاء أكثر من 80٪.
تم تكييف الطريقة الموضحة أعلاه في الأصل للتعبير عن shRNAs. ويمكن استخدام نهج مماثل للتعبير خارج الرحم عن الحمض النووي الريبوزي منقوص الأكسجين ليتم استنساخه إلى متجهات تعبير. ومع ذلك ، فإن أحد القيود الرئيسية على توصيل الجينات بوساطة الفيروس الوليد هو قيد الحجم. مع زيادة الحجم ، فإن تغليف ناقلات الفيروسات اللينتيفيروسية ليس هو الأمثل ، مما يؤدي إلى انخفاض العيار الفيروسي23. وينبغي توجيه البحوث المستقبلية لتحسين البروتوكول للتغلب على هذه القيود.
ويعلن صاحبا البلاغ أنه لا يوجد تضارب في المصالح.
تم دعم هذا العمل من خلال المنح البحثية من جامعة الإمارات العربية المتحدة (UAEU) ، والمنحة رقم 31R170 (مركز زايد للعلوم الصحية) و # 12R010 (منحة جامعة الإمارات العربية المتحدة). نشكر البروفيسور راندال مورس (مركز وادزورث، ألباني، نيويورك) على مساعدتنا في تحرير المخطوطة من حيث الأسلوب والقواعد.
جميع البيانات متاحة عند الطلب.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
2-Mercaptoethanol | Invitrogen | 31350010 | |
38.5 mL, Sterile + Certified Free Open-Top Thinwall Ultra-Clear Tubes | Beckman Coulter | C14292 | |
Accutase | Stem Cell Technologies | 7920 | |
bFGF Recombinant human | Invitrogen | PHG0261 | |
Bovine serum albumin FRAC V | Invitrogen | 15260037 | |
Corning Matrigel Basement Membrane Matrix, LDEV-free | Corning | 354234 | |
Cyclopamine | Stem Cell Technologies | 72074 | |
DMEM media | Invitrogen | 11995073 | |
DMEM Nutrient mix F12 | Invitrogen | 11320033 | |
DPBS w/o: Ca and Mg | PAN Biotech | P04-36500 | |
Fetal bovie serum | Invitrogen | 10270106 | |
GAPDH (14C10) Rabbit mAb Antibody | CST | 2118S | |
Gentle Cell Dissociation Reagent | Stem Cell Technologies | 7174 | |
HyClone Non Essential Amino Acids (NEAA) 100X Solution | GE healthcare | SH30238.01 | |
L Glutamine, 100X | Invitrogen | 2924190090 | |
L2HGDH Polyclonal antibody | Proteintech | 15707-1-AP | |
L2HGDH shRNA | Macrogen | Seq: CGCATTCTTCATGTGAGAAAT | |
Lipofectamine 3000 kit | Thermo Fisher | L3000001 | |
mTesR1 complete media | Stem Cell Technologies | 85850 | |
Neurobasal medium 1X CTS | Invitrogen | A1371201 | |
Neuropan 2 Supplement 100x | PAN Biotech | P07-11050 | |
Neuropan 27 Supplement 50x | PAN Biotech | P07-07200 | |
Penicillin streptomycin SOL | Invitrogen | 15140122 | |
pLKO.1 TRC vector | Addgene | 10878 | |
pLL3.7 vector | Addgene | 11795 | |
pMD2.G | Addgene | 12259 | |
Polybrene infection reagent | Sigma | TR1003- G | |
Polyethylenimine, branched | Sigma | 408727 | |
psPAX2.0 | Addgene | 12260 | |
Purmorphamine | Tocris | 4551/10 | |
Puromycin | Invitrogen | A1113802 | |
ROCK inhibitor Y-27632 dihydrochloride | Tocris | 1254 | |
SB 431542 | Tocris | 1614/10 | |
Trypsin .05% EDTA | Invitrogen | 25300062 | |
XAV 939 | Tocris | 3748/10 |
Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article
Request PermissionThis article has been published
Video Coming Soon
Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved