慢病毒介导的shRNA递送到hESC和NPC，使用低成本阳离子聚合物聚乙亚胺（PEI）

利用低成本的阳离子聚合物聚乙氨基亚胺（PEI），我们生产了慢病毒颗粒，用于H9人胚胎干细胞（hESCs）中shRNA的稳定表达，并高效瞬时转导H9衍生的神经祖细胞（NPC）。

目前的方案描述了使用慢病毒颗粒以高效率将短发夹RNA（shRNA）递送到人胚胎干细胞（hESCs）以及来自hESCs的神经祖细胞（NPC）。通过使用进入载体（携带shRNA）共转染HEK293T细胞以及使用低成本阳离子聚合物聚乙基亚胺（PEI）的包装质粒（pAX和pMD2.G）来生成慢病毒颗粒。使用超速离心浓缩病毒颗粒，这导致平均滴度高于5×10⁷。hESCs和NPC都可以使用这些慢病毒颗粒高效感染，如嘌呤霉素的选择和在hESCs中的稳定表达以及NPC中的瞬时GFP表达所示。此外，蛋白质印迹分析显示，shRNA靶向基因的表达显著降低。此外，这些细胞保留了它们的多能性和分化潜力，正如它们随后分化成不同的CNS谱系所证明的那样。目前的协议涉及shRNA的交付;然而，相同的方法可用于cDNA的异位表达以进行过表达研究。

来自囊胚内细胞团的人胚胎干细胞（hESCs）是多能的，可以根据 体外 条件下的外部因素分化成不同的细胞类型^1，2。为了充分利用hESC的潜力，必须为这些细胞提供快速可靠的基因递送方法。传统上，所使用的技术大致可分为两种类型:非病毒和病毒基因递送系统^3，4。更常用的非病毒基因递送系统是脂质感染、电穿孔和细胞核感染。非病毒递送系统是有利的，因为插入突变较少，免疫原性总体上降低^5，6。然而，这些方法导致转染效率低下和瞬时基因表达持续时间短，这是长期分化研究的主要限制⁷.与脂质感染相比，电穿孔可提高转染效率。然而，它导致超过50%的细胞死亡^8，9，10。使用细胞核感染，可以通过结合脂质感染和电穿孔来提高细胞存活率和转染效率，但该方法需要细胞特异性缓冲液和专用设备，因此，对于放大应用来说，成本相当高^11，12。

相比之下，病毒载体在转导后显示出更好的转染效率以及整体低细胞毒性。此外，递送的基因稳定表达，因此，这种方法非常适合长期研究¹³。将基因递送到hESC中最常用的病毒载体是慢病毒载体（LVS），使用高滴度病毒颗粒^14，15可以提供超过80%的转导效率。脂质法转染和CaPO₄ 沉淀是瞬时转染HEK293T细胞或其衍生物以及具有基因转移载体的包装质粒以产生慢病毒颗粒¹⁶的最常用方法之一。虽然脂肪法感染具有良好的转染效率和低细胞毒性，但该技术受到其成本的阻碍，并且扩大规模以获得高滴度的慢病毒颗粒将非常昂贵。CaPO₄ 沉淀的转染效率与使用脂质法的转染效率相对相似。尽管CaPO₄ 沉淀具有成本效益，但在转染后会导致明显的细胞死亡，这使得标准化和避免批次间差异变得困难¹⁷.在这种情况下，开发一种具有高转染效率，低细胞毒性和成本效益的方法对于生产用于hESC的高滴度慢病毒颗粒至关重要。

聚乙基亚胺（PEI）是一种阳离子聚合物，可以高效率转染HEK293T细胞而没有太大的细胞毒性，并且与基于脂质感染的方法相比，成本可以忽略不计¹⁸。在这种情况下，PEI可用于通过使用各种技术从培养上清液中浓缩慢病毒颗粒来生产高滴度LVS的放大应用。本文介绍了使用 PEI 转染 HEK293T 细胞，以及通过蔗糖缓冲液进行超速离心的慢病毒载体浓缩。使用这种方法，我们定期获得远高于5 x 10⁷ IU / mL的滴度，并且批次间差异很小。该方法简单，直接且具有成本效益，适用于将基因递送到hESC和hESCs衍生细胞的放大应用。

1. 使用 PEI 或脂质体酪胺 3000 试剂转染 HEK293T 细胞

1. 在DMEM + 10%FBS + 1x青霉素/链霉素中在37°C下在具有5%CO_2和21%O 2气氛的加湿培养箱中培养HEK293T细胞，直到它们在接种转染前90%汇合。使用相对较低的细胞传代数进行高滴度病毒生产（理想情况下小于P30）。
2. 在100mm组织培养板中的10mL完全生长培养基中接种4×10⁶ 个细胞，并在具有5%CO_2和21 %O 2气氛的加湿组织培养箱中生长过夜_。
3. 对于每次转染，使用以下入口和包装质粒的比例，在1.5 mL离心管中的1 mL无血清DMEM培养基中稀释质粒DNA（1 mg / mL储备品）:
   入口载体 = 10 μg
   PSPAX2.0 = 7.5 微克
   pMD2.G = 5 微克
4. 涡旋10秒，并在室温下以10，000×g旋转管30秒以收集。
5. 向管中加入70μL（1mg / mL储备溶液）PEI，并如上所述短暂涡旋和旋转以收集。使用的爱德华王子岛指数的体积基于总DNA（微克）:P EI（微克）的1:3比例。
6. 对于基于脂质菲沙明的转染，将上述载体稀释在试剂盒中提供的含有45μL试剂P的500μL无血清DMEM培养基中，并在室温下孵育5分钟。
7. 使用500μL无血清DMEM培养基稀释试剂盒中提供的70μL试剂L，并在室温下孵育5分钟。
8. 合并两个试管的内容物，并将试管在室温下孵育20分钟以允许复合物形成。
9. 将1 mL DNA / PEI或1mL DNA /脂质异构胺复合物滴加到含有细胞的板中，并在37°C的加湿培养箱中孵育6小时，气氛为5%CO₂ 和21%O_2。
10. 6小时后，换成新鲜完全生长培养基（10mL），并将细胞返回具有5%CO_2和21 %O 2气氛的加湿培养箱_中。

2. LVS采集和超速离心

1. 转染2天后，收集含病毒培养基，并用10mL新鲜完全生长培养基再次覆盖细胞。
2. 转染3天后，收集含病毒培养基，并将其与2天时间点收集的含病毒培养基相结合。
3. 在4°C下以2，000×g离心病毒上清液10分钟以沉淀细胞碎片。
4. 使用0.45μm孔径低蛋白结合过滤器（PES或SFCA）过滤上清液，并在4°C下储存，直到准备好进行超速离心。含有慢病毒颗粒的过滤上清液可以在4°C下储存5天，而不会显着损失病毒滴度。
5. 通过用70%乙醇洗涤10分钟，风干，关闭并保持在4°C，对超速离心管保持杯子进行灭菌。
6. 将36 mL含有慢病毒颗粒的过滤培养基加入无菌超速离心管中。
7. 用4 mL无菌20%蔗糖溶液（在PBS中制备）填充5 mL无菌条盒，并将其直接分配到含有LVS的超速离心管（UC）的底部。重要的是蔗糖溶液不与培养基混合，并在管的底部产生梯度。
8. 使用无血清DMEM培养基平衡所有超速离心管，放入装有杯子的冷超速离心管中，然后合上盖子。
9. 在4°C下以125，000×g旋转管2小时。
10. 旋转后，通过将管的内容物倒置在含有漂白剂的容器中而不干扰沉淀物来小心地丢弃上清液。标记颗粒（如果可见）。
11. 将超速离心管置于50 mL无菌管中，并在沉淀顶部加入200μL无菌DPBS。保持在4°C过夜不受干扰。
12. 第二天，通过上下移液40倍轻轻混合。
13. 在台式离心机中以13，000 x g的速度短暂旋转以沉淀任何碎屑。
14. 将上清液转移到新管中，并将病毒制剂等分为20μL等分试样。储存在−80°C。
15. 留出5μL制剂用于病毒滴度测量。

3. 基于 pLKO.1 的载体的 LVS 滴度测量

1. 按照制造商的建议，使用 qPCR 测定慢病毒颗粒的滴度。
2. 对于标准曲线，通过将5μL DNA稀释到45μL无核酸酶H₂O中，制备五个10倍标准对照DNA的连续稀释液（试剂盒中提供）。使用 1:100 至 1:100，000 的稀释度生成标准曲线。
3. 通过以下方式在冰上一式两份地设置反应:
   2x qPCR 预混液，10 μL
   引物混合物 2 μL
   样品或标准脱氧核糖核酸 2 μL
   无核酸酶 H₂O 6 μL
4. 使用套件手册中提到的循环条件执行 qPCR，总共 35 个循环。
5. 在 Y 轴上绘制循环阈值 （Ct） 值，在 X 轴上绘制病毒滴度。
6. 使用四种标准对照 DNA 稀释液（1:100 至 1:100，000）生成对数回归，以使用趋势线方程确定未知病毒样本滴度。

4. 基于 pll3.7 的载体的 LVS 滴度测量

1. 在感染前24小时在1mL完全生长培养基中在P12孔板的每个孔中接种1×10⁵ HEK293T细胞。
2. 用8μg/mL聚丙烯补充培养基，并向每个无菌1.5 mL管中加入1 mL。
3. 在1mL含聚溴烯的培养基中，使用4 μL，2 μL，1 μL，0.5 μL和0.1 μL浓缩慢病毒颗粒稀释病毒颗粒。
4. 将HEK293T细胞中的培养基替换为含有指示量的慢病毒颗粒以及8μg/ mL多戊烯的培养基，并在37°C下在具有5%CO 2和₂₁ %O 2气氛的加湿培养箱中孵育₂₄小时。
5. 第二天，更换为新鲜培养基，并在37°C的加湿培养箱中继续培养₇₂ 小时，气氛为5%CO 2和21%O₂。
6. 72小时后，用PBS洗涤细胞，根据制造商的方案在37°C下胰蛋白酶消化，并在1mL PBS中重悬。
7. 按照制造商的建议，使用细胞分选机进行FACS细胞分选。使用未感染的HEK293T细胞将门设置为0%GFP阳性细胞，并为每个样品计数50，000个事件，以确定每种病毒稀释的阳性细胞百分比。
8. 仅使用在2%-20%范围内产生%GFP阳性细胞的慢病毒颗粒体积来计算慢病毒颗粒的滴度。

5. 肝干细胞感染和稳定选择

1. 用2 mL PBS在6孔细胞培养多孔板的每个孔中生长的细胞洗涤。
2. 使用1mL 1x细胞解离试剂将细胞从细胞培养板上分离出来，在37°C下孵育5分钟。
3. 在DMEM / F12培养基中收集细胞，并在室温下以1，500×g离心5分钟以收集细胞沉淀。
4. 抽吸，将细胞重悬于1 mL中，并使用血细胞计数器计数。
5. 用2 x 10⁵ 个细胞/ mL的完全生长培养基制成细胞悬液，其中含有mTeSR1，并辅以10 ng / mL碱性成纤维细胞生长因子（bFGF），青霉素/链霉素（P / S）和10μM ROCK抑制剂（RI）。
6. 在500μL完全生长培养基中，在50x稀释的完整基底膜基质包被的P24孔板上接种1×10 5个细胞，并在37°C下在具有5%CO_2和21%O 2气氛的加湿培养箱中培养细胞_。
7. 第二天，用8μg/mL多戊烯以10的多重感染（MOI）感染hESC，并在37°C下孵育8小时。
8. 8小时后，用新鲜生长培养基（-RI）替换含病毒的培养基，并继续培养，直到细胞汇合90%。
9. 当细胞达到90%汇合度时开始选择嘌呤霉素（0.8μg/ mL），这通常是感染后48-72小时。
10. 选择完成后（通常为4-6天），将稳定细胞（1:4）分开并扩增细胞以进行冷冻保存和进一步分析。

6. H9衍生神经祖细胞（NPC）的转导

注意:NPC来自H9细胞，使用双Smad抑制方案，如前所述¹⁹。

1. 简而言之，在37°C下用细胞解离试剂处理H9细胞5分钟以产生单个细胞并重悬于含有mTeSR1的完全生长培养基中，其中补充有10ng / mL碱性成纤维细胞生长因子（bFGF），青霉素/链霉素（P / S）和10μM ROCK抑制剂（RI）。以60，000个细胞/ cm² （第0天）的密度在1:50稀释的基质凝胶包被的6孔细胞培养皿上接种。
2. 当细胞达到95%-100%汇合时，通过改变含有LDN193189（200 nM）和SB431542（10μM）（第1天）的100%KSR培养基来启动分化。
3. 在第2天，再次更换培养基，100%KSR补充LDN193189（200 nM），SB431542（10μM）和XAV939（5μM）。
4. 在分化的第4天，切换到KSR培养基（75%）和N2培养基（25%）与LDN193189（200 nM），SB431542（10μM）和XAV939（5μM）的混合物。
5. 从第6天到第12天，通过每天增加N2培养基25%并每2天更换一次培养基，逐渐将培养基切换到100%N2，并补充LDN193189（200 nM），SB431542（10μM）和XAV939（5μM）。
6. 培养第12天NPC在N2:B27培养基中，补充20 ng / mL bFGF。
7. 在2mL NPC培养基中，在1:50稀释的完整基底膜基质包被的P6板的每个孔中接种2 x 10 5个细胞，并孵育以允许细胞附着。
8. 第二天，在8μg/ mL多溴烯存在下，用MOI 6的慢病毒颗粒感染细胞。
9. 8小时后，用新鲜的鼻咽癌生长培养基替换含病毒培养基。
10. 第二天，重复感染并在8小时更换培养基。
11. 在收获之前将细胞在培养物中保持72小时以进行进一步分析。

基因转移后，不可避免地需要高活性的hESC。尽管在hESCs电穿孔后努力并优化了方案以减少细胞死亡，但在电穿孔这些细胞后仍然观察到超过50%的细胞死亡，以及低转染效率²⁰。慢病毒介导的基因转移不仅导致基因转移的高效率，而且在转导后显示出高水平的细胞活力。以下结果给出了两种方法:一种是使用GFP作为报告基因，在hESCs衍生的NPC中瞬时表达，另一种是使用嘌呤霉素稳定地选择hESCs进行长期分化实验。

在第一组实验中，通过共转染携带以GFP为报告的pll3.7载体的shRNA以及第二代慢病毒包装质粒psPAX2.0和pMD2.G来产生慢病毒颗粒。在转染后48小时和72小时后收集慢病毒颗粒，并使用超速离心浓缩。图1A显示了转染72小时后HEK293T细胞中丰富的GFP表达。病毒蛋白的表达也导致HEK293T细胞的合胞体形成，其中单个细胞融合在一起，如图1A中的箭头所示。使用FACS分析测定滴度。我们还使用低成本PEI和脂菲克胺3000试剂比较了慢病毒滴度，发现两者在病毒滴度方面没有显着差异（图2A）。接下来，H9 hESCs衍生的NPC在MOI为6时被这些含GFP的慢病毒颗粒感染两次，并在72小时后收获用于分析。 如上所述，对于长期分化实验，必须具有稳定表达shRNA的hESCs。为了创建表达各种基因shRNA的稳定细胞系，我们根据制造商的建议使用了基于plKO.1的载体并克隆了shRNA。接下来，如上所述产生慢病毒颗粒，并使用基于qPCR的方法使用商业慢病毒滴度测量试剂盒测定滴度（图2B）。hESCs被MOI为10的慢病毒颗粒感染，并使用嘌呤霉素选择进行选择。图3显示了转导后hESCs的稳定选择结果。用0.8μg/mL嘌呤霉素选择5天后，慢病毒转染细胞与非转导细胞相比显示出超过80%的细胞活力，其中没有细胞存活治疗。选择后，将稳定转导的H9细胞进一步扩增，冷冻保存，并使用蛋白质印迹进行分析，以测定有效的基因敲低。

在我们的实验室中，我们利用上述方法创建了多个稳定的H9 hESC细胞系，表达不同基因的shRNA。在这里，我们介绍了其中一个的结果，即使用蛋白质印迹分析的L-2-羟基戊二酸脱氢酶（L2HGDH）基因。在具有空载体骨架的转导细胞中观察到L2HGDH的大量表达。然而，在用携带shRNA的载体转导的细胞中未观察到L2HGDH的表达，这表明H9 hESCs细胞系的稳定生成与L2HGDH表达减少的功效，可用于进一步的分化研究（图4）。

图1:将GFP在HEK293T细胞和病毒感染的NPC中表达 （A）shRNA克隆到携带GFP作为报告基因的pll3.7载体中，并使用PEI与HEK293T细胞中的包装质粒共转染。高GFP表达显示转染72小时后的高效转染效率。箭头表示HEK293T细胞中合胞体形成，其中单个HEK293T细胞组由于病毒蛋白的表达而融合在一起。（B）H9衍生NPC在MOI为6时以含有GFP的慢病毒颗粒为报告基因两次，并在感染后72 h观察到GFP表达。比例尺 = 50 μm .请点击此处查看此图的大图。

（A）使用FACS分析测量基于pll3.7的载体的病毒滴度，通过量化那些产生2%-20%GFP阳性细胞的病毒稀释度的%GFP阳性细胞。（B） 根据制造商的建议，使用商用qPCR慢病毒滴度试剂盒测定基于pLKO.1的载体的病毒滴度。请点击此处查看此图的大图。

图3:建立稳定的表达shRNA的H9 hESC品系， 将shRNA克隆到携带嘌呤霉素选择基因的基于pLKO.1的慢病毒载体中。H9 hESCs被MOI为10的慢病毒颗粒感染，并使用嘌呤霉素选择。使用0.8μg/ mL嘌呤霉素5天，100%的非感染细胞被杀死，而大多数细胞在病毒感染组中存活。这些细胞在没有克隆选择的情况下被扩增以进行冷冻保存和进一步分析。比例尺 = 50 μm .请点击此处查看此图的大图。

图4:H9 hESCs中L2HGDH基因稳定敲低的代表性蛋白质印迹分析。 使用抗 L2HGDH 抗体对阴性对照（H9、咕噜未切割）细胞的总细胞裂解物以及稳定表达针对 L2HGDH（H9、sh-L2HGDH）的 shRNA 的细胞进行蛋白质印迹检测。如图所示，在H9 hESCs中未观察到L2HGDH的表达稳定地表达L2HGDH的shRNA。在对应于L2HGDH抗体的正确分子量46-48 kDa（由三角形表示）的特异性条带上方观察到非特异性条带。反加普德赫被用作装载控制。 请点击此处查看此图的大图。

出于研究或临床目的对干细胞进行基因修饰的能力受到技术和对hESCs生物学的基本理解的限制。在小鼠ESC中显示出巨大潜力的技术，如脂质渗透和电穿孔，对hESCs来说效率不高，众所周知，hESCs很难通过常规方法进行基因传递²⁰。这一概念不仅优化了现有技术，还开发了提高hESC转染效率的新方法。这些新发展的重点是高效和稳定的基因递送到hESC，同时在很长一段时间内保持对hESC生长，多能性和分化潜力的影响最小。在符合这些严格标准的各种新发展中，慢病毒介导的基因转移到hESC^21，22。为了生产表达特定基因的慢病毒颗粒，在其中一个转移载体中克隆所需的基因，并与包装质粒一起在HEK293T细胞中转染，以收获含有慢病毒颗粒的细胞培养上清液。要用于hESC，必须使用各种技术浓缩这些病毒颗粒，以产生至少1 x 10^7-1 x 10^8IU / mL范围内的高滴度病毒。通常，大量的LVS从原始体积的200x-500x浓缩，以达到这些滴度。这意味着在不影响HEK293T细胞转染效率的情况下使用高性价比的方法，是这些方法在实验室中常规使用的先决条件。本方法描述了使用阳离子聚合物PEI作为生产大量LVS的具有成本效益的方法，其转染效率类似于基于脂质法的转染方法，被认为是金标准。使用所提出的方法，我们可以在浓度因子为原始体积的200x后获得远高于5 x 10⁷ IU / mL的平均LVS滴度。使用这些LVS颗粒，我们已经能够通过感染高MOI的细胞来建立几种稳定的H9 hESCs细胞系，表达几种基因的shRNA。这里介绍的方法绕过了使用繁琐且耗时的克隆选择和扩增方法，同时仍然使敲低效率接近100%，如图 4中L2HGDH基因敲低的代表性蛋白质印迹结果之一所示。以下是成功方法的一些建议。

对于高病毒滴度，需要使用低传代数的HEK293T细胞（理想情况下低于30）。HEK293T细胞的汇合度是这方面的另一个重要因素。HEK293T细胞在转染前必须至少80%汇合，因为细胞与细胞的接触大大降低了细胞毒性并改善了病毒的产生。所使用的载体必须使用无内毒素的质粒分离试剂盒制备，然后进行乙醇沉淀，并在用于转染之前以最低浓度1mg / mL重建。在不同日期制备的PEI溶液可能存在批次间的变化。因此，必须首先使用GFP载体测试每批PEI溶液的性能，并且必须将溶液以一次性等分试样的形式储存在-20°C，以避免重复冻融循环。对于高滴度，只有在细胞健康且附着的情况下，才建议在HEK293T细胞转染72小时后收集LVS上清液。含LVS上清液的过滤大大提高了LVS超速离心后的溶解度。不建议将LVS上清液在4°C下储存超过5天，因为这会导致病毒滴度的显着降低。超速离心期间的蔗糖梯度是最佳滴度所必需的。在超速离心的所有步骤中，温度必须保持在4°C以下。需要将浓缩的LVS颗粒在DPBS中孵育过夜才能完全重悬。LVS重悬后离心可去除细胞碎片（如果有的话），因为它在靶细胞上使用时会引起细胞毒性。在H9细胞感染后，重要的是在8小时后用新鲜的生长培养基替换含病毒的培养基，因为与病毒的长时间孵育将导致H9 hESCs的显着细胞死亡。嘌呤霉素的选择只能在汇合度超过80%时开始。

上述方法最初适用于shRNA的表达。类似的方法可用于克隆到表达载体中的cDNA的异位表达。然而，慢病毒介导的基因递送的一个主要局限性是大小限制。随着尺寸的增加，慢病毒载体的包装不是最佳的，这导致病毒滴度降低²³。未来的研究应针对优化协议以克服这些限制。

作者声明不存在利益冲突。

这项工作得到了阿拉伯联合酋长国大学（UAEU）的研究资助，赠款#31R170（扎耶德健康科学中心）和#12R010（UAEU-AUA赠款）的支持。我们感谢兰德尔·莫尔斯教授（纽约州奥尔巴尼沃兹沃思中心）帮助我们编辑手稿的风格和语法。

所有数据均可根据要求提供。