Haut débit mesure du temps de Transit intestinale à l’aide de larve Zebrafish

Le but du présent protocole est de mesurer le temps de transit des aliments fluorescent étiquetés dans le tube digestif du poisson-zèbre larvaire dans un mode haut débit.

Poisson zèbre sont utilisés comme organismes modèles alternatifs pour la mise à l’essai de la sécurité des médicaments. Le système gastro-intestinal (GI) de poisson-zèbre a des similitudes génétiques, neuronales et pharmacologiques à celle des mammifères. Intolérance gastro-intestinale au cours des essais cliniques de médicaments candidats est courante et peut représenter une menace grave pour la santé humaine. Essais de toxicité de GI dans les modèles précliniques de mammifères peuvent être coûteux en termes de temps, composé d’essai et le travail. La méthode de haut débit présentée ici peut être utilisée pour prédire les problèmes de sécurité GI. Par rapport aux modèles mammifères, cette méthode permet pour une évaluation plus rationnel de test des effets combinés sur le transit de GI pendant l’utilisation de faibles quantités de composés. Dans cette méthode, le poisson-zèbre larvaire (7 jours après la fécondation) sont nourris des aliments contenant une étiquette fluorescente. Après la tétée, chaque poisson larvaire est placé dans un puits d’une plaque à 96-conique-fond-puits et dosé avec la substance d’essai (dissous dans l’eau) ou le véhicule. Transit intestinale est présent, les matières fécales s’accumule au fond des puits, et la vitesse à laquelle cela se produit est surveillée par la mesure de fluorescence du fond du puits à plusieurs reprises au fil du temps à l’aide d’un spectrophotomètre de plaque. La fluorescence de larves dans un groupe donné sont en moyenne et ces valeurs sont représentées graphiquement ainsi que de l’écart-type, pour chaque temps de mesure, ce qui donne une courbe représentant la moyenne transit des aliments dans le temps. Effets sur le temps de transit intestinale sont identifiés en comparant l’aire sous la courbe pour chaque groupe de traitement à celle du groupe imprégnées sur le véhicule. Cette méthode détecté des modifications dans le temps de transit de la GI zebrafish induit par les médicaments ayant des effets cliniques connus de GI ; elle peut être utilisée pour interroger des dizaines de traitements pour des effets gastro-intestinaux par jour. À ce titre, composés plus sûres peuvent être rapidement priorisés pour essais chez les mammifères, qui accélère la promotion 3Rs découverte et profère.

Poisson zèbre (Danio rerio) sont utilisés pour modéliser des vertébrés biologie et prédire la toxicité des médicaments et/ou de l’efficacité ; nouvelles demandes dans ces domaines apparaissent chaque année. Les avantages du poisson-zèbre sur modèles mammifères comprennent leur fécondité, leur petite taille et transparence par le biais de l’organogénèse. Poisson zèbre sont utilisés pour prédire des médicament candidat toxicité aiguë, aussi bien quant à évaluer l’impact composé sur la fonction des organes, par exemple, cardiaques, oculaires, gastro-intestinal (GI)^1,2. Physiologie et développement du poisson zèbre sont semblables à ceux des mammifères dans les nombreuses façons³ et 80 % des gènes associés aux maladies humaines ont un poisson zèbre homologue⁴.

Le tube digestif du poisson-zèbre a physiologie similaire pour le tube digestif chez les mammifères, mais a un plus simple architecture⁵. Poisson zèbre n’ont aucun estomac ; l’ampoule intestinale antérieure agit comme un dépôt alimentaire. L’expression des gènes dans l’intestin du poisson-zèbre a de nombreuses similitudes à celui des mammifères⁵. Comme les mammifères, le système nerveux entérique du poisson-zèbre contrôle la motilité intestinale et innervation intestinale reflète celle des autres vertébrés^6,7. Se fondant sur ces similitudes, des troubles fonctionnels de l’intestin de l’homme ont été étudiés chez le poisson zèbre, à l’aide de méthodes dérivées de modèles mammifères⁸.

Intolérance gastro-intestinale au cours des essais cliniques de médicaments candidats est courante et peut représenter une menace grave pour la santé humaine. L’examen des programmes dans une grande compagnie pharmaceutique au cours de 2005-2010 a révélé GI sécurité comme la principale cause de 9 % de l’étude clinique terminaisons⁹. Essais de toxicité de GI dans les modèles précliniques de mammifères peuvent être coûteux en termes de temps, composé et du travail. Prédictive d’un test de haut-débit pour GI transit peut offrir une certaine souplesse pour ajouter des tests de toxicité et réalisent des 3Rs impact. Une nouvelle méthode offrant une telle analyse est présentée par le protocole décrit ci-après. Ce test haut débit pourrait être employé au début de développement des médicaments de prioriser les candidats et de contribuer à la réduction des GI de sécurité dans les plus grandes espèces.

Toutes les méthodes décrites ici ont été approuvés par l’animalier institutionnel et utilisation Comité (IACUC) de AbbVie.Abbvie fonctionne sous le Guide de l’instituts nationaux de santé pour les soins et l’utilisation des animaux de laboratoire dans un établissement accrédité par l’Association pour l’évaluation et l’accréditation de laboratoire Animal Care (AAALAC). Aucun problème de santé animale ont été observés dans ces études.

1. reproduire le poisson-zèbre adulte et collecter des embryons

1. Maison et race adulte poisson-zèbre à l’aide d’élevage général et pratiques d’élevage. Par exemple, voir Westerfield¹⁰.
2. Préparer les moyennes de l’embryon en dissolvant déshydraté sel marin (voir Table des matières) désionisée en eau à une concentration de 60 mg/L.
3. Recueillir les ovocytes fécondés de la Chambre des adultes reproducteurs, rincez bien avec le milieu de l’embryon et maison des embryons dans environ 50 mL de milieu d’embryon en Pétri de 10 cm (50 embryons par plat) au 28 ± 1 ° C sur une 14:10 cycle h lumière : obscurité.
4. Retirer les embryons pas survécu après 24h et supplément avec la survie des embryons afin que chaque plat contient 50 embryons par plat.

2. former les larves à nourrir à l’aide alimentaire Non teinte

1. Le 4^ème jour après la fécondation (4 dpf), se nourrissent les larves dans chaque boîte de Pétri 2 mg de nourriture des larves de poisson en poudre (voir la Table des matières) en saupoudrant la nourriture sur le dessus de l’eau.
2. Laisser les larves 3 à 4 h pour se nourrir et puis transférez-les sur un endroit propre (pas de nourriture) Petri dish contenant environ 50 mL de milieu frais d’embryon.
   1. Pour vous aider à transférer sous peu de nourriture que possible, rincer chaque larve dans une boîte de Pétri contenant environ 50 mL de milieu embryon frais avant le transfert définitif au nouveau plat.
3. Répétez l’alimentation et le rinçage des larves sur le dpf 5 et 6 dpf.

3. préparer Fluorescent sur le 6 dpf alimentation humaine ou animale aux larves sur le dpf 7

1. Préparer les aliments contenant une étiquette fluorescente (ci-après dénommée fluorescent alimentaires, selon les méthodes de champ et al. ³). en bref, mélanger 300 µL de fluorescent label (voir Table des matières), 100 µL d’eau déionisée et 200 mg de poudre de chenilles sur un verre de montre de 10 cm.
2. Étalez la pâte qui en résulte en une fine couche sur le verre de montre. Laisser la pâte sécher à la température de la pièce dans l’obscurité pour > 8 h.
3. Racler le mélange séché sur le verre de montre, écraser pour poudre et conserver à température ambiante dans l’obscurité. La nourriture fluorescente est maintenant prête à être nourris aux larves.
4. Sur le dpf 7, nourrir le fluorescent pour les larves de la même manière comme fait pour les tétées précédentes, qui est nourrir 2 mg fluorescent par plat (voir étapes 2.1 – 2.2.1).
   Remarque : Assurez-vous que les aliments sont finement au sol en poudre. Frottant fluorescent alimentaire qui est enveloppé dans un poids de papier entre le pouce et l’index est une méthode utile pour assurer la nourriture au sol finement.

4. préparer des Solutions concentrées de dosage des composés d’essai

1. Dissoudre de chaque substance dans le milieu de l’embryon à une concentration qui est 2 x la dose cible d’essai. Si l’essai d’une gamme de dose est souhaitée, préparer plusieurs solutions concentrées de dosage des concentrations appropriées pour les doses désirées.
2. Préparer suffisamment de chaque solution concentrée de dosage pour que 24 larves peuvent être traitées. Chaque larve nécessitera 100 µL de solution (le volume final de chaque puits est 200 µL), de dosage à la dose de 2,4 mL tout le moins, solution est nécessaire pour chaque groupe de traitement ; 2,5 mL serait un volume approprié.
3. Si un solvant (c.-à-d., le diméthylsulfoxyde) a été utilisé pour solubiliser initiale de substance d’essai, préparer la dose de contrôle de véhicule approprié (c.-à-d., même quantité de solvant comme le traitement composé mais sans le composé). Et, comme l’a fait pour chaque groupe traité composé, préparer suffisamment de solution pour traiter les 24 larves véhicules.

5. transférer les larves dans une plaque à 96 puits et les traitements s’appliquent

1. Après que les larves ont été autorisés à se nourrissent fluorescent alimentaire pendant 2 h, utiliser une pipette de transfert pour les déplacer dans un plat de rinçage, comme l’a fait après le repas les jours antérieurs.
2. Après chaque larve est rincé, sortez-la avec 100 µL de milieu embryonnaire, et déplacez-le dans un puits d’une plaque multipuit de 96 puits en polystyrène fond conique (voir Table des matières), dispenser le 100 µL de milieu d’embryon dans le puits avec la larve.
3. Une fois que le nombre requis de larves ont été transféré à la plaque à 96 puits, ajouter 100 µL de la 2 × concentré de solutions de dosage à chaque puits.
   NOTE : L’utilisation d’une pipette multicanaux de 12 canaux facilite le dosage rapide des larves (12-à-un-temps). Pour éviter d’ajouter accidentellement le mauvais traitement, gardez la voie étroite dont les larves ont été dosés avec quel traitement et n’oubliez pas de changer les pointes de pipette entre les traitements.

6. mesurer Fluorescence initiales et subséquentes de chaque puits

1. Après avoir ajouté les solutions de dose, placer la plaque à 96 puits dans un spectrophotomètre plaque capable d’excitant et de détecter les émissions provenant de l’étiquette fluorescente.
   Remarque : Pour l’étiquette jaune-vert utilisé (voir la Table des matières), les longueurs d’onde appropriées de la lumière sont passionnants à 505 nm et la détection à 515 nm.
2. Lire la fluorescence de la plaque à 96 puits du bas 5 fois en succession immédiate sans agiter la plaque. Utiliser la valeur minimale des 5 lectures de chaque puits comme la fluorescence initiale du puits.
   NOTE : La raison pour laquelle 5 lectures sont prises chaque fois que la plaque est lu est que les larves nagent parfois sur le trajet de la lumière d’excitation et la nourriture dans leur tube digestif émet un signal très important qui n’est pas représentatif des selles libérés. Prenant le minimum des 5 lectures peut permettre d’éviter à l’aide de mesures artificiellement élevés de la nourriture non par lequel ils transitent.
3. Lire la fluorescence de la plaque à 96 puits (comme l’a fait pour la lecture initiale) toutes les 20 min pour les 2 premières heures après l’administration, toutes les 30 min pendant heures 3 et 4 après le dosage et puis une fois toutes les heures pendant des heures, 5, 6, 7 et 8 après l’administration.
   1. Faites attention à ne pas déranger (en secouant la plaque à 96 puits) s’installe entre les lectures, les matières fécales et incuber les larves à 28 ± 1 ° C entre les lectures.
4. Incuber les larves pendant la nuit à 28 ± 1 ° C et lire la fluorescence de la plaque à 96 puits le lendemain à la même époque que les larves ont reçu la veille. Utiliser cette mesure comme la fluorescence après la dose de 24h.

7. analyser les données

NOTE : Ici nous calculons l’accumulation par puits et groupe moyennes pour chaque point dans le temps.

1. Pour calculer l’accumulation par puits, à l’aide des valeurs seulement minimales de chacun des 5 se lit comme suit, soustraire la valeur initiale de la valeur de chaque instant. Effectuer ce calcul de la valeur initiale aussi bien (il en résulte une accumulation initiale de zéro pour chaque puits).
   1. Si l’accumulation dans un puits à l’instant de 24h est inférieure à 150 unités fluorescentes relatives, exclure que bien une analyse plus approfondie ; ces faibles valeurs sont probables dus à la faible ou aucun apport de nourriture par les larves fluorescente pendant la tétée, et donc ces larves ne sont pas bons sujets pour mesurer les temps de transit.
2. Pour chaque point dans le temps, calculer l’accumulation moyenne de puits contenant des larves traitées conjointement, en plus d’écart-type de ces moyennes.
3. Tracer l’accumulation moyenne sur l’axe des ordonnées contre temps sur l’axe des abscisses pour chaque groupe de traitement et de comparer les aires sous les courbes (AUCs).
   NOTE : Traitements qui sensiblement ralentissent ou accélérer les temps de transit auront AUCs significativement plus petits ou plus, respectivement, que le groupe imprégnées sur le véhicule.

Cette méthode, qui utilise spectrophotométrie axée sur la plaque pour évaluer GI transit, peut être utilisée comme substitut de haut débit de microscopie de fluorescence, qui est une méthode de débit plus faible pour l’évaluation de la même fonction (Figure 1). Pour générer les données à la Figure 1, les poissons traités de manière identique ont été analysés pour le transit de GI en utilisant la microscopie à fluorescence (images représentatives montrés) ou spectrophotométrie à 4 points dans le temps, 0, 4, 8 et 24 h après l’administration ; Comparaison des données de ces expériences ont donné des résultats hautement corrélés (régression linéaire des données r² = 0,95). La régression linéaire a une pente négative parce que la microscopie mesure le signal de fluorescence conservés et spectrophotométrie mesure le signal par lequel ils transitent.

Les effets des composés des mécanismes disparates, avec activité de GI bien établie chez l’homme, peuvent être détectés chez le poisson zèbre utilisant le test de spectrophotométrie (Figure 2). Par rapport aux contrôles imprégnées sur le véhicule, l’atropine (4,2 µM) et l’amitriptyline (5 µM) ralentissent GI transit, tandis que tegaserod (3,3 µM) et métoclopramide (33 µM) accélère les temps de transit. Érythromycine (14 µM), devrait accélérer les temps de transit n’avait aucun effet telle que mesurée par cette méthode. Taille des groupes traitement était 24 avant la suppression de données de larves sans aucune ou très faible signal. L’AUC pour le signal moyen par point de temps a été comparée entre les groupes traités au véhicule et imprégnées d’insecticide composé à l’aide honnêtement de différence de Tukey significative pour le contrôle de l’erreur-type-1. Les effets étaient considérés comme significatif uniquement lorsque p ≤ 0,05. Les concentrations utilisées pour les traitements ci-dessus étaient le maximum toléré des doses, déterminé dans une expérience préalable et définie comme la dose la plus élevée avec aucun effet nocif observé par observation brute.

Le dosage spectrophotométrie permet de mesurer les effets dose-dépendants des composés. La figure 3 fournit des données qui démontrent que l’atropine ralentit le transit GI manière dose-dépendante chez les larves de poisson zèbre. La plus faible dose d’atropine testés, 0.042 µM, n’eu aucun effet significatif, alors que chacun des deux concentrations plus élevées avaient des répercussions importantes, 0,42 µM ayant moins d’effet que 4,2 µM.

Une nouvelle méthode de dosage peut être évaluée par des essais témoins positifs et négatifs, c'est-à-dire composés connus pour être actifs et inactifs respectivement dans le système cible (dans ce cas le système cible est le transit de GI chez les mammifères). Pour le dosage de la spectrophotométrie, 18 témoins (positifs) actives et 6 contrôles (négatifs) inactifs ont été testés. Basé sur ces expériences, le dosage spectrophotométrie a forte valeur prédictive positive (90,9 %), mais de faible sensibilité (55,6 %) et de valeur prédictive négative (38,5 %). Ces valeurs sont issues des données présentées au tableau 1. Elles reflètent, dans la pratique, que si le temps de transit du poisson-zèbre est percutée par un traitement, transport en commun chez les mammifères est susceptible d’être touché. Toutefois, s’il n’y a pas d’effet sur le temps de transit de poisson-zèbre, ce n’est pas prédictif d’effet chez les mammifères.

Figure 1: transit alimentaire Fluorescent est détecté comme une perte de signal de l’imagerie microscopique et un gain correspondant au signal par spectrophotométrie axée sur la plaque. (A) les images microscopiques représentatives de l’analyse des effets de l’atropine (4,2 µM) sur les temps de transit de GI. (B) moyenne signal quantifié d’images microscopiques est hautement corrélés (négativement) avec signal de matière fécale invalidée (spectrophotométrie) de poissons traités identiquement. Données de poissons traités l’atropine sont en rouge. Ce chiffre copié avec la permission de Cassar et al. ¹¹. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 2 : Analyse de l’accumulation au fil du temps, d’une plaque multipuite signal fluorescent permet d’identifier les traitements qui modifient les taux de transport en commun de GI. Astérisque (*) indique les AUC significativement différente que chez les poissons traités véhicule. Barres d’erreur représentent l’erreur-type du signal moyen de larves dans le groupe de traitement par point dans le temps. Ce chiffre a été réutilisé avec la permission de Cassar et al. ¹¹. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 3 : L’atropine manière dose-dépendante ralentit le temps de transit intestinale zebrafish telle que reflétée par spectrophotométrie fluorescent de l’accumulation de matières fécale au fil du temps. Astérisque (*) indique les AUC significativement différente que chez les poissons traités véhicule. Barres d’erreur représentent l’erreur-type du signal moyen de larves dans le groupe de traitement par point dans le temps. Ce chiffre est réutilisé avec l’autorisation de Cassar et al. ¹¹. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Tableau 1 : GI l’activité des 24 composés chez les mammifères et de poissons. Ce tableau est réutilisé avec l’autorisation de Cassar et al. ¹¹.

La méthode spectrophotométrie roman pour mesurer les temps de transit de GI larves zebrafish, présenté ici, est un test efficace qui peut prédire les effets du traitement sur la GI-fonction chez les mammifères. Bien que le test est peu sensible, il a élevé prédictivité positive, ce qui est acceptable pour la première couche dosages employées pour dépouillant le nombre de traitements de candidat issu de toxicité de¹². Cette méthode est plus facile à exécuter, possède un débit plus élevé et utilise moins animal gère les étapes que la microscopie fluorescente.

Il y a des défis techniques inhérentes à cette méthode. Capture des larves après que alimentation les aliments fluorescent et de les transférer dans des puits individuels sont difficile au début. Cependant, avec la pratique, un technicien spécialisé peut remplir une plaque 96 puits en moins de 15 min. Si, à un moment donné, la plaque est accidentellement secouée et déstabilisé de la matière fécale du fond du puits avant la lecture, l’accumulation semble diminuer. Cela peut être évité en déplaçant la plaque d’immatriculation avec soin, sans agitation. Dans notre expérience, les mouvements normaux, y compris celle du tiroir motorisé spectrophotomètre plaque, n’a pas modifié le dosage. Plaque de lecteurs équipés d’un chauffage (c.-à-d., la plaque n’est à renvoyer à l’incubateur entre mesures) et situé près de l’essai laboratoire pourrait optimiser plus faible chance de perturbation, mais ce n’était pas nécessaire dans notre expérience.

Premières tentatives de la méthode ne comportaient pas de nourrir les jours précédant le test. Sans ces tétées « pratique », baisse du nombre de larves consommé des aliments fluorescent suffisante pendant la période avant l’application du traitement. Ces tentatives, variation au sein des groupes de traitement était supérieure, en plus de données étaient inutilisables en raison de l’accumulation de signal faible ou inexistant au fil du temps. Même avec la pratique d’alimentation, certaines larves ne pas consommer des quantités suffisantes de nourriture fluorescente, à l’exclusion des données provenant de ces larves diminue variation au sein des groupes et augmente la capacité d’identifier les effets du traitement. Commençant par les plus grandes tailles de groupe (c.-à-d. 24 contre 12) permet un nombre suffisant de larves qui contribuent à l’analyse des données utiles.

La microscopie de fluorescence révèle que le transit alimentaire était pratiquement terminée par 24h en larves traitées l’atropine (non illustré), mais les données de la microplaque du point final temps reflètent plus faible signal final dans le groupe de l’atropine, comparé au groupe de véhicule. À l’inverse, supérieur final microplaque fluorescence a été associée à des traitements qui accélère le temps de transit, même si les larves imprégnées de véhicule ont apparemment annulé leur tube digestif avant le point de la dernière fois. Basé sur la répartition au hasard pour le traitement des larves nourries d’aliments fluorescent, nous supposons la consommation équivalente de l’aliment fluorescent, en moyenne, parmi les groupes de traitement. Compte tenu de cela et basée sur les modèles décrits ci-dessus, fluorescence provenant de matières fécales diminue avec le temps passé dans le tractus gastro-intestinal larvaire ou transit plus rapide ajoute fluorescence dans les matières fécales en quelque sorte. La cause réelle est inconnue et n’a pas été interrogée, mais encore le dosage est capable de mesurer et de comparer les temps de transit entre les groupes.

L’emploi de cette méthode pour détecter les effets toxiques de GI de petites molécules est une application. Autres applications possibles comprennent la modélisation de maladies (p. ex., syndrome du côlon irritable) et de la découverte de nouveau traitement pour ces maladies, ou pour découvrir des composés pro-cinétique. En outre, couplés avec des modèles transgéniques, cette méthode pourrait être utilisée pour interroger le rôle des gènes dans la normale GI transit, ainsi que les troubles de transit, dont le déficit en neurones entériques. La larve de poisson-zèbre offre une plate-forme de l’organisme entier sur une échelle qui se rapproche de celle de la mise en culture cellulaire, mais puisqu’il y a plusieurs tissus et types de cellules multiples fonctionnant ensemble dans le poisson-zèbre, questions de biologie de systèmes peuvent être demandées et répondu en utilisant ce modèle.

Avec les avancements en technologie et leurs nouvelles applications, efficacité dans la conduite des essais de toxicité des poissons zèbres continuera d’améliorer. Poisson zèbre larvaire, manipulation des méthodes et des essais continuent à améliorer en termes de plus haut débit^13,14. La nouvelle méthode présentée ici est un exemple d’une amélioration qui peut rendre le poisson-zèbre études plus percutants.

La conception, étude conduite et soutien financier pour cette recherche ont été fournis par AbbVie. AbbVie a participé à l’interprétation des données, examen et approbation du manuscrit. S. Cassar, X. Huang et T. Cole sont des employés de AbbVie et n’ont aucun conflit d’intérêts supplémentaires de divulguer.

Simon Cassar de carpetbones.com conçu et créé le personnage animé utilisé pour démontrer la procédure dans la vie de l’essai de transit de GI.