Method Article
والهدف من هذا البروتوكول قياس وقت العبور المسماة فلوريسسينتلي الغذائي من خلال القناة الهضمية الزرد اليرقات في طريقة إنتاجية عالية.
وتستخدم الزرد كالكائنات نموذج بديل لاختبار سلامة العقاقير. وقد الهضمي (غي) من الزرد التشابه الجيني، والخلايا العصبية والدوائي للثدييات. التعصب غي أثناء التجارب السريرية للمرشحين المخدرات شائع، وقد تشكل تهديدا خطيرا لصحة الإنسان. اختبار السمية غي في نماذج الثدييات السريرية يمكن أن تكون مكلفة من حيث الوقت والاختبار المجمع، وحزب العمل. يمكن استخدام الأسلوب الفائق الذي قدم هنا للتنبؤ بالمسائل المتعلقة بسلامة معهد جوته. بالمقارنة مع نماذج الثدييات، يسمح هذا الأسلوب لتقييم أكثر ملاءمة لاختبار الآثار المركبة على العبور غي أثناء استخدام كميات منخفضة من المجمع. في هذا الأسلوب، الزرد اليرقات (7 أيام بعد الإخصاب) تتغذى على الأغذية التي تحتوي على تسمية فلورسنت. بعد الرضاعة، وضعت في بئر صفيحة 96-أسفل المخروطية-جيدا كل الأسماك اليرقات وجرعتي مع مجمع الاختبار (يذوب في الماء) أو السيارة. كما يحدث عبور القناة الهضمية، يتراكم البراز على الجزء السفلي من الآبار، ويتم رصد معدل الذي يحدث هذا بقياس الأسفار من أسفل البئر مرارا وتكرارا على مر الزمن لوحة جهاز المطياف الضوئي باستخدام. يتم حساب متوسط الأسفار من اليرقات في مجموعة معاملة، وهذه القيم هي رسوم بيانية جنبا إلى جنب مع الخطأ المعياري، لقياس كل الوقت، مما أسفر عن منحنى الذي يمثل متوسط النقل العابر للمواد الغذائية مع مرور الوقت. يتم تحديد الآثار على وقت عبور القناة الهضمية بمقارنة المنطقة تحت المنحنى لكل مجموعة العلاج لفريق المعالجة بالمركبات. هذا الأسلوب تم الكشف عن التغييرات في وقت العبور غي الزرد الناجم عن المخدرات مع الآثار غي السريرية المعروفة؛ يمكن أن تستخدم لاستجواب عشرات من العلاجات لآثار غي يوميا. على هذا النحو، مركبات أكثر أمنا يمكن بسرعة إعطاء الأولوية لاختبار الثدييات، مما يعجل النهوض 3Rs الاكتشاف وتنطوي.
وتستخدم الزرد (دانيو rerio) لنموذج بيولوجيا الفقاريات والتنبؤ بسمية العقاقير و/أو كفاءة؛ تطبيقات جديدة في هذه الحقول تظهر كل سنة. وتشمل مزايا الزرد أكثر نماذج الثدييات خصوبتها، وصغر حجمها، والشفافية من خلال أورجانوجينيسيس. وتستخدم الزرد للتنبؤ بالمخدرات مرشح السمية الحادة، كذلك فيما يتعلق بتقييم الأثر المركب على وظيفة الجهاز، مثلاً، من القلب، والعين، والجهاز الهضمي (غي)1،2. التنمية الزرد وفسيولوجيا مماثلة للثدييات في العديد من طرق3 و 80% المورثات المرتبطة بالأمراض التي تصيب البشر قد homolog الزرد4.
الجهاز الهضمي من الزرد مماثلة فسيولوجيا الجهاز الهضمي الثدييات ولكن لديه بنية أبسط5. وقد الزرد لا المعدة؛ لمبة المعوية الأمامي يعمل كمستودع للمواد غذائية. التعبير الجيني في الأمعاء الزرد لديه العديد من أوجه التشابه إلى أن الثدييات5. مثل الثدييات، ويتحكم الجهاز العصبي المعوي من الزرد حركية القناة الهضمية، وتعصيب الأمعاء المرايا التي لغيرها من الفقاريات76،. استناداً إلى أوجه التشابه هذه، وقد درست اضطرابات وظيفية للامعاء البشرية في الزرد، استخدام أساليب مستمدة من نماذج الثدييات8.
التعصب غي أثناء التجارب السريرية للمرشحين المخدرات شائع، وقد تشكل تهديدا خطيرا لصحة الإنسان. وكشف استعراض للبرامج في شركة أدوية كبرى خلال الفترة 2005-2010 سلامة غي كالسبب الرئيسي لنسبة 9 في المائة من الانهاءات الدراسة السريرية9. اختبار السمية غي في نماذج الثدييات السريري يمكن أن يكون مكلفاً من حيث الوقت، مجمع، وحزب العمال. مقايسة الفائق تنبؤية للعبور غي يمكن توفير المرونة مجمع سمية اختبار، وتسليم 3Rs أثر. أسلوب رواية تقدم مثل هذا تحليل يرد ببروتوكول الموضحة هنا. ويمكن استخدام هذا التحليل الفائق مبكرا في تطوير العقاقير إعطاء الأولوية للمرشحين، والمساهمة في الحد سلامة غي اختبار في الأنواع الأكبر.
تمت الموافقة على جميع الأساليب الموصوفة هنا "رعاية الحيوان المؤسسية" واستخدام اللجنة (إياكوك) من AbbVie.Abbvie ويعمل تحت "الدليل معاهد الصحة الوطنية" لرعاية واستخدام الحيوانات المختبرية في منشأة معتمدة من قبل رابطة تقييم واعتماد المختبرات الحيوانية الرعاية (آآلاك). لم تلاحظ أي شواغل الصحة الحيوانية في هذه الدراسات.
1-تولد الزرد الكبار وجمع الأجنة
2-تدريب اليرقات لإطعام استخدام الأغذية غير مصبوغ
3-إعداد الغذاء الفلورسنت على إدارة الشرطة الاتحادية 6 وتغذية لليرقات في إدارة الشرطة الاتحادية 7
4-إعداد الحلول الجرعات المركزة لاختبار المركبات
5-نقل اليرقات إلى لوحة 96-جيدا و "تطبيق العلاج"
6-تدبير Fluorescence الأولية واللاحقة من كل بئر
7-تحليل البيانات
ملاحظة: هنا نقوم بحساب تراكم كل بئر ومجموعة المتوسطات لكل نقطة في الوقت.
يمكن استخدام هذا الأسلوب، الذي يستخدم كانت تستند إلى لوحة لتقييم غي المرور العابر، كبديل الفائق للفحص المجهري نيون، وأسلوب إنتاجية أقل لتقييم نفس الوظيفة (الشكل 1). لتوليد البيانات في الشكل 1، تم تحليل الأسماك المعالجة مطابق تماما للعبور غي استخدام fluorescence مجهرية (الممثل الصور المعروضة) أو كانت في نقاط زمنية 4، 0، 4 و 8 و 24 ساعة بعد انتهاء الجرعات؛ مقارنة البيانات من تلك التجارب أعطت نتائج عالية مرتبطة (الانحدار الخطي للبيانات r2 = 0.95). الانحدار الخطي بمنحدر سلبية لتدابير الفحص المجهري إشارة fluorescence المحتفظ بها وكانت تدابير الإشارة العابرة.
يمكن الكشف عن آثار مركبات آليات متباينة، مع نشاط غي الراسخة في البشر، في الزرد باستخدام مقايسة كانت (الشكل 2). مقارنة بعناصر المعالجة بالمركبات، الأتروبين (4.2 ميكرومتر) واميتربتيلين (5 ميكرون) تباطأ غي العبور، بينما تيجاسيرود (3.3 ميكرومتر) وتسارع ميتوكلوبراميد (33 ميكرومتر) وقت العبور. الاريثروميسين (14 ميكرومتر)، يتوقع لتسريع وقت العبور ليس أثر مقاسا بهذا الأسلوب. وكانت معاملة مجموعة أحجام 24 قبل إزالة البيانات من اليرقات مع عدم وجود أو جداً منخفض إشارة. أوك للإشارة متوسط كل الوقت نقطة مقارنة بين المجموعات المعالجة بالمجمع، والمعالجة بالمركبات استخدام توكي في "فرق كبير بصراحة" للتحكم في نوع-1-خطأ. تعتبر الآثار الهامة فقط عندما p ≤ 0.05. وكانت التركيزات المستخدمة للعلاجات المذكورة أعلاه الحد الأقصى للتسامح مع الجرعات والعزم في تجربة سابقة ويعرف أعلى جرعة مع أي تأثير ضار ملحوظ بالرصد الإجمالي.
يمكن قياس الإنزيم كانت آثار الجرعة تعتمد على المركبات. الشكل 3 يوفر البيانات التي تبين أن الأتروبين تبطئ العبور غي جرعة [دبندنتلي] في الزرد اليرقات. اختبار, ميكرومتر 0.042 أدنى جرعة من الأتروبين، لم يكن لها تأثير كبير، بينما كان اثنان أعلى تركيزات كل أثر كبير، 0.42 ميكرون بعد أقل من تأثير من 4.2 ميكرومتر.
ويمكن تقييم مقايسة جديدة عن طريق اختبار الضوابط الإيجابية والسلبية، هي المركبات التي من المعروف أن النشطة وغير النشطة على التوالي في النظام الهدف (في هذه الحالة هو نظام الهدف بعبور غي الثدييات). للمقايسة كانت، تم اختبار 18 نشاطا (الإيجابية) فرض ضوابط و 6 غير نشط (السلبية). وبناء على هذه التجارب، قد المقايسة كانت عالية القيمة التنبؤية الإيجابية (90.9%)، ولكن حساسية منخفضة (55.6 في المائة) والقيمة التنبؤية السلبية (38.5%). تشتق هذه القيم من البيانات المقدمة في الجدول 1. وهي تعكس، في الممارسة العملية، أنه إذا تأثر وقت العبور الزرد بعلاج، العابر الثدييات من المحتمل أن تتأثر. ومع ذلك، إذا لم يكن هناك أي تأثير على وقت العبور الزرد، هذا ليس من التنبؤية لتأثير الثدييات.
الشكل 1: الكشف عن عبور الغذاء فلوري كفقدان إشارة من التصوير المجهري وربح مقابلة في إشارة التي كانت تستند إلى لوحة- (أ) الصور المجهرية الممثل من تحليل لتأثير الأتروبين (4.2 ميكرومتر) في وقت العبور غي. إشارة (ب) متوسط كمية من الصور المجهرية عالية (سلبا) مرتبطة بإشارة من البراز الملغاة (كانت) من الأسماك المعالجة مطابق تماما. بيانات من الأسماك معاملة الأتروبين باللون الأحمر. وهذا الرقم نسخها بإذن من كسار et al. 11- الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 2 : تحليل الإشارات الفلورسنت تراكم على مر الزمن من لوحة متعددة جيدا يتيح تحديد العلاجات التي تغير معدل العبور غي- تشير العلامة النجمية (*) إلى أوك تختلف اختلافاً كبيرا من الأسماك المعالجة بالمركبات. أشرطة الخطأ تمثل الخطأ القياسي لإشارة يعني لليرقات في مجموعة العلاج كل مرة نقطة. وهذا الرقم قد تم استخدامها بإذن من كسار et al. 11- الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 3 : الأتروبين الجرعة-[دبندنتلي] يؤدي إلى إبطاء وقت عبور القناة الهضمية الزرد كما تعكسه الفلورية كانت تراكم البراز مع مرور الوقت- تشير العلامة النجمية (*) إلى أوك تختلف اختلافاً كبيرا من الأسماك المعالجة بالمركبات. أشرطة الخطأ تمثل الخطأ القياسي لإشارة يعني لليرقات في مجموعة العلاج كل مرة نقطة. وهذا الرقم يتم استخدامها بإذن من كسار et al. 11- الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الجدول 1: غي نشاط مركبات 24 في الثدييات والأسماك- يتم إعادة استخدام هذا الجدول بإذن من كسار et al. 11.
كانت الرواية أسلوب قياس الزرد اليرقات وقت العبور غي، المعروضة هنا، هو فحص كفاءة التي يمكن التنبؤ بآثار العلاج على وظيفة غي الثدييات. على الرغم من الفحص لديه حساسية منخفضة، فقد بريديكتيفيتي إيجابية عالية، ومقبول لفحوصات الطبقة الأولى المستخدمة للتقشير أسفل عدد العلاجات المرشح استناداً إلى السمية12. هذا الأسلوب هو أسهل لتنفيذ ولديه أعلى من الناتج ويستخدم أقل الحيوان التعامل مع الخطوات من مجهر فلوري.
وهناك تحديات التقنية الملازمة لهذا الأسلوب. اصطياد اليرقات الفردية بعد إطعام الطعام الفلورسنت وتحويلها إلى الآبار الفردية يمثل تحديا في البداية. ومع ذلك، مع الممارسة، يمكن ملء أحد الفنيين مهرة صفيحة 96-جيدا في أقل من 15 دقيقة. إذا، في نقطة زمنية معينة، وهو اللوحة تهتز بطريق الخطأ وغير مستقر البراز من الجزء السفلي من الآبار قبل القراءة، سوف تظهر التراكم الانخفاض. ويمكن تجنب هذا بالانتقال plate(s) بعناية، دون المصافحة. في تجربتنا، عدم الإزعاج الحركة العادية، بما في ذلك جهاز المطياف الضوئي لوحة درج المزودة بمحركات، التحليل. لوحة القراء مزودة بسخان (أياللوحة لم يتم إرجاعها إلى حاضنة بين القياسات)، ويقع قرب المقايسة البدلاء المختبر يمكن الأمثل لأدنى فرصة للاضطراب، ولكن هذا ليس ضروريا في تجربتنا.
لم تشمل المحاولات المبكرة في الطريقة التغذية في الأيام التي سبقت المقايسة. دون تلك الوجبات 'الممارسة'، تستهلك عدد أقل من اليرقات الغذاء الفلورسنت كافية خلال الوقت المسموح به قبل تطبيق العلاج. في هذه المحاولات، تباين داخل المجموعات المعاملة كان أكبر، ومزيد من البيانات غير قابلة للاستخدام بسبب إشارة منخفضة/لا تراكم على مر الزمن. حتى مع ممارسات التغذية، لا يتناولون كميات كافية من الأغذية الفلورسنت بعض اليرقات، باستثناء البيانات من تلك اليرقات إنقاص التباين داخل المجموعات ويزيد من القدرة على تحديد آثار العلاج. بدءاً بأحجام أكبر مجموعة (أي 24 مقابل 12) يسمح لعدد كاف من اليرقات المساهمة بيانات مفيدة للتحليل.
مجهر فلوري يكشف أن عبور المواد الغذائية قد أوشك على الاكتمال قبل 24 ساعة في يرقات معاملة الأتروبين (غير معروضة)، بيد أن تعكس البيانات الميكروسكوبية من النقطة الزمنية النهائية أدنى إشارة النهائي في المجموعة الأتروبين، مقارنة بمجموعة مركبة. على العكس من ذلك، أعلى الميكروسكوبية النهائي fluorescence ارتبط بالعلاجات التي تسارع الوقت العابر، على الرغم من أن اليرقات المعالجة بالمركبات قد باطلة على ما يبدو على الجهاز الهضمي قبل الوقت النهائي النقطة. بناء على الإحالة العشوائية إلى معاملة اليرقات تغذيها الغذاء الفلورسنت، نفترض ما يعادل استهلاك الأغذية الفلورسنت، في المتوسط، بين مجموعات العلاج. ونظرا لذلك، واستنادا إلى الأنماط المذكورة أعلاه، الأسفار من البراز ينخفض مع الوقت الذي يقضيه في الجهاز الهضمي اليرقات أو العبور أسرع يضيف الأسفار إلى البراز بطريقة ما. السبب الحقيقي غير معروف وقد تم استجوابهم لا، لكن ما زال التحليل قادر على قياس ومقارنة وقت العبور بين المجموعات.
توظيف هذا الأسلوب في الكشف عن آثار غي سمية من المركبات جزيء صغير من تطبيق واحد. وتشمل التطبيقات المحتملة الأخرى النمذجة المرض (مثلاً، القولون العصبي) واكتشاف رواية العلاج لمثل هذه الأمراض، أو لاكتشاف مركبات برو-الحركية. وعلاوة على ذلك، إلى جانب نماذج معدلة وراثيا، يمكن استخدام هذا الأسلوب لاستجواب دور الجينات في العبور غي العادية، فضلا عن اضطرابات العابر، بما في ذلك نقص العصبية المعوية. اليرقة الزرد يوفر منبرا الكائن حي كله على نطاق ويقترب من استزراع الخلايا، ولكن نظراً لوجود متعددة الأنسجة وأنواع الخلايا العديدة تعمل معا في الزرد، أسئلة بيولوجيا الأنظمة يمكن أن يطلب والرد عليها باستخدام هذا نموذج.
مع التقدم في التكنولوجيا، وتطبيقات جديدة منه، سوف تستمر الكفاءة في إجراء اختبارات السمية الزرد تحسين. الزرد اليرقات التعامل مع أساليب وفحوصات مستمرة لتحسين من حيث أعلى سرعة نقل13،14. أسلوب الرواية المقدمة هنا مثال واحد من التحسن قد تجعل الدراسات الزرد أكثر تأثيراً.
تصميم وإجراء الدراسة، وتقديم الدعم المالي لهذا البحث قدمت أبفيي. وشارك أبفيي في تفسير البيانات والمراجعة والموافقة على هذه المخطوطة. س. كسار، X. Huang، وكول ت. غير العاملين أبفيي ولا تضارب إضافية في الكشف عن.
سيمون كسار من carpetbones.com تصميم وإنشاء الرقم متحركة تستخدم لإثبات إجراءات الفحص العابر غي في الحياة.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Wild type zebrafish breeding pair | Various sources - for example ZIRC (Zebrafish International Resource Center) | ZL-1 | Adult wild type zebrafish of AB lineage |
1.7 L Breeding Tank - Beach Style Design | Tecniplast | 1.7L SLOPED | Breeding tank |
Instant Ocean sea salt | Intant Ocean | SS15-10 | Dehydrated sea salt |
First Bites larval fish food | Hikari | 20095 | Powdered larval fish food |
Yellow-green (505/515) Fluospheres | Invitrogen | F8827 | Fluorescent label |
V-bottom 96-well polystyrene microplates | Thermo Fisher Scientific | 249570 | Multiwell microplate with V-shaped bottom in each well |
Atropine | Sigma Aldrich | A0132 | |
Amitriptyline | Sigma Aldrich | A8404 | |
Tegaserod | Sigma Aldrich | SML1504 | |
Metoclopramide | Sigma Aldrich | M0763 | |
Erythromycin | Sigma Aldrich | E5389 | |
Spectramax M2e microplate reader | Molecular Devices | Spectramax M2e | A multi-well plate spectrophotometer capable of fluorescent excitation and emission detection. |
SoftMax Pro | Molecular Devices | SoftMax Pro | Software for spectrophotometer data acquisition |
Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article
Request PermissionThis article has been published
Video Coming Soon
Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved