Method Article
Nous présentons ici une technique d'imagerie fluorophore sur la base pour détecter la viabilité des cellules sur un échafaudage en titane non-transparent, ainsi que pour détecter des aperçus des impuretés d'échafaudage. Ce protocole répare l'inconvénient d'imager les interactions cellule-cellule ou cellule-métal sur des échafaudages non transparents.
Intervertebral disc degeneration and disc herniation is one of the major causes of lower back pain. Depletion of extracellular matrix, culminating in nucleus pulposus (NP) extrusion leads to intervertebral disc destruction. Currently available surgical treatments reduce the pain but do not restore the mechanical functionality of the spine. In order to preserve mechanical features of the spine, total disc or nucleus replacement thus became a wide interest. However, this arthroplasty era is still in an immature state, since none of the existing products have been clinically evaluated.
This study intends to test the biocompatibility of a novel nucleus implant made of knitted titanium wires. Despite all mechanical advantages, the material has its limits for conventional optical analysis as the resulting implant is non-transparent. Here we present a strategy that describes in vitro visualization, tracking and viability testing of osteochondro-progenitor cells on the scaffold. This protocol can be used to visualize the efficiency of the cleaning protocol as well as to investigate the biocompatibility of these and other non-transparent scaffolds. Furthermore, this protocol can be used to show adherence pattern of cells as well as cell viability and proliferation rates on/in the scaffold. This in vitro biocompatibility testing assay provides a propitious tool to analyze cell-material interaction in non-transparent and opaque scaffolds.
La lombalgie chronique est une maladie multifactorielle. L'intérêt dans une option de traitement peu invasif pour la maladie dégénérative du disque a augmenté depuis les années 1950. Jusqu'à aujourd'hui, la fusion de plusieurs segmentaire de la colonne vertébrale est le traitement le plus largement utilisé. Depuis, cette méthode conduit souvent à des limitations de la mobilité du segment affecté 1,2, l' exploration de l'ère de l' arthroplastie est devenu un grand intérêt. Des progrès considérables en remplacement de disque et le noyau remplacement total est devenu une bonne alternative pour traiter les douleurs chroniques au dos 1. Malgré les énormes progrès, aucune des méthodes a été évaluée cliniquement. Les implants de noyaux moins rigides représentent une alternative prometteuse pour le remplacement total du disque, à condition que l'anneau fibreux est intact 3,4. Cependant, les implants actuellement présents noyau sur le marché sont souvent associées à des complications comme les changements dans le corps vertébral, dislocation, vertical perte du disque et t la hauteuril manque de nécessaire rigidité mécanique associée 5. Afin de pallier aux inconvénients actuels, un nouvel implant de noyau en fils tricotés de titane a été développé avec succès 6. En raison de la structure tricotée unique, cet échafaudage nouvellement développé a montré des caractéristiques biomécaniques distingués, par exemple, fonction d' amortissement, la taille des pores, la capacité de chargement et de fiabilité 7. Dans le but de tester la biocompatibilité de ce nouvel implant de noyau, représenté dans les limites sévères (optique) des techniques d'analyse attribuées à caractère non transparent de l'implant.
Afin de tester la biocompatibilité, l' interaction cellule-métal joue un rôle prépondérant 10/08. Une interaction entre les cellules et l'échafaudage est nécessaire pour la stabilisation et par conséquent pour l'intégration de l'implant mieux dans le système hôte. Cependant, une augmentation de la profondeur de croissance intérieure peut altérer les propriétés mécaniques de l'échafaudage. Visant à investigate si la surface de l'échafaudage fournit une base pour la fixation cellulaire, la prolifération et la différenciation ou si le métal affecte la viabilité des cellules, il est important de résoudre le problème commun bien connu de l'imagerie de cellules sur / dans les échafauds non transparentes et opaques. Afin de surmonter cette limitation plusieurs fluorescent techniques basées ont été explorées. Les entreprises offrent une large gamme de fluorophores pour visualiser les cellules vivantes, des compartiments cellulaires, ou des états cellulaires spécifiques même 11. Fluorophores pour cette expérience ont été choisis avec l'aide de l'outil visualiseur spectrale en ligne afin d'adapter au mieux notre microscope fluorescent.
La stratégie développée pour l'analyse des cellules comportement adhérent sur / dans l'échafaudage de titane tricoté non-transparent comprend les éléments suivants: 1) fluorescent (protéine fluorescente verte / GFP) marquage des cellules osteochondro-progénitrices pour permettre le suivi des cellules sur la échafaud, 2) la mesure de la viabilité (mitoactivité chondrial) des cellules, et 3) la visualisation de cellule à cellule et des interactions cellulaires matériau au sein de l'échafaudage. La procédure présente l'avantage qu'il peut être facilement transféré à d'autres cellules adhérentes et autres échafaudage non transparente ou opaque. En outre, la viabilité et la structure de croissance interne peuvent être contrôlés pendant plusieurs jours, il peut donc être utilisé avec des quantités limitées de matériau d'échafaudage ou de cellules.
La présente étude démontre l'utilisation réussie de notre protocole actuel pour mesurer la viabilité cellulaire et de visualiser modèle dans la croissance des cellules progénitrices osteochondro-sur / dans l'échafaudage de titane tricoté non-transparent. En outre, les protocoles développés pourraient être utilisés afin de déterminer les impuretés d'échafaudage et de vérifier les protocoles de nettoyage.
REMARQUE: Les cellules précurseurs immortalisés stromales mésenchymateuses humaines (SCP-1 cellules) ont été utilisés pour les expériences. SCP-1 cellules ont été fournies par le Prof. Matthias Schieker 12.
1. Extension du SCP-1 cellules
2. Comptage de SCP-1 cellules
3. GFP Transfection de SCP-1 cellules
NOTE: Afin d'observer SCP-1 la croissance des cellules sur et dans l'échafaudage de titane tricoté sur une certaine période de culture, nous avons marqué les cellules avec une protéine fluorescente verte (GFP). La surexpression de la protéine GFP est obtenue par infection avec des particules d'adénovirus codant pour la GFP. incompétence de réplication (-E1 / -E3) adénovirus particules codant pour la protéine fluorescente verte (GFP) ont été utilisés pour infecter SCP-1 cellules. Les particules virales ont été obtenues auprès du Prof. Steven Dooley 13 en recueillant le surnageant de culture de l' adénovirus recombinant (Ad5-GFP) , les cellules HEK293T transfectées (de laboratoire de biosécurité II). Trois répétés de congélation (-80 ° C) et le dégel (37 ° C dans le bain d'eau) cycles assuré qu'aucune HEcellules K293T restent viables pour produire de nouvelles particules virales. L'utilisation de ce stock de semences adénovirus peuvent efficacement infecter les cellules SCP-1 sans produire de nouvelles particules virales. Ainsi, les cellules infectées peuvent être traitées dans un laboratoire de biosécurité I.
4. Nettoyage de Bonneterie titane échafauds
5. Imagerie Scaffold Structures par immunofluorescence indirecte
REMARQUE: Le présent protocole décrit l'imagerie des structures d'échafaudage par fluorescence indirecte en utilisant le fluorophore sulforhodamine B qui donne une fluorescence rouge vif à une longueur d'onde ex / em de 565/586 nm. Cependant, le fluorophore peut être changé pour un meilleur ajustement pour les réglages du microscope donnés ou possible auto-fluorescence de l'échafaudage.
6. biocompatibilité in vitro Dosage
Figure 5: Chronologie de l' essai in vitro (A) Montage expérimental pour le placage des cellules.. (B ) Illustration de la procédure, en insistant sur l' importance du protocole de début et de validation de la fonctionnalité cellulaire jusqu'au jour 7. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
mesure 7. résazurine Conversion
REMARQUE: résazurine essai de conversion est utilisée pour mesurer l'activité mitochondriale et donc indirectement la prolifération cellulaire. Réduction de la résazurine à la résorufine génère un signal fluorescent, qui est basé sur l'activité mitochondriale associée au nombre de cellules viables (Figure 7A).
8. Coloration en direct mort
Les résultats préliminaires ont montré que le nouvel implant de noyau décrit non seulement a de bonnes caractéristiques d'amortissement, mais aussi est biocompatible avec SCP-1 cellules. Au cours du processus de l'implant de la production, il entre en contact avec des substances solides corrosifs et toxiques (lubrifiant, mordançage solution, électro-polissage). Avec l'aide de techniques indirectes de coloration fluorescente , nous avons pu visualiser les impuretés restantes et par conséquent d' optimiser un protocole de nettoyage montrant une réduction significative de la charge de la substance sur l'échafaud. La figure 3 montre l'efficacité du protocole de nettoyage mis en place.
Le succès des implants utilisés pour le traitement de l' arthroplastie est déterminée par des événements qui ont lieu à l'interface de la cellule-matériau. La figure 4 montre les cellules attachées sur l'échafaud après 24 h de placage, comme décrit dans la section de protocole 6. Une importante transfection efficacité du SCP-1 des cellules a été observé que possible l' image de la structure des cellules précurseurs stromales mésenchymateuses de croissance sur l'échafaud (voir Figure 2). La visualisation directe confirme la biocompatibilité de l'échafaudage et représente également le motif d'adhérence à la surface de l' échafaudage (figure 4). La coloration fluorescente peut être réalisée en outre pour examiner l'interaction cellulaire avec étalement et sur la surface de l'échafaudage.
Fluorophores ont été appliquées avec succès en vue d'examiner la mort cellulaire et la prolifération sur une période de temps sur l'échafaud. Images en direct-dead-coloration montrent comment la coloration peut réussir à se faire sur l'échafaud pour confirmer la pour cent la viabilité des cellules sur une période de temps. La figure 6 montre une coloration nucléaire bleu (Hoechst 3342) dans toutes les cellules, rouge marqué par fluorescence (éthidium homodimère) les cellules mortes et l'étiquetage vert pour l'incorporation de calcéine-AM que la viabilité marker. Calcéine AM est converti en calcéine qui présente une fluorescence vert clair en présence d'ions calcium dans le cytoplasme des cellules. Hoechst 33342 est perméable à la paroi cellulaire et intercale dans l'ADN cellulaire. De cette façon , toutes les cellules montrera noyaux bleu (voir Figure 6). Éthidium homodimère est pas la paroi cellulaire perméable, donc il ne fera que intercalent dans l'ADN des cellules mortes. De cette façon, les cellules mortes montrera noyaux rouges. En outre, la viabilité des cellules et pliez augmentation du nombre de cellules sur échafaudage plus d' une semaine a été quantifiée par résazurine test de conversion et représentés graphiquement (figure 7).
Figure 1: Cellule de comptage avec un hémocytomètre (A) Mise en place d'un ensemble de chambre.. (B) Illustration de comptage des chambres; 4 x 4 chambre de comptage est utilisé pour une cellule de COUnt. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 2:. Efficacité de transfection GFP cellules SCP1 présentent une forte fluorescence verte indiquant positif efficacité ad-GFP transfection. Barre d'échelle = 1000 pm, 4X grossissement. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 3: sulforhodamine B coloration des images négatives capture (A) Échafaudages avant de le nettoyer.. La flèche indique la présence de substances toxiques / corrosives sur échafaudage. (B) Échafaudages après le protocole de nettoyage. Barre d'échelle = 1000 pm, 4X grossissement. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 4:. Motif d'adhérence des cellules sur SCP1 signal GFP échafaudage indique l' adhérence cellulaire et la courbe de croissance sur la surface de l'échafaudage de titane tricoté. Barre d'échelle = 1000 pm, 4X grossissement. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 6: Co-fluorescence coloration des cellules sur échafaudage (. A) La coloration nucléaire Hoechst (bleu) et (B) la coloration cytoplasmique calcéine-AM (vert). (C) La flèche indique la présence de cellules mortes en raison de l' absorption d'éthidium homodimère-1 tache (rouge). (D) montre l'image fusionnée. Barre d'échelle = 1000 pm, 4X grossissement. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 7: résazurine essai de conversion (A) Biochemical réaction de réduction du colorant redox (résazurine) en un produit final (résorufine) qui émet une fluorescence et subit des changements colorimétriques.. (B) L' activité mitochondriale a été mesurée lorsque les cellules ont été étalées sur 0,75 mg / cm³ échafaudage de densité. Les données ont été recueillies à l'aide fluorescence instrument de mesure sur la base. L'intensité de fluorescence à 590 nm (axe des y) en des points de temps définis (axe des x) est représenté comme un résultat de la mesure quantitative de la viabilité cellulaire (Ex = 540 nm, Em = 590 nm). La signification statistique a été déterminée à l'aide de deux ANOVA et l'erreur standard de la moyenne (SEM) est présentée comme une des barres d'erreur. Compte tenu des propriétés physiques de l' échafaudage, par exemple, la taille des pores et les propriétés mécaniques (par exemple, la fonction d' amortissement) ensemble, 0,75 mg / cm³ échafaudage de densité a été utilisée pour la caractérisation biocompatibilité. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Composants média | La concentration |
médias Basal aMEM (en%) | 90 |
Sérum (%) | dix |
Pen / Strep (%) | 1 |
Tableau 1: culture cellulaire composition (aMEM) Media.
Problème | Cause | Solution |
imagerie cellulaire de viabilité sur échafaudage non-transparent | Échafaudages empêche la lumière de pénétrer sans distorsion | Utiliser une technique d'imagerie à base de fluorophores pour l'évaluation de la cellule. |
L'interférence de l'intensité de fluorescence | fluorescence automatique, signal de fond | Faites attention aux fluorophores et l'utilisation appropriée en fonction des propriétés particulières d'échafaudage. |
Évaluation de la viabilité cellulaire sur échafaudage au cours d'une période de culture | Rmesures epeated sur une longue période | Transfecter les cellules avec des particules ad-GFP-virus. |
évaluation de la fonctionnalité de cellule sur échafaudage non-transparent | la technique d'imagerie par fluorescence permet qu'une cellule d'étalement analyse du motif. | Effectuer résazurine test de conversion (quantitative de mesure de la viabilité cellulaire) dans une combinaison avec la technique d'imagerie. |
Tableau 2: Tableau récapitulatif: dépannage de l'imagerie de la viabilité des cellules sur échafaudage non-transparent.
La surface de l' échafaudage joue un rôle important dans son interaction avec les tissus environnants in vivo , en déterminant ainsi la longévité des implants fonctionnels. Par conséquent, la biocompatibilité de l'échafaudage est étudié par des essais in vitro en utilisant des cellules (lignée cellulaire SCP1), lorsque plaqué sur les échafauds.
techniques de microscopie qui fonctionnent bien avec échafauds minces et optiquement transparents sont mal adaptés pour les échafaudages non transparents pour étudier la biocompatibilité. Ceci est principalement parce que les échafauds non transparents empêchent la lumière de pénétrer sans distorsion significative 15. Pour surmonter en partie ces problèmes, nous établissons ci-joint une méthode d'évaluation de la cellule sur / dans titane fait échafauds tricotés en utilisant divers fluorophores.
Afin de permettre le tricotage, suivi par le pliage des fils de titane, le matériau vient en contact avec des substances toxiques et corrosifs forts (lubrifiant, mordants, electrosolution), ce qui pourrait altérer la biocompatibilité de l'échafaud si des traces restent dans / sur l'échafaud à polir,. Avec l'aide d'un protocole indirect-fluorescence développé (protocole n ° 5), nous pourrions visualiser la structure d'échafaudage. En outre, les caractéristiques d'échafaudage, par exemple, l'épaisseur du matériau, de la taille individuelle des pores et la forme, ou la densité conjonctifs, ont été analysées en utilisant ImageJ. Une épifluorescence supérieure agrandie image microscopique a permis de visualiser les impuretés dans l'échafaudage, ainsi que sur la surface de l' échafaudage. Figure 3b représente donc le résultat de confirmation du protocole de nettoyage développé avec succès. Le principe de ce protocole de marquage indirect peut être facilement reproduit dans d'autres échafaudages non transparents, en tenant compte des propriétés d'échafaudage individuels, par exemple, la taille des pores et la diffusion correspondante qui affecte le temps d'incubation. En outre, l'auto-fluorescence des paramètres d'échafaudage et microscopique affecte le choix de fluorophores utilisées. La fluorescence de l'outil spectral viewer en ligne peut aider à choisir les fluorophores adéquates.
interaction Cell-métal a été examinée indirectement en analysant le modèle de l'adhérence des cellules sur l'échafaud. Protocole 6 décrit la méthodologie de la façon dont les cellules peuvent être contrôlées in vitro si plaqués sur des échafaudages non transparents dans les systèmes de culture en utilisant une stratégie GFP de transfection. D'après les résultats préliminaires des essais in vitro, il a été prédit que les propriétés de surface telles que la composition, la micro-topographie et la rugosité 16 pourraient jouer un rôle important dans l' établissement de l' adhésion et la propagation des cellules cibles. Le titane étant un biomatériau ainsi pourrait agir comme un modèle de substrat pour fournir la base pour la fixation des cellules (voir Figure 4).
Implant topographie de la surface a été rapportée pour influencer le comportement de la cellule 16. Dans la présente étude, nous avons analysé la croissance cellulaire /la diffusion et la viabilité en utilisant des techniques de coloration par fluorescence en combinaison avec des mesures quantitatives de viabilité. L'analyse a révélé une variation subtile pour cent de la viabilité des cellules et la diffusion en fonction du matériau de l'échafaudage. Cependant, la fonctionnalité cellulaire évaluée quantitativement par dosage résazurine de conversion (activité mitochondriale) n'a pas été affectée de manière significative par le matériau de l'échafaudage. La mesure de l'activité mitochondriale par conversion résazurine présente l'avantage qu'il ne soit pas toxique cellule et peut donc être réalisée de manière répétée sur une période de culture à long terme. Une attention particulière doit être prise lors du lavage hors solution de travail de résazurine résiduelle, afin de ne pas accumuler de signaux d'arrière-plan (résultats faux positifs). Malgré ces avantages, le test de conversion de résazurine ne donnera aucune information sur la cellule d'étalement sur l'échafaud. Les cellules GFP infectées peuvent donc être suivis sur une longue période de culture (signal GFP est resté constant pendant plus de 14 jours), ce qui permet de visualiser smodèle de croissance pécifique sur la surface de l'échafaudage. La visualisation des cellules plus profondes dans l'échafaudage est encore limité par le matériau d'échafaudage, et donc nécessitera une dissection de l'implant. La combinaison de ces deux techniques a le grand avantage qu'il peut être facilement transféré à d'autres types de cellules, étant donné que le temps d'incubation peut être adaptée au type cellulaire d'intérêt. Cependant, le soin doit être pris lors du transfert de cette méthode à d' autres échafauds non transparents, par exemple, le collagène échafauds qui présentent généralement une forte auto-fluorescence verte 17 base. Dans ce cas, d'autres marqueurs fluorescents peuvent être utilisés. La combinaison des deux méthodes ci - dessus mentionnées a donc plusieurs avantages (voir le tableau 2).
Caractéristiques de Scaffold, par exemple, des pores des cellules pourrait piéger de taille à l' intérieur de l'échafaud. Dans le cas contraire suffisamment d'éléments nutritifs sont fournis, ces cellules peuvent mourir et sécrètent des proteases qui affectent la viabilité des cellules de l'entourageing cellules / tissus. Nous avons pu adapter un protocole de coloration fluorescente à base qui est capable de visualiser les cellules vivantes et mortes dans et sur l'échafaud de titane tricoté. Similaire au protocole indirect de coloration par fluorescence, le principe de ce protocole de coloration peut être facilement transféré à d'autres échafaudages non transparents. Ce faisant, les propriétés d'échafaudage individuels, par exemple, la taille des pores et de diffusion correspondant aussi bien que possible auto-fluorescence, réglage microscopique doivent être pris en considération car ils peuvent influer sur le temps d'incubation et le choix de fluorophores utilisé. Ici encore la fluorescence de l'outil spectral viewer en ligne peut aider à choisir les fluorophores adéquates.
En résumé, les résultats in vitro indiquent que le modèle d'implant de noyau proposé de titane tricoté a un profil biologique. fixation initiale des cellules précurseurs mésenchymateuses du stroma (SCP-1 cellules) sur ce matériau indique que le titane matéria d'implant en alliagel est biocompatible. Bien que nous n'avons pas analysé l' association de différents paramètres topographiques, modification de surface d'échafaudage pourrait améliorer l' adhérence des cellules prolifération ainsi que la différenciation 18. Une compatibilité optimale entre échafaudage et les cellules augmenter la probabilité d' une meilleure intégration de l' implant dans le tissu environnant et ainsi l' amélioration de la longévité in vivo après le traitement 19. Utilisation de la configuration de test indiqué ci-dessus ouvre la possibilité de mesurer et de visualiser des améliorations dans la performance biologique de l'échafaudage induite par des modifications de surface. La préférence des échafauds avec une surface bioactive par rapport aux conceptions d' implants non modifiés suggère une meilleure performance 20 en termes d'intégration ostéo-chondrogénique. Cette étude est encore renforcée par d' autres rapports sur l'implant en titane tricoté où ses propriétés mécaniques et bioactivité ont été rapportées 6,7.
Les auteurs déclarent qu'ils ont aucun conflit d'intérêts. Aucune partie du travail a été ou est actuellement à l'étude pour publication ou a été publiée ailleurs.
Le projet est financé en partie par Zentrales Innovationsprogramm Mittelstand (ZIM) des Bundesministeriums für Wirtschaft und Energie -KF3010902AJ4. La taxe de publication a été couvert par le traumatisme hôpital BG Tübingen, Allemagne.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
6/24/48 well plates, T25/ T75 culture flask | Greiner Bio-One GmbH | * | |
* 24 well plates | Greiner Bio-One GmbH | CELLSTAR 662 160 | |
* 48 well plates | Corning Incorporated USA | 3548 | |
* 6 well plates | Falcon | 353046 | |
* T25 | Greiner Bio-One GmbH | 690 175 | |
* T75 | Greiner Bio-One GmbH | 658 175 | |
Acetic acid, purum ≥ 99.0% | Carl Roth | 3738.4 | |
Acetone | Carl Roth | 5025.1 | |
Axioplan-2 | Carl Zeiss, Germany | ||
Biological safety cabinets | Thermo Scientific | safe 2020 | |
Calcein acetoxymethyl ester (calcein AM) | Sigma | 17783 | |
Cell Culture Incubtator | Binder, Tuttlingen, Germany | 9040-0078 | |
Filter unit (0.22 µm) | Millipore, IRL | SLGP033RS | |
Centrifuges 5810 R And 5417 R | Thermo Fisher Scientific, NY | Megafuge 40R | |
Dimethylsulfoxid (DMSO) | Carl Roth | 4720.2 | |
Dulbecco’s PBS without Ca & Mg | Sigma | H15-002 | |
Ethanol 99% | SAV liquid prod. GmBH | 475956 | |
Ethidium homodimer | Sigma | 46043 | |
EVOS Fluorescence imaging system | Life technologies | AMF4300 | |
Fetal Bovine Serum (FCS) | Gibco | 10270-106 | |
Hemocytometer | Hausser Scientific, PA, USA | ||
Hoechst 33342 | Sigma | 14533-100MG | |
Knitted titanium nucleus implant | Buck co & KG,Germany | ||
MEM Alpha Modification with Glutamine w/o nucleoside | Sigma | E15-832 | |
Omega microplate Reader | BMG Labtech,Germany | FLUOstar Omega | |
Penicillin/Streptomycin | Sigma | P11-010 | |
Resazurin sodium salt | Sigma | 199303-1G | |
Sulforhodamine B sodium salt | Sigma | S1402-1G | |
Test tube rotator | Labinco B.V.,The Netherlands | Model LD-76 | |
TRIS (hydroxymethyl) aminomethan | Carl Roth | AE15.1 | |
Triton | Carl Roth | 3051.2 | |
Trypan Blue 0.5% | Carl Roth | CN76.1 | |
Trypsin/EDTA | Sigma | L11-004 |
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