قابلية التصوير خلية على السقالات غير شفافة - استخدام مثال على رواية محبوك التيتانيوم زراعة الاسنان

هنا نقدم fluorophore أساس تقنية التصوير للكشف عن بقاء الخلية على السقالة التيتانيوم غير شفافة وكذلك للكشف عن لمحات من الشوائب سقالة. هذا البروتوكول يحل المشكلة والعيب من التصوير خلية خلية أو خلايا المعادن التفاعلات على السقالات غير شفافة.

Intervertebral disc degeneration and disc herniation is one of the major causes of lower back pain. Depletion of extracellular matrix, culminating in nucleus pulposus (NP) extrusion leads to intervertebral disc destruction. Currently available surgical treatments reduce the pain but do not restore the mechanical functionality of the spine. In order to preserve mechanical features of the spine, total disc or nucleus replacement thus became a wide interest. However, this arthroplasty era is still in an immature state, since none of the existing products have been clinically evaluated.

This study intends to test the biocompatibility of a novel nucleus implant made of knitted titanium wires. Despite all mechanical advantages, the material has its limits for conventional optical analysis as the resulting implant is non-transparent. Here we present a strategy that describes in vitro visualization, tracking and viability testing of osteochondro-progenitor cells on the scaffold. This protocol can be used to visualize the efficiency of the cleaning protocol as well as to investigate the biocompatibility of these and other non-transparent scaffolds. Furthermore, this protocol can be used to show adherence pattern of cells as well as cell viability and proliferation rates on/in the scaffold. This in vitro biocompatibility testing assay provides a propitious tool to analyze cell-material interaction in non-transparent and opaque scaffolds.

آلام الظهر المزمنة هو مرض متعدد العوامل. زاد الاهتمام في خيار العلاج مينيملي لالأمراض التنكسية القرص منذ 1950s. حتى اليوم، متعدد قطعي التحام العمود الفقري هو العلاج الأكثر استخداما على نطاق واسع. منذ ذلك الحين، هذه الطريقة غالبا ما يؤدي إلى قيود في التنقل من شريحة المتضررين ^1،2، أصبح التنقيب عن عصر تقويم مفاصل اهتمام واسع. أصبحت أوجه التقدم الكبير في مجموع استبدال القرص ونواة استبدال بديل جيد لعلاج آلام الظهر المزمنة ^1. وعلى الرغم من التقدم الهائل، فإن أيا من الوسائل التي يتم تقييمها سريريا. تمثل عملية زرع نواة أقل صرامة بديلا واعدا لمجموع استبدال القرص، شريطة أن الحلقة الليفية سليمة ^3،4. ومع ذلك، غالبا ما ترتبط يزرع نواة الموجودة حاليا في السوق مع مضاعفات مثل تغيرات في الجسم الفقري، والتفكك، وفقدان الارتفاع العمودي للقرص ورانه عدم وجود الضرورية المرتبطة صلابة الميكانيكية ^5. من أجل التغلب على العوائق الحالية، زرع نواة رواية مصنوعة من الأسلاك التيتانيوم محبوك وقد وضعت بنجاح ^6. نظرا لهيكل محبوك فريدة من نوعها، وقد أظهرت هذه السقالة وضعت حديثا الخصائص المتميزة النشاط الحيوي، على سبيل المثال، ميزة التخميد، حجم المسام، والقدرة على تحميل والموثوقية ^7. تهدف لاختبار توافق مع الحياة من هذا زرع نواة الرواية، ويصور قيودا شديدة في (البصرية) تقنيات التحليل ينسب إلى الطبيعة غير الشفافة من عملية الزرع.

من أجل اختبار توافق مع الحياة والتفاعل خلية المعادن يلعب دورا بارزا ^8-10. التفاعل بين الخلايا والسقالة ضروري لتحقيق الاستقرار، وبالتالي لدمج زرع أفضل داخل النظام المضيف. ومع ذلك، زيادة عمق نشوب قد يغير الخواص الميكانيكية للسقالة. تهدف إلى التحرياتtigate ما إذا كان سطح سقالة يوفر قاعدة لمرفق الخلية، وانتشار والتمايز أو ما إذا كان المعدن يؤثر بقاء الخلية، فمن المهم لاستكشاف المشكلة المشتركة المعروفة من تصوير الخلايا على / في السقالات غير شفافة وغير شفافة. ومن أجل التغلب على هذا القيد العديد من الفلورسنت واستكشاف التقنيات التي تعتمد. وتوفر شركات مجموعة كبيرة من fluorophores لتصور الخلايا الحية، المقصورات الخلوية، أو حتى الدول الخلوية محددة ^11. وقد تم اختيار Fluorophores لهذه التجربة مع مساعدة من أداة المشاهد الطيفي عبر الإنترنت وذلك لتناسب قصارى جهدنا المجهر الفلورسنت.

الاستراتيجية التي وضعت لتحليل سلوك خلايا ملتصقة على / في غير شفافة سقالة التيتانيوم محبوك تشمل ما يلي: 1) فلوري (الأخضر بروتين فلوري / GFP) وسم الخلايا osteochondro-السلف للسماح تتبع الخلايا على سقالة، 2) قياس جدوى (ميتوالنشاط chondrial) من الخلايا، و 3) تصور خلية خلية والتفاعلات خلية المادية داخل سقالة. الإجراء لديه ميزة أنه يمكن نقلها بسهولة إلى الخلايا الملتصقة الأخرى وغيرها من غير شفافة أو غير شفافة سقالة. وعلاوة على ذلك، يمكن رصد سلامة ونمط نشوب على مدى عدة أيام، وبالتالي فإنه يمكن استخدامها مع كميات محدودة من المواد سقالة أو الخلايا.

توضح هذه الدراسة أن الاستخدام الناجح للبروتوكول الحالي لدينا لقياس بقاء الخلية وتصور نمط في نمو الخلايا osteochondro-السلف على / في غير شفافة سقالة التيتانيوم محبوك. وعلاوة على ذلك، يمكن أن تستخدم البروتوكولات وضعت من أجل تحديد الشوائب سقالة وللتحقق بروتوكولات التنظيف.

واستخدمت مخلد الوسيطة الإنسان خلايا انسجة السلائف (SCP-1 خلايا) للتجارب: ملاحظة. وقدمت SCP-1 الخلايا عن طريق البروفيسور ماتياس Schieker ^12.

1. توسيع SCP-1 خلايا

1. قبل العمل مع الخلايا SCP-1، صحيح تنظيف منطقة العمل (المعين السلامة الأحيائية مجلس الوزراء I) مع قفازات 70٪ من الإيثانول (ت / ت) يرتدي.
2. في مجلس الوزراء تنظيف السلامة الأحيائية إعداد حجم مناسب من مستنبت الخلية عن طريق خلط المكونات المطلوبة كما هو مبين في الجدول رقم 1. ومن أجل الحفاظ على عقم المتوسطة القاعدية، إضافة المكملات الغذائية التي تمر عبر مرشحات العقيمة مع حجم المسام 0.22 ميكرون.
   1. لمنع التلوث، وإعداد المتوسطة لا يقل عن 24 ساعة قبل الاستخدام. من أجل اختبار العقم لها، واحتضان 1 مل المتوسطة في لوحة الثقافة الخلية دون الخلايا في حاضنة الثقافة الخلية القياسية: 37 درجة مئوية، و 5٪ CO _2، 20٪ O ₂ و 90٪ الرطوبة. بعد24 ساعة، وتحقق المتوسطة المجهر باستخدام التكبير 200X على الأقل.
3. الحفاظ على SCP-1 الخلايا في حاضنة الثقافة الخلية القياسية مع حالة داعمة: 37 درجة مئوية، و 5٪ CO _2، 20٪ O ₂ و 90٪ الرطوبة.
4. لصيانة وتوسيع، وتنمو الخلايا SCP-1 حتى تصل إلى 80-90٪ confluency. وخلال هذه الفترة الزمنية الثقافة، تغيير المتوسطة كل 2-3 أيام. عند الوصول إلى 80-90٪ confluency، وتقسيم SCP-1 الخلايا (بشكل عام بنسبة 1: 2) لمرور المقبل للتوسع أو لوحة للتجارب (كما هو مبين).
5. لتقسيم الخلايا SCP-1، تدفئة مستنبت عند 37 درجة مئوية، وذوبان الجليد التربسين / EDTA باستخدام حمام مائي عند 37 درجة مئوية.
6. تماما نضح مستنبت من خلايا متكدسة 80-90٪ وتخلص منه في حاوية النفايات.
7. غسل الخلايا مرتين على الأقل مع DPBS (الفوسفات Dulbecco ومخزنة المالحة دون المغنيسيوم والكالسيوم، ودرجة الحموضة 7.2).
   1. ماصة حجم مناسب للDPBS على الخلايا (5 مل DPBS لقارورة ثقافة T75 و 12 مل قارورة الثقافة T175).
   2. نضح DPBS بعناية وتخلص منه في حاوية النفايات.
8. ماصة حجم مناسب من 0.25٪ التربسين / EDTA على الخلايا (1 مل DPBS لقارورة ثقافة T75 و 2 مل قارورة الثقافة T175)، واحتضان لمدة 5-10 دقيقة عند 37 درجة مئوية في حاضنة الثقافة الخلية القياسية مع 5 ٪ CO _2، 20٪ O ₂ و 90٪ الرطوبة.
9. إزاحة الخلايا عن طريق التنصت على السفن وضمان فصل كل الخلايا من البلاستيك الثقافة (trypsinization) من خلال مراقبة الخلايا العائمة تحت المجهر.
10. تعطيل رد الفعل التربسين بإضافة 10 مل من مستنبت. مزيج التربسين والخلايا مع المتوسط ​​بعناية من قبل pipetting المتكررة.
11. نقل تعليق الخلية في أنبوب رد فعل وأجهزة الطرد المركزي في 600 x ج لمدة 10 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
12. نضح في وطاف resuspend الكرية خلية في 10 مل ثقافةمتوسط.
13. عدد الخلايا عن طريق التريبان الأزرق أسلوب الإقصاء كما هو موضح في بروتوكول 2.
14. البذور الخلايا اعتمادا على التصميم التجريبي.

2. العد من SCP-1 خلايا

1. إجراء تعداد خلايا قابلة للحياة (التريبان الأزرق طريقة الاستبعاد) من الخلايا معلق باستخدام عدادة الكريات.
2. قبل خلايا، وتنظيف عدادة الكريات باستخدام ماء الصنبور. تجفيف مكونات عدادة الكريات باستخدام الأنسجة خالية من الوبر. تجميع من قبل تبليل الغطاء الزجاجي والضغط عليه عكسيا على المتسابقين الزجاج اثنين على كل جانب من منطقة الفرز. تأكد من أن ينظر إلى حلقات نيوتن على المتسابقين الزجاج (الشكل 1).
3. يستغرق 10 ميكرولتر من الخلايا معلق وتخلط مع 10 ميكرولتر من 0.1٪ حل التريبان الأزرق للحصول على عامل التخفيف من 2.
4. تحميل 10 ميكرولتر من العينة الكلية على غرفة عدادة الكريات قبل تنظيفها وتجميعها.
5. حساب عدد الحية (أبيض / خلايا شفافة) والأموات(نواة الأزرق) الخلايا على الساحات 4X4 (انظر الشكل 1B).
6. حساب العدد الكلي للخلايا بعد صيغة معينة:
   

3. GFP ترنسفكأيشن من SCP-1 خلايا

ملاحظة: من أجل مراقبة نمو الخلايا SCP-1 على وفي سقالة التيتانيوم محبوك على مدى ثقافة معينة، احتفلنا الخلايا مع البروتين الفلوري الأخضر (GFP). ويتحقق overexpression من GFP عن طريق العدوى مع جزيئات اتش الترميز لGFP. تم استخدام غير كفء النسخ المتماثل (-E1 / -E3) الجسيمات اتش الترميز للبروتين الفلورية الخضراء (GFP) لتصيب SCP-1 الخلايا. وقد تم الحصول على جزيئات الفيروس من البروفيسور ستيفن دولي ¹³ عن طريق جمع طاف ثقافة اتش المؤتلف (Ad5-GFP) خلايا HEK293T transfected (مختبر السلامة الأحيائية الثاني). ثلاثة تجميد المتكرر (-80 درجة مئوية)، وذوبان الجليد (37 درجة مئوية في حمام مائي) ضمنت الدورات التي لا سعادةتبقى خلايا K293T قابلة للتطبيق لإنتاج جزيئات الفيروس الجديدة. استخدام هذا المخزون البذور اتش يمكن أن تصيب كفاءة الخلايا SCP-1 بدون إنتاج جزيئات الفيروس الجديدة. وهكذا، فإن الخلايا المصابة يمكن التعامل معها في السلامة الأحيائية مختبر أولا

1. resuspend الخلايا المستهدفة (SCP-1 خلايا) مع كثافة البذر من 50000 خلية / مل في مستنبت. ماصة 2 مل لكل بئر في 6 جيدا وحة زراعة الأنسجة.
2. احتضان عند 37 درجة مئوية في حاضنة الثقافة الخلية القياسية. 5٪ CO _2، 20٪ O ₂ و 90٪ الرطوبة، حتى SCP-1 خلايا التوصل إلى confluency 70-80٪.
   ملاحظة: Confluency يعتمد على كثافة البذر من الخلايا. لالشروط المذكورة أعلاه، SCP-1 خلايا تصل إلى confluency 70-80٪ في 1،5-2 أيام.
3. في confluency 70-80٪، دون الشفط مستنبت إضافة 100 ميكرولتر من مخزون البذور اتش لكل 1 مل من مستنبت.
   1. تحديد نطاق تركيز اعتمادا على حدة على كمية من جزيئات الفيروس في كل فيروس حد ذاتهاإعداد الأوراق المالية أد. في حالة كفاءة الإصابة منخفضة جدا، تنقية وتركيز جزيئات الفيروس باستخدام مختلف مجموعات المتاحة تجاريا.
4. احتضان لمدة ساعة في حاضنة الثقافة الخلية القياسية عند 37 درجة مئوية (5٪ CO _2، 20٪ O ₂ و 90٪ الرطوبة).
5. إزالة مستنبت التي تحتوي على مخزون البذور فيروس وجمع للتخلص منها. إضافة مستنبت الطازجة 2 مل لكل بئر من لوحة 6 جيدا ثقافة لتجديد.
   1. تأكد من أن قبل التخلص منها، وتعقيمها جسيمات الفيروس تحتوي على المتوسط.
6. تقييم التعبير GFP الخلايا (الكفاءة العدوى) 24 ساعة بعد الإصابة باستخدام المجهر مضان مع GFP ادى مكعب / تصفية مجموعة.
   1. مراقبة مورفولوجيا الخلايا (الشكل 2). خلايا فصل من البلاستيك الثقافة يمكن أن تعطي نتائج إيجابية كاذبة.

4. تنظيف محبوك التيتانيوم السقالات

1. Pالدانتيل يصل إلى 5 السقالات في أنبوب رد فعل 50 مل.
2. غسل سقالة (6-7 مم سمك) ثلاث مرات مع 30 مل من الماء المقطر، منزوع الأيونات لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة، وذلك باستخدام الظروف الدوار (8 x ج).
3. استبدال الماء المقطر، منزوع الأيونات مع 30 مل 1٪ (ث / ت) تريتون-X-100 حل (المذاب في الماء المقطر، منزوع الأيونات) ثم يغسل السقالات مرة واحدة لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة، وذلك باستخدام الظروف الدوار (8 x ج) .
4. تجاهل الحل تريتون-X-100 تليها الغسيل مع 30 مل من الماء المقطر، منزوع الأيونات مرتين (5 دقائق كل في درجة حرارة الغرفة) الحفاظ على ظروف الدوار (8 x ج).
5. استبدال الماء المقطر، منزوع الأيونات. شطف بالتتابع السقالات مع كاشف درجة 99٪ الأسيتون، و 99٪ الأيزوبروبانول و 99٪ من الإيثانول (30 مل لكل منهما) لمدة 2 × 5 دقائق لكل منهما في حمام بالموجات فوق الصوتية (~ 50 هرتز، 50 ث، 220-240 V).
6. يغسل مرة أخرى ثلاث مرات مع 30 مل من الماء المقطر، منزوع الأيونات لمدة 5 دقائق، والحفاظ على الموجات فوق الصوتية ثابت العلاج حمام.
7. وضع scaffoلدس على الأنسجة خالية من الوبر من أجل جوية ليلية جاف في درجة حرارة الغرفة.
8. الأوتوكلاف سقالة لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة 121 مئوية مع 15 رطل.
9. تأكيد بروتوكول التنظيف بواسطة مضان غير مباشر كما هو موضح في بروتوكول 5.

5. الهياكل التصوير سقالة بواسطة الإسفار غير المباشر

ملاحظة: يصف البروتوكول التصوير هياكل سقالة من قبل مضان غير مباشر باستخدام fluorophore sulforhodamine B الذي يعطي مضان أحمر في الطول الموجي السابق / م من 565/586 نانومتر. ومع ذلك، يمكن تغيير fluorophore إلى أكثر ملاءمة لإعدادات المجهر معين أو من الممكن لصناعة السيارات في مضان من السقالة.

1. إعداد الحل sulforhodamine ب تلطيخ (0.04٪) في حامض الخليك 1٪ وتخزينها في درجة حرارة الغرفة مع الحماية من الضوء.
2. خذ 24-جيدا لوحة زراعة الأنسجة وتزج السقالة تنظيفها في 500 ميكرولتر من الحل تلطيخ sulforhodamine B عن طريق وضعها اعتصاماتبيئة تطوير متكاملة ملقط جيدا باستخدام.
3. التقاط الصور السلبية عن سقالة باستخدام المجهر مضان.
   1. التقاط صور مع طلب تقديم العروض ادى مكعب / تصفية مجموعة مع الطول الموجي الإثارة من 531/40 نانومتر والطول الموجي انبعاث 593/40 نانومتر. بدلا من ذلك اختيار المناسب الإثارة وانبعاث الطول الموجي مع مساعدة من مضان الطيفية المشاهد ^20. Sulforhodamine B لديها ذروة الإثارة له عند 578 نانومتر، وذروة الانبعاثات في 593 نانومتر.
   2. من أجل تصور هيكل سقالة، والتقاط الصور في تكبير السفلى، على سبيل المثال، 4X أو 10X (الشكل 3). باستخدام هذه الصور، وتحديد الخصائص، على سبيل المثال، حجم المسام وشكل مع مساعدة من يماغيج.
   3. من أجل الكشف عن الشوائب سقالة، والتقاط الصور في أعلى تكبير، على سبيل المثال، 20X أو 40X، معتبرا أن هذا سيحد من عمق التحليل. تأكد من أن التراب لا ينظر الجسيمات / المواد (انظر النتائج التمثيلية؛ الشكللدى عودتهم 3).

6. في المختبر توافق مع الحياة الفحص

1. قبل تدفئة مستنبت عند 37 درجة مئوية في حمام مائي.
2. خذ 24-جيدا لوحة زراعة الأنسجة وباستخدام ملقط، ضع السقالات تنظيفها وتعقيمها في كل اختبار البئر جو معقم و مطهر. العمل في ظل مجلس الوزراء للسلامة الأحيائية قبل تنظيفها-I!
3. نقع / احتضان السقالات مع مستنبت لمدة 15 دقيقة (500 ميكرولتر لكل بئر من 24 لوحة جيدا زراعة الأنسجة)، من أجل إزالة الهواء من داخل سقالة.
4. وفي الوقت نفسه، و resuspend 500000 الخلايا المصابة SCP1 الإعلان، GFP في 1 مل من مستنبت.
5. بعد 15 دقيقة من تمرغ سقالة، نضح في والمتوسطة تماما عن سقالة.
6. لبذر الخلايا على سقالة، الاستغناء عن 100 ميكرولتر من تعليق خلية بعناية على منصة الاعدام (التي يتم وضعها في لوحة 24-جيدا) السطح. الحفاظ على حد أدنى لحجم تعليق خلية في حين بذر الخلايا، وذلك لضمان تدفق لا المتوسطة سالتحرير من منصة الاعدام.
7. احتضان الخلايا لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية في حاضنة الثقافة الخلية القياسية (5٪ CO _2، 20٪ O ₂ و 90٪ الرطوبة).
8. إضافة 500 ميكرولتر المزيد من مستنبت واحتضان لمدة 24 ساعة في حاضنة الثقافة الخلية القياسية (37 درجة مئوية، و 5٪ CO _2، 20٪ O ₂ و 90٪ الرطوبة).
9. تقييم نمط الالتزام خلية وخلية نشر على سطح سقالة باستخدام مجهر مضان.
   1. التقاط صور مع GFP ادى مكعب / تصفية مجموعة مع الطول الموجي الإثارة من 470/22 نانومتر والطول الموجي انبعاث 510/42 نانومتر. بدلا من اختيار الإثارة الكافية والطول الموجي الانبعاثات مع مساعدة من المشاهد الطيفي مضان. GFP ديه ذروة الإثارة له عند 488 نانومتر، وذروة الانبعاثات في 507 نانومتر.
   2. من أجل رؤية التزام خلية التقاط الصور نمط في تكبير السفلى، على سبيل المثال، 4X أو 10X (الشكل 4). من أجل مراقبة خلية نشر ماج العاليوهناك حاجة nification (100X على الأقل) - الحد من عمق التركيز.
10. لمزيد من تقييم خلية نشر على سطح سقالة، إصلاح الخلايا مع 4٪ فورمالين والمضي قدما في تلطيخ التقليدية مضان من الهياكل الخلوية، على سبيل المثال، خيوط الأكتين (Phalloidin). ومع ذلك، والتكيف مع حضانة مرات ووضع العلامات الفلورية من الأجسام المضادة وذلك لتناسب خصائص سقالة الفردية، على سبيل المثال، وأوقات نشر أو لصناعة السيارات في مضان ^14.
11. في اليوم التالي، وتغيير مستنبت لإزالة الخلايا غير ملتصقة.
12. حساب النسبة المئوية للخلايا ملتصقة على منصة الاعدام من قبل ريسازورين قياس التحويل كما هو موضح في بروتوكول 7.

الرقم 5: الجدول الزمني للفي الفحص المختبري (A) الإعداد التجريبية لخلايا الطلاء. (ب ) رسم توضيحي الداخلي، مشددا على أهمية البروتوكول بداية والتحقق من صحة وظائف الخلية حتى يوم 7. يرجى النقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

قياس 7. ريسازورين التحويل

ملاحظة: يستخدم ريسازورين تحويل فحص لقياس النشاط الميتوكوندريا، وبالتالي غير مباشرة تكاثر الخلايا. تخفيض ريسازورين إلى resorufin يولد إشارة الفلورسنت، والتي تقوم على النشاط الميتوكوندريا المرتبطة أعداد الخلايا قابلة للحياة (7A الشكل).

1. تماما نضح مستنبت من خلايا SCP-1 وتخلص منه في حاوية النفايات.
2. غسل الخلايا SCP-1 مرة واحدة مع DPBS لإزالة خلايا منفصلة. إضافة 500 DPBS ميكرولتر لكل بئر من 24 لوحة جيدا زراعة الأنسجة التي تحتوي على SCP-1 الخلايا على منصة الاعدام.
3. تغطية الخلايا مع صباحا المطلوبةount من حل ريسازورين العمل معقم (0.25٪ ريسازورين في مستنبت) واحتضان عند 37 درجة مئوية في حاضنة الثقافة الخلية القياسية (5٪ CO _2، 20٪ O ₂ و 90٪ رطوبة) لمدة 30 دقيقة.
   1. تقديم مذكرة بذلك؛ فترة حضانة يعتمد على نوع من الخلايا وكثافة الخلايا. ويمكن أن تختلف بين 10 دقيقة و 6 ساعة. الأمثل فترة حضانة لSCP-1 الخلايا هو 30 دقيقة.
4. كعنصر تحكم خلفية، تتضمن واحدة على الأقل بشكل جيد مع الحل العمل ريسازورين ولكن من دون الخلايا، التي حضنت عند 37 درجة مئوية في حاضنة الثقافة الخلية القياسية (5٪ CO _2، 20٪ O ₂ و 90٪ رطوبة) لنفسه مقدار الوقت.
5. نقل 100 ميكرولتر واشترطت طاف من كل بئر من لوحة زراعة الأنسجة 24-جيدا في لوحة 96-microwell.
6. غسل الخلايا المتبقية ثلاث مرات مع 1 مل DPBS لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة من أجل إزالة حل العمل ريسازورين المتبقية. بعد غسل الثالث إضافة مستنبت رس يزرع مع SCP-1 الخلايا (500 ميكرولتر لكل بئر من 24-جيدا لوحة زراعة الأنسجة) وتستمر الحضانة عند 37 درجة مئوية في حاضنة الثقافة الخلية القياسية (5٪ CO _2، 20٪ O ₂ و 90٪ رطوبة) لمزيد من القياسات دوام.
   1. تأكد من تعيين ما يصل مكررات في هذه الخطوة (2-4) من أجل تقليل الأخطاء pipetting ل.
7. في غضون ذلك، وضع لوحة 96-microwell في قارئ صفيحة وقياس مضان من resorufin تشكيلها.
   1. من أجل الحد من إشارة الخلفية، وقياس مضان في الطول الموجي الإثارة من 545 نانومتر، والطول الموجي الانبعاثات من 585 نانومتر.
   2. بدلا من اختيار الإثارة الكافية والطول الموجي الانبعاثات مع مساعدة من المشاهد الطيفي مضان. Resorufin ديه ذروة الإثارة له عند 572 نانومتر، وذروة الانبعاثات في 585 نانومتر. قوة إشارة معينة هو في المتوسط ​​25 القراءات الفردية (25 مضات لكل بئر).
8. قياس فلورescence من resorufin شكلت في المتوسط ​​مشروط، وذلك باستخدام البصرية السفلي.
   1. تقديم مذكرة ذلك، يعتمد الربح الناتج عن متوسط ​​كمية ريسازورين تحويل ويمكن أن تتفاوت بين 10 و 4000. ضبط مكاسب للقارئ صفيحة الفردية المستخدمة من قبل pipetting منحنى القياسية resorufin، بحيث إشارة الفلورسنت هي أقل من 80٪ من الحد الأقصى لكثافة إشارة كشف (في هذه الحالة 20000). الربح الأمثل لSCP-1 الخلايا 800.
9. طرح إشارة الخلفية (ريسازورين حل العمل بدون خلايا) من إشارة من عينات الاختبار.
10. اعتمادا على الإعداد التجريبية / الغرض، المضي قدما في اتخاذ مزيد من الخطوات:
11. حساب النسبة المئوية للبقاء الخلايا على سقالة باستخدام منحنى القياسية. جعل منحنى القياسية على حدة لكل خط الخلية المستخدمة.
12. تحليل نمو الخلايا / انتشار عن طريق تقدير الزيادة النسبية في تحويل ريسازورين طوال الوقت زراعة. لهذا الحساب، تعيينتحويل ريسازورين يوم 1 كمرجع. حديثا تحضير محلول العمل ريسازورين لهذا النوع من التحليل. وعلاوة على ذلك، حضانة مرات يجب أن تكون على قدم المساواة بين القياسات المختلفة.
13. كرر بروتوكول كامل القياس تحويل ريسازورين ثلاث مرات على الأقل للحصول على نتائج متسقة.

8. تلطيخ لايف-ميت

1. لوحة الخلايا SCP1 على سقالة مع كثافة البذر من 50000 خلية / سقالة والسماح لها أن تنمو على منصة الاعدام الحفاظ على الظروف والثقافة الخلية القياسية (يرجى الرجوع إلى بروتوكول 1 و 2).
2. بعد 24-48 ساعة نضح تماما مستنبت من خلايا SCP-1 وتخلص منه في حاوية النفايات.
3. غسل الخلايا SCP-1 مرة واحدة مع DPBS لإزالة خلايا منفصلة. إضافة 500 ميكرولتر DPBS لكل بئر من لوحة زراعة الأنسجة 24-جيدا واحتضان لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
4. وصمة عار SCP-1 باستخدام fluorophores (جميع البقع الثلاث في نفس الوقت):
   1. من الان فصاعداالحفاظ على السقالات في الظلام من أجل حماية تبيض fluorophores من ضوء النهار!
   2. تعيين وقت الحضانة لمدة 30 دقيقة من أجل السماح للتوزيع متساو في جميع أنحاء سقالة. إذا نقل إلى السقالات أخرى، احرص على تحسين الأوقات الحضانة لتتناسب مع خصائص سقالة الفردية (حجم المسام، وعمق سقالة، وما إلى ذلك).
   3. من أجل الكشف عن خلايا قابلة للحياة على منصة الاعدام، وصمة عار على الخلايا مع calcein AM بتركيز نهائي من 2 ميكرومتر (في مستنبت).
   4. من أجل كشف جميع الخلايا على منصة الاعدام، وصمة عار على الخلايا مع هويشت 33342 بتركيز نهائي من 0.002 ميكروغرام / ميكرولتر (في مستنبت).
   5. من أجل الكشف عن الخلايا الميتة، واحتضان السقالة مع homodimer إيثيديوم بتركيز نهائي من 4 ميكرومتر (في مستنبت).
5. بعد فترة حضانة، وغسل الخلايا 3 مرات مع DPBS (1 مل لكل بئر) لكل 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
6. تتخذ على الفور الصورةالصورة باستخدام المجهر مضان.
   1. التقاط صور للcalcein (الخلايا الحية) مع GFP ادى مكعب / تصفية مجموعة (الإثارة وانبعاث الطول الموجي لل470/22 نانومتر و 510/42 نانومتر، على التوالي). بدلا من اختيار الإثارة الكافية والطول الموجي الانبعاثات مع مساعدة من المشاهد الطيفي مضان. Calcein ديه ذروة الإثارة له عند 488 نانومتر، والانبعاثات ذروتها في 507 نانومتر. ملاحظة: تأكد من عدم استخدام GFP خلايا transfected لتلطيخ مضان مع Calcein أو غيرها من البقع الفلورسنت الخضراء.
   2. التقاط صور للهويشت 33342 مع دابي LED مكعب / تصفية مجموعة مع الطول الموجي الإثارة من 357/44 نانومتر والطول الموجي انبعاث 447/60 نانومتر. بدلا من اختيار الإثارة الكافية والطول الموجي الانبعاثات مع مساعدة من المشاهد الطيفي مضان. هويشت 33342 لديها ذروة الإثارة له عند 347 نانومتر، وذروة الانبعاثات في 483 نانومتر.
   3. التقاط صور للhomodimer إيثيديوم مع طلب تقديم العروض ادى مكعب / مجموعة فلتر (الإثارة والطول الموجي الانبعاثات سو 531/40 نانومتر و 593/40 نانومتر، على التوالي). بدلا من اختيار الإثارة الكافية والطول الموجي الانبعاثات مع مساعدة من المشاهد الطيفي مضان. إيثيديوم homodimer ديه ذروة الإثارة له عند 530 نانومتر، وذروة الانبعاثات في 618 نانومتر.

وأظهرت النتائج الأولية أن نواة زرع رواية وصفها ليس فقط لديها ميزات التخميد جيدة ولكن أيضا هو حيويا مع SCP-1 الخلايا. أثناء عملية الإنتاج من الزرع، ويأتي في اتصال مع المواد قوية للتآكل والسامة (مواد التشحيم، لاذع، حل تلميع الكهربائية). مع مساعدة من تقنيات تلطيخ الفلورسنت غير المباشرة كنا قادرين على تصور الشوائب المتبقية وبالتالي تحسين بروتوكول التنظيف تظهر انخفاض كبير في حمولة مادة على منصة الاعدام. ويبين الشكل 3 كفاءة بروتوكول التنظيف المعمول بها.

نجاح عملية زرع يستخدم لعلاج المفاصل يتم تحديدها من قبل الأحداث التي تجري في واجهة خلايا المادية. ويبين الشكل 4 خلايا تعلق على منصة الاعدام بعد 24 ساعة من الطلاء، كما هو موضح في قسم البروتوكول 6. أهمية العابرةوقد لوحظ كفاءة الخمج (العدوى) من SCP-1 خلايا ما نستطيع صورة نمط نمو الخلايا اللحمية السلائف الوسيطة على منصة الاعدام (راجع الشكل 2). رؤية مباشرة يؤكد توافق مع الحياة من السقالة وأيضا يصور نمط الالتزام على سطح سقالة (الشكل 4). مضان تلطيخ يمكن القيام به آخر لدراسة تفاعل الخلايا مع ونشر على سطح سقالة.

طبقت Fluorophores بنجاح من أجل دراسة موت الخلايا وانتشار على مدى فترة من الزمن على منصة الاعدام. الصور الحية ميتة تلطيخ مثالا كيف يمكن بنجاح أن يتم تلطيخ على منصة الاعدام لتأكيد جدوى في المئة من خلايا على مدى فترة من الزمن. ويبين الشكل 6 تلطيخ النووي الأزرق (هويشت 3342) في جميع الخلايا والأحمر fluorescently المسمى (إيثيديوم homodimer) الخلايا الميتة، ووضع العلامات الخضراء لإدماج calcein-AM كما أماه الجدوىrker. يتم تحويل Calcein صباحا إلى calcein الذي يسلك مضان أخضر لامع في وجود أيونات الكالسيوم في سيتوبلازم الخلايا. هويشت 33342 غير قابلة للاختراق جدار الخلية وintercalates في الحمض النووي الخلوي. بهذه الطريقة كل الخلايا سوف تظهر نوى الزرقاء (راجع الشكل 6). إيثيديوم homodimer ليست قابلة للاختراق جدار الخلية، وبالتالي فإنه لن يؤدي إلا يقحم في الحمض النووي من الخلايا الميتة. بهذه الطريقة، سوف الخلايا الميتة تظهر نواة الحمراء. وعلاوة على ذلك، كان كميا بقاء الخلية وأضعاف الزيادة في عدد الخلايا على سقالة أكثر من أسبوع قبل ريسازورين فحص التحويل ويمثل بيانيا (الشكل 7).

الشكل 1: عد الخلايا مع عدادة الكريات (A) الإعداد للجمعية الغرفة. (ب) رسم توضيحي لغرف الفرز. يستخدم 4 × 4 غرفة الفرز لفصول التوجيه الجامعي خليةالإقليم الشمالي. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 2: GFP كفاءة ترنسفكأيشن خلايا SCP1 تظهر مضان أخضر قوي يشير إلى إيجابية لتحقيق الكفاءة ترنسفكأيشن من الاعلانات GFP-. شريط مقياس = 1000 ميكرون، 4X التكبير. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل (3): Sulforhodamine ب تلطيخ التقاط الصور السلبية (A) سقالة قبل التنظيف. السهم يشير إلى وجود مواد سامة / تآكل على سقالة. (ب) سقالة بعد بروتوكول التنظيف. شريط مقياس = 1000 ميكرون، 4X التكبير. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الرقم 4: نمط الالتزام الخلايا SCP1 على سقالة إشارة GFP يشير الالتزام الخلية ونمط النمو على سطح سقالة التيتانيوم محبوك. شريط مقياس = 1000 ميكرون، 4X التكبير. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 6: تلطيخ المشارك مضان من الخلايا على سقالة (. أ) تلطيخ النووي هويشت (الأزرق) و (ب) Calcein-AM تلطيخ حشوية (الخضراء). (C) سهم يشير إلى وجود خلية ميتة بسبب الإقبال على إيثيديوم homodimer-1 وصمة عار (الحمراء). (D) يظهر الصورة المدمجة. شريط مقياس = 1000 ميكرون، 4X التكبير. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الرقم 7: ريسازورين تحويل فحص (أ) اختزال البيوكيميائية من صبغ الأكسدة (ريسازورين) إلى المنتج النهائي (resorufin) التي تنبعث مضان ويخضع لتغيرات اللونية. (ب) وقد تم قياس النشاط الميتوكوندريا عندما كانت مطلية الخلايا على 0.75 ملغ / سم مكعب الكثافة سقالة. وقد تم جمع البيانات باستخدام فلوريداuorescence أداة قياس مقرها. ويصور كثافة مضان في 590 نانومتر (المحور الصادي) في نقطة زمنية محددة (محور س) نتيجة لكمية قياس بقاء الخلية (خر = 540 نانومتر، م = 590 نانومتر). تم تحديد الدلالة الإحصائية باستخدام الطريقة الثانية أنوفا والخطأ المعياري للمتوسط ​​(SEM) وكما هو مبين على أشرطة الخطأ. وبالنظر إلى الخصائص الفيزيائية سقالة، على سبيل المثال، حجم المسام والخواص الميكانيكية (على سبيل المثال، التخميد الميزة) معا، وقد استخدم 0.75 ملغم / سم مكعب الكثافة سقالة لتوصيف توافق مع الحياة. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الجدول 1: خلية ثقافة تكوين (αMEM) وسائل الإعلام.

الجدول 2: جدول موجز: استكشاف الأخطاء وإصلاحها التصوير بقاء الخلية على السقالة غير شفافة.

سطح سقالة يلعب دورا هاما في تفاعلها مع الأنسجة المحيطة في الجسم الحي وبالتالي تحديد يزرع المتانة وظيفية. وهكذا، فإن دراسة التوافق الحيوي للسقالة من فحوصات في المختبر باستخدام خلايا (SCP1 خط الخلية)، عندما مطلي على السقالات.

تقنيات الفحص المجهري أن تعمل بشكل جيد مع السقالات رقيقة وشفافة بصريا تناسب سيئة للالسقالات غير شفافة لدراسة توافق مع الحياة. هذا هو السبب الرئيسي السقالات غير شفافة تمنع الضوء من اختراق دون تحريف كبير ^15. للتغلب على هذه المشاكل جزئيا نقرر طيه طريقة لتقييم خلية على / في السقالات التيتانيوم جعل محبوك باستخدام fluorophores المختلفة.

من أجل تمكين الحياكة تليها للطي من أسلاك التيتانيوم، والمواد تأتي في اتصال مع المواد المسببة للتآكل والسامة قوية (زيوت التشحيم، لاذع، والكهربائية-polishing الحل)، والتي قد تغير من توافق مع الحياة من السقالة إذا بقيت آثار في / على منصة الاعدام. مع مساعدة من بروتوكول مضان غير المباشرة المتقدمة (بروتوكول 5) ونحن يمكن تصور هيكل السقالة. وعلاوة على ذلك، وخصائص سقالة، على سبيل المثال، سمك المواد، وحجم الفردية المسام والشكل، أو كثافة الضام حللت، وذلك باستخدام يماغيج. وepifluorescence أعلى مضاعف سمحت صورة مجهرية تصور الشوائب في السقالة وكذلك على سطح سقالة الشكل 3B بالتالي يمثل مؤكد نتيجة لبروتوكول التنظيف وضعت بنجاح. مبدأ هذا البروتوكول تلطيخ غير المباشرة يمكن أن تتكرر بسهولة إلى السقالات أخرى غير شفافة، مع الأخذ بعين الاعتبار الخصائص سقالة الفردية، على سبيل المثال، حجم المسام والمقابلة نشر مما يؤثر على فترة حضانة. أيضا، لصناعة السيارات في مضان من إعدادات سقالة والمجهرية يؤثر على اختيار فلوريداuorophores المستخدمة. على الانترنت أداة مضان الطيفية المشاهد يمكن أن تساعد على اختيار fluorophores كافية.

وقد تم فحص التفاعل خلية المعادن بشكل غير مباشر من خلال تحليل نمط التزام الخلايا على منصة الاعدام. يصف بروتوكول 6 منهجية كيف يمكن رصد الخلايا في المختبر إذا مطلي على السقالات غير شفافة في نظم الاستزراع باستخدام استراتيجية GFP ترنسفكأيشن. وبناء على النتائج الأولية للفحوصات في المختبر، وقد توقعت أن خصائص سطح مثل تكوين والتضاريس الصغيرة وخشونة ¹⁶ قد تلعب دورا هاما في إنشاء الالتزام وانتشار الخلايا المستهدفة. التيتانيوم كونه مادة بيولوجية وبالتالي يمكن أن تعمل كقالب الركيزة لتوفير قاعدة لمرفق الخلية (راجع الشكل 4).

تم الإبلاغ عن تضاريس سطح زرع للتأثير على سلوك الخلية ^16. في هذه الدراسة، قمنا بتحليل نمو الخلايا /نشر والجدوى باستخدام تقنيات مضان تلطيخ بالاشتراك مع القياسات الحيوية الكمية. وكشف تحليل التباين خفية في بقاء الخلية في المئة ونشر اعتمادا على المواد سقالة. ومع ذلك، وظائف الخلية تقييمها كميا بواسطة ريسازورين فحص التحويل (النشاط الميتوكوندريا)، لم تتأثر بشكل كبير من المواد سقالة. قياس النشاط الميتوكوندريا التي كتبها ريسازورين تحويل لديه ميزة أنه ليس الخلايا السامة، وبالتالي لا يمكن أن يؤديها بشكل متكرر على مدى فترة طويلة الثقافة. عناية خاصة لابد من اتخاذها عند غسله حل العمل ريسازورين المتبقية، وذلك لعدم تراكم إشارة الخلفية (نتائج ايجابية كاذبة). وعلى الرغم من هذه المزايا، فإن الفحص تحويل ريسازورين لا تعطي أي معلومات عن خلية نشر على منصة الاعدام. وبالتالي يمكن تتبع الخلايا GFP المصابين خلال فترة طويلة ثقافة (بقيت إشارة GFP مستمرة لأكثر من 14 يوما)، وبالتالي تمكين لتصور الصورةنمط النمو pecific على سطح سقالة. التصور الخلايا أعمق في سقالة لا تزال محدودة من المواد سقالة وبالتالي سوف يتطلب تشريح للزرع. الجمع بين هذه التقنيات اثنين من لديه ميزة كبيرة أنه يمكن نقلها بسهولة إلى أنواع أخرى من الخلايا، بالنظر إلى أن فترة حضانة قد تضطر إلى أن تتكيف مع نوع من الخلايا في المصالح. ومع ذلك، والرعاية يجب أن يؤخذ عند نقل هذه الطريقة لالسقالات غير الشفافة الأخرى، على سبيل المثال، والكولاجين مقرها السقالات التي تظهر عادة قوية الأخضر لصناعة السيارات في مضان ^17. في هذه الحالة يمكن استخدام العلامات الفلورية الأخرى. وبالتالي فإن مزيج من أعلاه طريقتين ذكر ديها العديد من المزايا (انظر الجدول 2).

خصائص سقالة، على سبيل المثال، حجم المسام خلايا فخ القوة داخل سقالة. إذا تم توفير لا يكفي من المواد الغذائية، وهذه الخلايا قد يموت وتفرز البروتياز التي تؤثر على بقاء الخلية من محيطجي الخلايا / الأنسجة. كنا قادرين على التكيف مع الفلورسنت التي تعتمد على بروتوكول تلطيخ أن يكون قادرا على تصور الخلايا الحية والميتة في وعلى منصة الاعدام التيتانيوم محبوك. على غرار غير مباشر البروتوكول مضان تلطيخ، ومبدأ هذا البروتوكول تلطيخ يمكن نقلها بسهولة إلى السقالات أخرى غير شفافة. عند القيام بذلك، خصائص سقالة الفردية، على سبيل المثال، حجم المسام ونشر المقابلة وكذلك من الممكن لصناعة السيارات في مضان، وتحديد المجهرية يجب أن تؤخذ بعين الاعتبار لأنها قد تؤثر على فترة حضانة واختيار fluorophores المستخدمة. هنا، مرة أخرى عبر الإنترنت أداة مضان الطيفية المشاهد يمكن أن تساعد على اختيار fluorophores كافية.

وباختصار، تشير في المختبر النتائج أن التيتانيوم محبوك نموذج نواة زرع المقترحة لديه ملف البيولوجي. مرفق الأولي من خلايا السلائف الوسيطة اللحمية (SCP-1 خلايا) على هذه المادة تشير إلى أن هذا سبائك التيتانيوم زرع خواص الموادl غير حيويا. على الرغم من أننا لم تحليلها جمعية المعلمات الطبوغرافية المختلفة، سقالة تعديل السطح قد تعزز خلية الالتزام انتشار وكذلك التفريق ^18. التوافق الأمثل بين السقالة والخلايا يثير احتمال تحسين التكامل زرع في الأنسجة المحيطة بها، وذلك في التحسن في طول العمر الجسم الحي بعد العلاج ^19. باستخدام برنامج إعداد اختبار ذكر أعلاه يفتح إمكانية لقياس وتصور التحسينات في الأداء البيولوجي للسقالة الناجمة عن التعديلات السطح. تفضيل السقالات مع سطح النشطة بيولوجيا على التصاميم زرع معدلة يوحي أداء أفضل ²⁰ من حيث التكامل أستيو المولدة للغضروف. ومما يعزز هذه الدراسة مزيدا من التقارير الأخرى على زرع التيتانيوم محبوك حيث تم الإبلاغ عن ممتلكاتها الميكانيكية والنشاط الحيوي ^6،7.

الكتاب تعلن أنه ليس لديهم المصالح المتنافسة. لم يكن هناك جزء من العمل أو هو حاليا قيد النظر للنشر أو تم نشرها في أماكن أخرى.

ويتم تمويل المشروع جزئيا ZENTRALES Innovationsprogramm Mittelstand (زيم) قصر Bundesministeriums FÜR فيرتشافت اوند اينرجي -KF3010902AJ4. وقد تم تغطية رسوم نشر من قبل الصدمة مستشفى BG توبنغن بألمانيا.