Une étape de purification de protéines Twin-Strep-marqués et leurs complexes sur Strep-Tactin résine réticulée Avec Bis (sulfosuccinimidyl) subérate (BS3)

Une méthode est décrite pour la purification efficace de protéines de fusion bi-Strep-marqués et leurs complexes spécifiques sur streptavidine modifiée (Strep-Tactin) résine réticulé de manière covalente avec Bis (sulfosuccinimidyl) subérate (BS3). Le procédé présente les avantages d'une vitesse rapide, une bonne récupération de la protéine cible et de haute pureté, et est compatible avec une analyse ultérieure par spectrométrie de masse.

La purification par affinité de protéines de fusion Strep-marquées sur résines portant une streptavidine ingénierie (Strep-Tactin) est devenue une méthode largement utilisée pour l'isolement des complexes de protéines dans des conditions physiologiques. Les protéines de fusion contenant deux copies de Strep-tag II, désignés double-Strep-tag ou SIII-tag, ont l'avantage d'une plus grande affinité pour Strep-Tactin par rapport à celles ne contenant qu'un Strep-tag unique, permettant ainsi la purification de protéines plus efficace. Cependant, cet avantage est compensé par le fait que l'élution de protéines double Strep-marqués avec de la biotine peut être incomplète, conduisant à une faible récupération des protéines. La récupération peut être considérablement améliorée en utilisant une élution avec dénaturant le dodécylsulfate de sodium (SDS), mais ceci conduit à une contamination par des Strep-Tactin libéré de la résine de l'échantillon, rendant le test incompatible avec l'analyse protéomique aval. Pour surmonter cette limitation, nous avons mis au point un procédé par lequel des tétramères de résine couplée à de Strep-Tactinest tout d'abord stabilisé par des liaisons covalentes de réticulation avec Bis (sulfosuccinimidyl) subérate (BS3) et de la résine réticulée résultante est ensuite utilisée pour purifier des complexes de protéines cibles en une seule étape de purification par lots. Élution efficace avec SDS assure une bonne récupération des protéines, tandis que l'absence de contamination Strep-Tactin permet en aval l'analyse des protéines par spectrométrie de masse. Comme une preuve de concept, que nous décrivons ici un protocole pour la purification de la protéine virale SIII étiqueté VPg-Pro à partir de noyaux de N. infecté par un virus benthamiana plantes à l'aide de la résine de polyméthacrylate de Strep-Tactin réticulé avec BS3. Le même protocole peut être utilisé pour purifier n'importe quelle protéine bi-Strep-marqué d'intérêt et caractériser ses partenaires de liaison physiologiques.

Au cours des dernières années, la technologie Strep-tag a été largement utilisé dans de nombreux domaines de la recherche biomédicale, y compris la protéomique et la biologie structurale. Cette technologie de purification des protéines, qui repose sur la fusion de protéines recombinantes à une courte Strep-tag peptide, a évolué avec l'avènement des matrices d'affinité portant des Strep-Tactin, une variante génétiquement modifiée de la streptavidine avec une meilleure capacité de liaison au peptide ^{1, 2.} Les protéines de fusion contenant deux copies de Strep-tag II, désignés double-Strep-tag ou SIII-tag, présentent une plus grande affinité pour les matrices Strep-Tactin que ceux contenant seulement un Strep-tag unique, assurant la purification plus efficace des protéines recombinantes et leurs partenaires de liaison associés. Cependant, la plus grande affinité de protéines double-Strep-marqués à Strep-Tactin a aussi son revers. Élution compétitive de ces protéines avec un excès de biotine peut être incomplète, conduisant à une diminution du rendement en protéines cible. A mefficace minerai alternative est élution avec du SDS, mais elle conduit à la contamination de l'échantillon non désiré avec Strep-Tactin libéré de la résine, ce qui rend le dosage incompatible avec l'analyse protéomique. Cet article présente une technique pour surmonter cette limitation en première stabiliser le tétramère de résine couplée de Strep-Tactin par réticulation chimique, puis en utilisant SDS pour éluer les protéines bi-Strep-marqués et leurs complexes associés de la résine réticulée résultant. Ainsi, le rendement en protéines suffisante peut être obtenue sans contamination de l'échantillon avec Strep-Tactin, ce qui permet en outre l'analyse par spectrométrie de masse.

La méthode est adaptée pour la purification de toute protéine de fusion recombinante avec un SIII-tag exposée en surface ³ ou bi-Strep-tag (WSHPQFEK de séquence d'acides aminés (GGGS) ₃ WSHPQFEK et SAWSHPQFEK (GGGS) ₂ GGSAWSHPQFEK, respectivement). La protéine peut être d'origine animale, végétale ou bactérienne et peut être soit isolé à partir de cellules totaleslysat ou fraction de organite enrichi. A titre d'exemple, nous décrivons ici la purification d'une protéine à étiquette SIII VPg-Pro Potato Virus de A (PVA) ⁴ à partir de la fraction nucléaire de plants de Nicotiana benthamiana infectés par le PVA. La fraction nucléaire a été isolé comme décrit précédemment ^5, avec les modifications suivantes: les cellules sont traitées avec du formaldéhyde, le butyrate de sodium a été substitué dans tous les tampons avec du fluorure de sodium 5 mM, inhibiteur complet de protease a été substitué par PMSF, Triton X-100 à une concentration dans l'extraction tampon N ° 2 a été abaissée à 0,3% (v / v) et le culot nucléaire obtenu par centrifugation à travers des coussins de saccharose (tampon d'extraction N ° 3) a été remis en suspension dans 1,45 ml de tampon de liaison pré-réfrigérés et mis en rotation pendant 1,5 heures à 4 ° C. L'extrait nucléaire résultant contenant la protéine appât SIII marqués et complexes associés (échantillon de protéine appât) a été traitée selon le protocole décrit ci-dessous (voir la section 2).

1. Réticulation de Strep-Tactin polyméthacrylate résine avec Bis (sulfosuccinimidyl) subérate (BS3)

1. Équilibrer un microtube scellé contenant 2 mg de BS3 agent de réticulation à température ambiante. ATTENTION: BS3 est une substance dangereuse. Portez des gants et des lunettes de protection.
2. Résine de polyméthacrylate Remettre en suspension Strep-Tactin (suspension à 50% dans 100 mM Tris-HCl, pH 8,0; EDTA 1 mM, NaCl 150 mM) par une brève agitation vigoureuse et à transférer immédiatement 600 ul de la suspension à une colonne de centrifugation à l'aide d'un embout de pipette avec la fin coupée.
3. Centrifuger à 1500 g pendant 30 secondes à la température ambiante. Jeter l'effluent et ajouter 450 ul de tampon phosphate salin (PBS) à la colonne.
4. Répétez l'étape précédente 2 fois plus de remplacer complètement le tampon Tris avec du PBS et laisser la résine dans 430 pi de PBS ajusté à pH 8,0 après la dernière centrifugation.
5. Piquer la feuille du microtube avec BS3 avec une pointe de pipette contenant 1001, l d'eau ultra-pure. Dissoudre la poudre dans de l'eau BS3 en pipettant doucement vers le haut et vers le bas et ajouter immédiatement 20 pi de la solution de la colonne de centrifugation. La concentration finale de BS3 dans la réaction de réticulation est d'environ 1,2 mM.
6. Tournez la colonne pendant 30 min à température ambiante. Vérifier que la résine est mélangée convenablement avec la solution de BS3.
7. Pour stopper la réaction, ajouter 6 ul de Tris-HCl 3M, pH 7,5 et de faire tourner la colonne pendant 15 minutes supplémentaires à température ambiante.
8. Centrifuger à 1500 g pendant 30 secondes à la température ambiante. Jeter l'effluent à travers et remettre en suspension la résine réticulée dans 450 pi de Tris solution saline tamponnée avec du Tween 20 (TBST). Répétez la centrifugation et les étapes de lavage deux fois de plus. Lors de la dernière étape, remettre en suspension la résine dans 450 pi de TBS.
9. Transférer la suspension de résine dans un nouveau tube à l'aide d'une pipette avec l'extrémité coupée. Reprendre la résine dans la colonne de gauche avec un autre 450 pi de TBS et transférer dans le même tube. Répétez ee dernière étape une fois de plus pour assurer un transfert maximal de la résine de la colonne sur le tube.
10. Laissez le tube reposer pendant 10 min à température ambiante et ajuster le volume à 600 pi en enlevant l'excès SCT. La résine est prêt pour une utilisation immédiate (recommandé) ou peut être conservé à 4 ° C, sans congélation.

2. Liaison de la protéine appât Twin-Strep-marqués et associés Complexes à la Strep-Tactin polyméthacrylate résine réticulée

1. Centrifugeuse de 1 ml de l'échantillon de protéine d'appât dans le tampon de liaison à 17 000 xg pendant 10 min à 4 ° C et transférer le surnageant dans un tube frais.
2. Pour minimiser la liaison de protéines endogènes biotinylés à la résine Strep-Tactin, ajouter de l'avidine à une concentration finale de 100 pg / ml et de tourner pendant 15 min à 4 ° C.
   1. Si la résine réticulée de l'étape 1.10 a été stocké pendant une longue période de temps à 4 ° C, de recueillir la résine par centrifugation à 400 xg for 1 min à 4 ° C, éliminer le surnageant et laver la résine avec 1 ml de TBST. Répétez la centrifugation et lavage étapes deux fois, d'abord avec TBST puis avec le SCT. Centrifuger le tube à 400 x g pendant 1 min à 4 ° C et ajuster le volume d'origine en enlevant l'excès de TBS.
3. Remettre en suspension la résine Strep-Tactin réticulé au vortex. Ajouter immédiatement 50 pi de la suspension de résine dans le tube contenant l'échantillon de protéine appât en utilisant un embout de pipette de coupe et faire tourner pendant encore 30 min à 4 ° C.
4. En attendant, mettre thermomixer à 55 ° C et préchauffer à 500 pi de tampon d'élution pour une utilisation dans l'étape 3.1.
5. Centrifuger à 400 g pendant 1 min à 4 ° C. Jeter le surnageant et laver la résine sur un agitateur pendant 5 min à 4 ° C avec 1 ml de la pré-réfrigérés tampon de lavage n ° 1. Répétez la centrifugation et les étapes de lavage trois fois. Lors de la dernière étape, remettre en suspension la résine dans 250 ul de tampon de lavage n ° 2.
6. Tr ansfer la suspension de résine d'une colonne de centrifugation douce. Remettre en suspension la résine restant dans le tube dans un autre 250 ul de tampon de lavage n ° 2 et le transférer dans la même colonne.
7. Centrifugeuse à 400 g pendant 3 min à 4 ° C, jeter le accréditives et transférer la colonne à un dauphin nez 2 nouveau tube de ml. Procéder immédiatement à l'étape d'élution ci-dessous.

3. L'élution de la protéine spécifique Complexes

1. Ajouter 150 pi de tampon d'élution préchauffé provenant de l'étape 2.4 de la colonne de centrifugation.
2. Incuber dans thermomixer pendant 5 min à 55 ° C, en agitant à 1400 tours par minute.
3. Centrifuger à 1500 g pendant 1 min à température ambiante.
4. Jeter la colonne et stocker les protéines cibles purifiés à ≤ -20 ° C.

Tableau 1. Tampons utilisés dans la présente étude.

La procédure de purification est illustrée schématiquement sur ​​la figure 1, avec une représentation des problèmes associés à d'autres procédés de purification existants.

Figure 1. Représentation schématique de la procédure de purification. Le flux de travail comprend la stabilisation du Strep-Tactin tétramère de résine à couplage par l'intermédiaire de réticulation covalent avec BS3, la liaison de la protéine appât double-Strep-marqués et les complexes associés à la résine réticulée , à une distance de lavage les protéines non liées, la dénaturation de l'élution des complexes de protéines liées de manière spécifique avec SDS à 1% et leur analyse par chromatographie en phase liquide-spectrométrie de masse tandem (LC-MS/MS). Deux sphères rouges dans la protéine appât désignent la double Strep-tag. Limites d'autres méthodes de purification sont présentés dans l'encartcases à droite. Ils comprennent élution incomplète des protéines cibles avec de la biotine et de la contamination de l'échantillon avec Strep-Tactin élution suivante avec dénaturant SDS à 1%.

Des résultats typiques de la purification des protéines SIII étiqueté en utilisant la résine de polyméthacrylate de Strep-Tactin BS3-réticulé et de dénaturation élution avec 1% de SDS sont présentés dans la figure 2. À 10% (15 ul) de l'éluat de la colonne de centrifugation contenant purifiée SIII-tagged protéines PVA VPg-Pro et associés ont été analysés par SDS-PAGE suivie par coloration à l'argent. L'absence de la 52 kDa bande correspondant à PVA VPg-Pro dans la voie de contrôle négatif confirmé la spécificité de la liste déroulante. 40 ul de l'éluat de la colonne de spin restants ont été appliqués sur un gel SDS-kératine libre et a été découpées dans la voie correspondante et les protéines contenues ont été digérés avec de la trypsine et analysée par chromatographie en phase liquide-spectrométrie de masse tandem (LC-MS/MS). L'analyse par spectrométrie de masse identifié viral RNA-dependent ARN polymérase (réplicase) NIb comme le partenaire d'interaction de VPg-Pro. Peptides tryptiques multiples correspondant à NIb ont été détectés dans les quatre répétitions biologiques de la purification par affinité et aucun dans les quatre contrôles exprimant VPg-Pro sans le SIII-tag, confirmant la spécificité de l'interaction. Parce que le poids moléculaire de plumes (59 kDa) est proche de celle du SIII marqués VPg-Pro (52 kDa), les deux protéines apparaissent comme une double bande en analyse SDS PAGE (figure 2, flèche). Pris ensemble, les résultats décrits ci-dessus fournissent la preuve expérimentale que la purification par affinité de résines Strep-Tactin covalente réticulés avec BS3 peut être utilisé avec succès pour isoler les protéines bi-Strep-marqués et identifier leurs partenaires de liaison physiologiques par spectrométrie de masse.

Figure 2. Purification de SIII-étiqueté PVA VPg-Pro et son partenaire de liaison PVA NIb de résine de polyméthacrylate Strep-Tactin réticulé avec BS3. L'illustration montre un gel de polyacrylamide-SDS coloré à l'argent des éluats de la réticulé perles. NIb a été identifié par spectrométrie de masse en tant que partenaire de liaison de VPg-Pro en utilisant une portion aliquote du même échantillon. SIII-étiquetés PVA VPg-Pro (MW prévue: 52 kDa) et NIb (de MW prévue: 59 kDa) migrent comme une double bande, indiqué par une flèche. Contrôle négatif (voie centrale) correspond à la purification de cellules infectées par le virus exprimant VPg-Pro sans le SIII-tag.

Figure 3. Biotine élution de SIII marqués PVA VPg-Pro à partir de résine de polyméthacrylate Strep-Tactin estincomplète par rapport à élution avec 1% de SDS. L'illustration montre un immunoblot anti-VPg des éluats de perles Strep-Tactin. Les perles ont été éluées avec 15 mM soit de la biotine ou avec 1% de SDS. La différence d'intensité de signal reflète différents rendements protéiques obtenus avec les deux techniques d'élution. Contrôles négatifs correspondent à des purifications de cellules infectées par le virus exprimant VPg-Pro sans le SIII-tag.

Figure 4. Réticulation covalente avec BS3 empêche la libération de Strep-Tactin de la résine durant la SDD élution. L'illustration montre un gel coloré à l'argent des éluats SDS de non-réticulé (voie de gauche) et BS3-réticulé (voie de droite) résine de polyméthacrylate Strep-Tactin. A noter la présence de Strep-Tactin publié dans la voie de gauche, mais son absence dans la voie de droite.

Figure 5. Structure chimique de bis (sulfosuccinimidyl) subérate (BS3), et sa réaction de réticulation avec les groupes epsilon amino des résidus de lysine dans Strep-Tactin.

Figure 6. Purification de la protéine bi-Strep-étiqueté vert fluorescent (GFP) sur la non-réticulé et BS3 réticulé résine de polyméthacrylate Strep-Tactin. Deux quantités égales de cellules de rein embryonnaire humain 293 exprimant la GFP double-Strep-étiqueté ont été lysées et traitées de manière similaire en utilisant le protocole ci-dessus, sauf que dans un cas, la résine a été réticulée avec BS3 et dans l'autre BS3 être afr substitué avec de l'eau dans la réaction de réticulation. La figure montre un gel de polyacrylamide-SDS coloré à l'argent et immunoblot anti-GFP des protéines purifiées. Notez que une certaine diminution du rendement en protéine est inhérente aux procédés de purification impliquant une réticulation chimique, mais cela est compensé par la pureté de l'échantillon augmenté en raison de l'absence de Strep-Tactin libéré.

Le protocole ci-dessus peut être utilisé pour purifier n'importe quelle protéine appât double-Strep-marqué d'intérêt et ses complexes sont associés à n'importe quel tampon convenable qui ne contient pas de la biotine ou des dénaturants forts. Dans la version actuelle du protocole, de liaison et de lavage sont effectuées dans des conditions relativement strictes en la présence de forte teneur en sel et un détergent non-ionique. Bien que cela se traduit par moins de fond, des complexes de protéines fragiles peuvent se dissocier dans ces conditions. Pour préserver ces complexes d'affinité inférieure, la concentration en sel peut être abaissé et d'un détergent non-ionique peut être réduite ou omise dans les tampons de liaison et de lavage.

Le principal avantage du système bi-Strep-tag est la forte affinité de la petite (3 kDa) tandem tag à la streptavidine ingénierie (Strep-Tactin) ^{1, 2,} permettant efficace purification en une étape de protéines cibles et de leurs complexes, même dans le lot Mode. En raison de la forte liaison de double-Strep-tagà Strep-Tactin, la résine peut être lavée dans des conditions modérément stringentes, telles que haute détergent et / ou des concentrations de sel, ce qui conduit à une pureté plus élevée de la protéine cible. Toutefois, cette forte liaison a aussi ses inconvénients. Même dans le cas des protéines avec un Strep-tag unique II (séquence de WSHPQFEK d'acides aminés), élution compétitive de la résine peut parfois être difficile. Par exemple, l'élution de la protéine (II) à étiquette Strep kinase, NtCDPK2, à partir de la résine de polyméthacrylate de Strep-Tactin avec 10 mM desthiobiotine s'est avérée sans succès, ce qui nécessite de dénaturation élution avec un tampon échantillon SDS ^6. Le problème a été résolu qu'après desthiobiotine a été remplacé par de la biotine en compétition plus forte (10 mM) et l'élution a été effectuée pendant 5 minutes avec agitation vigoureuse ^7. Dans le cas de la-Strep-tag double, qui a une affinité plus élevée pour Strep-Tactin, protéine cible élution peut être incomplète, même à des concentrations aussi élevées que la biotine 15 mM. Comme représenté sur la Figure 3,seule une petite fraction de SIII marqués PVA VPg-Pro peut être éluée de la résine Strep-Tactin avec 15 mM de biotine par rapport à la quantité éluée avec 1% de SDS. Il est important de noter que l'efficacité de l'élution compétitive susceptible dépend également de la nature de la protéine éluée ou complexe protéique. Protéines plus grandes et plus hydrophobes peuvent encombrement entraver l'accessibilité de la poche de liaison de la biotine dans Strep-Tactin, ce qui élution compétitive moins efficace. Les inconvénients ci-dessus sont évités en utilisant une élution avec du SDS, mais une telle élution a ses propres problèmes, tournant essentiellement autour du fait que l'exposition aux détergents entraîne la dissociation des tétramères Strep-Tactin résine couplée et la contamination de l'échantillon avec libéré Strep-Tactin ^8. Cela est illustré dans la Figure 4 (voie de gauche), ce qui indique une quantité considérable de Strep-Tactin libéré après incubation de la résine Strep-Tactin dans un tampon d'élution contenant du SDS à 1%. Une telle contamination est inacceptable sil'échantillon doit être analysé en outre par LC-MS/MS.

Une solution efficace à ce problème de contamination est au-dessus de la stabilisation de la résine à couplage Strep-Tactin tétramère ⁹ par réticulation covalente. Pour ce faire, nous avons utilisé une, non clivable, homobifonctionnel agent de réticulation BS3 amine-réactif soluble dans l'eau avec un historique d'utilisation réussi à stabiliser les structures des protéines ^{de 10 à 13.} Figure 5 montre la formule chimique du BS3 et sa réticulation réaction avec les acides libres epsilon groupes de la lysine dans Strep-Tactin. Lorsque le Strep-Tactin tétramère de résine à couplage a été stabilisé par réticulation avec BS3, le problème de la contamination de l'échantillon avec Strep-Tactin libéré a été pratiquement éliminée (figure 4, la voie de droite). Étant donné que la réticulation avec BS3 ne provoque l'agrégation des protéines ¹⁴ extensif, elle ne réduit pas l'accessibilité de la poche de liaison à la streptavidine biotine, ce qui rend l'résine réticulée convenant pour la purification des protéines de fusion Strep-tag. Il convient de noter, cependant, que la réticulation chimique des protéines ayant une activité biologique (anticorps, etc) stabilise les deux conformations protéiques actifs et inactifs, ce qui conduit à une certaine perte d'activité. Par exemple, la méthode d'immunoprécipitation bien établie en utilisant des anticorps BS3 réticulé produit un rendement en protéine cible plus faible par rapport à celle obtenue avec les anticorps non-réticulés ^15. Néanmoins, une certaine perte d'activité biologique est considéré comme un compromis acceptable pour la pureté de l'échantillon amélioré. Nous avons observé des résultats similaires avec la résine Strep-Tactin BS3-réticulé. Le rendement en protéines légèrement plus faible obtenue avec la résine réticulée est plus que compensée par la pureté de l'échantillon grandement améliorée (figure 6).

Une autre application potentielle de la méthode proposée est dans la purification de protéines membranaires marquées Strep-solubilized avec des détergents. Les détergents sont essentiels pour maintenir de telles protéines hydrophobes et de leurs complexes associés en solution, mais leur présence peut conduire à une contamination de l'échantillon avec Strep-Tactin libéré de la résine d'affinité. Un bon exemple en est la purification d'une Strep (II)-protéine membranaire marqué A sur des billes NTT1 Strep-Tactin aux fins de la cristallisation des protéines ^8. La présence du détergent laurylamidodimethylpropylaminoxide (Lapão) dans le tampon d'élution conduit à la libération de Strep-Tactin des perles et de la croissance ultérieure des cristaux indésirables Strep-Tactin ^8. Stabilisation de la résine couplée Strep-Tactin tétramère par liaison covalente réticulation peut constituer un moyen efficace de surmonter ce problème.

En résumé, la réticulation chimique a été employée avec succès pour surmonter les limitations associées à la dénaturation élution de la résine Strep-Tactin. Cette approche a permis d'atteindre une bonne nouvelle protéine cibledécouverte sans introduire de contamination de l'échantillon. La méthode proposée peut donc être utilisé pour identifier des partenaires de liaison spécifique de double-Strep protéines marquées d'appâts par spectrométrie de masse. En outre, le procédé peut être appliqué pour isoler et caractériser des complexes de nucléoprotéines, y compris ceux à réticulation réversible avec du formaldéhyde, ainsi que les protéines membranaires solubilisées par des détergents. Enfin, réticulation chimique ne modifie pas de manière significative les propriétés physiques de la résine Strep-Tactin, ce qui rend la résine réticulée susceptible de convenir pour des applications à haut débit.

Aucun conflit d'intérêt déclaré.

Nous reconnaissons avec gratitude le soutien technique de Sini Miettinen, Minna Pöllänen et Taru Rautavesi. Nous remercions Helka Nurkkala pour fournir des cellules HEK 293 exprimant double-Strep-GFP étiqueté et Pekka Evijärvi pour la fourniture de matériel d'enregistrement sonore. Ce travail a été financé par l'Académie de Finlande, accorder les numéros 138329, 134684 et 258978.