Nos interesa entender cómo se regulan ciertas decisiones durante el desarrollo. Los modelos de organoides y las tecnologías de celómica única nos están permitiendo hacer preguntas que antes no eran posibles. El uso de modelos de organoides in vitro nos permite generar una mayor cantidad de datos, especialmente para poblaciones celulares transitorias, como la cresta neural.
Los resultados significativos del modelo de variabilidad siguen siendo un desafío experimental importante. Hemos demostrado que las células de la cresta craneal reexpresan genes de prepotencia para expandir el potencial de diferenciación. Para comenzar, prepare una solución fresca de colagenasa a una concentración de dos miligramos por mililitro en el medio knockout DMEM.
Aspire el medio ESC de la placa de pocillo que contiene entre un 70 y un 80 % de mESC confluente. Ahora, agregue suavemente un mililitro de PBS al costado del pozo. Agite la placa para asegurar un lavado uniforme.
Pipetea el PBS y reemplázalo con dos mililitros de solución de colagenasa. Incubar a 37 grados centígrados durante 30 a 45 minutos. Revise la placa bajo un microscopio óptico con un aumento de 10X después de 20 minutos de incubación y luego cada cinco minutos.
Cuando las colonias muestren los bordes enrollados, golpee vigorosamente el lado del plato para separar las colonias. Con una pipeta serológica de cinco mililitros, recoja las colonias desprendidas y transfiera a un tubo cónico de 15 mililitros. Centrifugar las colonias a 16 g durante tres minutos a temperatura ambiente.
Aspire la mayor cantidad de medio posible del tubo cónico sin perturbar las colonias en la parte inferior. A continuación, agregue un mililitro de solución de tripsina al 0,05% al pellet e incube. Con una micropipeta P1000 y P200, pipetee la suspensión hacia arriba y hacia abajo vigorosamente para disociar las colonias, luego agregue dos mililitros de medio de cultivo mESC para bloquear la tripsina.
Centrifugar el tubo a 160 G durante tres minutos a temperatura ambiente. Pipetear el sobrenadante y, a continuación, añadir un mililitro de medio de diferenciación CNCC. Cuente las células con un dispositivo de recuento de células automatizado o bajo un microscopio, luego diluya las células en un medio de diferenciación CNCC para lograr una concentración de 3.000 células vivas por cada 50 microlitros.
Con una micropipeta P200, siembre 50 microlitros de la suspensión celular en cada pocillo de una placa de 96 pocillos con fondo en U no tratada con TC. Rellene cada pocillo hasta 200 microlitros con medio de diferenciación CNCC e incube. Observe la placa que contiene el cultivo de 24 horas de células diferenciadas bajo un microscopio óptico para asegurarse de que los pequeños grupos con bordes claros sean visibles en el fondo de cada pocillo.
Vuelva a colocar la placa en la incubadora durante la noche. El segundo día, retire lentamente 100 microlitros de medio de cada pocillo. A continuación, utilice una micropipeta P200 con la punta cortada a tres o cuatro milímetros del extremo para aspirar las neuroesferas junto con el medio restante.
Transfiera las neuroesferas y el medio restante a una placa de 96 pocillos de fondo plano no tratada con TC. Verifique la transferencia bajo un microscopio óptico. Cubra cada pocillo con 200 microlitros de medio de diferenciación CNCC precalentado.
En el cuarto día, aspire 100 microlitros de medio de cada pocillo. Reemplácelo con 100 microlitros de medio de diferenciación CNCC precalentado y luego vuelva a incubar. En los días cinco y seis, verifique la unión de las neuroesferas bajo un microscopio óptico.
Asegúrese de que las células más ligeras que se deslaminan de las neuroesferas comiencen a rodear su cuerpo principal. Prepare el medio de mantenimiento CNCC según la composición proporcionada. Filtre la albúmina sérica bovina a través de un filtro de 0,22 micrómetros antes de agregarla al medio.
Una vez que se agreguen los factores de crecimiento, almacene el medio a cuatro grados centígrados durante un máximo de tres semanas, asegurándose de que esté protegido de la luz. Agregue 100 microlitros de solución de fibronectina en cada pocillo de una placa de 96 pocillos no tratada con TC. Mientras la placa está en reposo, aspire la mayor cantidad posible de medio de diferenciación de CNCC de los pocillos de la placa de 96 pocillos de fondo plano no tratada con TC.
Reemplace el medio con 50 microlitros de Accutase. Incubar a 37 grados centígrados durante cinco minutos. A continuación, agregue 100 microlitros de medio de mantenimiento CNCC en cada pocillo para apagar el Accutase.
Retire la fibronectina de los pocillos recubiertos de la placa receptora. luego filtre el CNCC post-migratorio separado a través de un filtro de 40 micrómetros en los pocillos de la placa receptora. En el punto de tiempo deseado, utilice una micropipeta P200 de punta cortada para transferir neuroesferas de la placa de 96 pocillos a un tubo de dos mililitros de ADN de baja unión.
Después de dejar que las neuroesferas se asienten en el tubo durante tres minutos a temperatura ambiente, pipetee la mayor cantidad de medio posible y luego enjuague con un mililitro de PBS frío. Para preparar las cámaras de montaje, coloque tres capas de cinta transparente sin fibra de doble cara en un portaobjetos de microscopio. Con una navaja, corta una ventana de tres milímetros por ocho milímetros en la cinta adhesiva de doble cara.
Debajo de un estereoscopio, con una punta de corte P200, pipetee cuidadosamente las neuroesferas del agente de limpieza en la cámara de montaje. Utilice aumentos entre 2X y 4X para proporcionar un campo de visión de toda la cámara e identificar las neurosferas. Coloque un cubreobjetos en la superficie de la cámara y presione ligeramente sus lados para adherirlo.
Los cultivos de neurosfera en placas no tejidas mostraron uniones uniformes a partir del quinto día, mientras que los cultivos en placas de Petri mostraron una unión y fusión variables de las neuroesferas, particularmente evidentes en el cuarto día. La variabilidad del tamaño de las neuroesferas se redujo significativamente en los cultivos de placas de 96 pocillos en comparación con los cultivos de placas de Petri en los días cuatro y siete. El diámetro de las neuroesferas en placas de 96 pocillos osciló entre 139 micrómetros y 295 micrómetros en el cuarto día y entre 383 micrómetros y 552 micrómetros en el séptimo día, mientras que los cultivos en placas de Petri mostraron un rango más amplio.
El crecimiento de la neurosfera fue exponencial en términos de número de células, pasando de una media de 1.082 células en el segundo día a 48.352 células en el noveno día. El crecimiento del diámetro fue lineal, aumentando de un promedio de 136 micrómetros en el segundo día a 570 micrómetros en el noveno día. El análisis de inmunofluorescencia confirmó que las neuroesferas y las células delaminantes expresan los marcadores CNCC AP2 alfa y SOX9 y el marcador EMT TWIST1 en los días nueve y 13.
PAX7 solo estaba presente en las neurosferas.
