我们有兴趣了解在开发过程中如何调节某些决策。类器官模型和单细胞组学技术使我们能够提出以前不可能的问题。体外类器官模型的使用使我们能够生成更多的数据，特别是对于瞬时细胞群，例如神经嵴。
显著的可变性模型输出仍然是一个主要的实验挑战。我们已经证明颅嵴细胞重新表达前能性基因以扩大分化潜力。首先，在 DMEM 敲除培养基中制备浓度为 2 毫克/毫升的新鲜胶原酶溶液。
从含有 70% 至 80% 汇合 mESC 的孔板中吸出 ESC 培养基。现在，轻轻地向孔的侧面加入 1 毫升 PBS。摇动板以确保均匀洗涤。
吸出 PBS 并用 2 毫升胶原酶溶液代替。在 37 摄氏度下孵育 30 至 45 分钟。孵育 20 分钟后，在光学显微镜下以 10 倍放大倍率检查板，然后每 5 分钟检查一次。
当菌落显示卷起的边缘时，用力敲击板侧以分离菌落。使用 5 毫升血清移液管收集分离的菌落并将它们转移到 15 毫升锥形管中。在室温下以 16 G 离心菌落 3 分钟。
从锥形管中吸出尽可能多的培养基，而不会干扰底部的菌落。接下来，向沉淀中加入 1 毫升 0.05% 胰蛋白酶溶液并孵育。使用 P1000 和 P200 微量移液器，用力上下移液悬浮液以解离菌落，然后加入 2 毫升 mESC 培养基以封闭胰蛋白酶。
在室温下以 160 G 离心管 3 分钟。吸出上清液，然后加入 1 毫升 CNCC 分化培养基。使用自动细胞计数装置或在显微镜下对细胞进行计数，然后在 CNCC 分化培养基中稀释细胞，以达到每 50 微升 3， 000 个活细胞的浓度。
使用 P200 微量移液器，将 50 微升细胞悬液接种到未经 TC 处理的 U 形底 96 孔板的每个孔中。用 CNCC 分化培养基将每个孔加满至 200 微升并孵育。在光学显微镜下观察含有分化细胞培养物 24 小时的板，以确保在每个孔的底部可以看到具有清晰边界的小簇。
将板放回培养箱中过夜。第二天，从每个孔中缓慢去除 100 μL 培养基。然后，使用 P200 微量移液器，其尖端从末端切下 3 到 4 毫米，以吸出神经球以及剩余的培养基。
将神经球和剩余培养基转移到未经 TC 处理的平底 96 孔板中。在光学显微镜下验证转移。在每个孔中加入 200 μL 预热的 CNCC 分化培养基。
第 4 天，从每个孔中吸出 100 μL 培养基。用 100 微升预热的 CNCC 分化培养基替换它，然后再次孵育。在第 5 天和第 6 天，在光学显微镜下检查神经球的附着。
确保从神经球分层的较轻细胞开始围绕其主体。根据给定的成分准备 CNCC 维持培养基。在将牛血清白蛋白添加到培养基中之前，通过 0.22 微米过滤器过滤牛血清白蛋白。
添加生长因子后，将培养基在 4 摄氏度下储存长达三周，确保避光。将 100 μL 纤连蛋白溶液加入未经 TC 处理的 96 孔板的每个孔中。当板静置时，从未 TC 处理的平底 96 孔板的孔中吸出尽可能多的 CNCC 分化培养基。
用 50 微升 Accutase 替换培养基。在 37 摄氏度下孵育 5 分钟。接下来，向每个孔中加入 100 微升 CNCC 维持培养基以淬灭 Accutase。
从接收板的涂层孔中去除纤连蛋白。然后通过 40 微米过滤器将分离的迁移后 CNCC 过滤到接收板的孔中。在所需的时间点，使用切割尖端 P200 微量移液器将神经球从 96 孔板转移到 DNA 低结合 2 毫升管中。
在室温下让神经球在试管中沉淀 3 分钟后，吸出尽可能多的培养基，然后用 1 毫升冷 PBS 冲洗。要准备安装室，请在显微镜载玻片上放置三层双面透明无纤维胶带。用剃须刀在双面胶带上切出一个 3 毫米 x 8 毫米的窗口。
在立体镜下，用 P200 切割尖端小心地将清除剂中的神经球移液到安装室中。使用 2 倍到 4 倍的放大倍率来提供整个腔室的视野并识别神经球。将盖玻片放在腔室表面，轻轻按压其两侧以粘附。
从第 5 天开始，非组织板中的神经球培养物显示出均匀的附着，而培养皿培养物显示神经球的可变附着和融合，到第 4 天尤其明显。与培养皿培养物相比，96 孔板培养物在第 4 天和第 7 天显着降低了神经球的大小变异性。96 孔板中神经球的直径在第 4 天从 139 微米到 295 微米不等，在第 7 天从 383 微米到 552 微米不等，而培养皿培养物的范围更广。
神经球生长在细胞数量方面呈指数级增长，从第 2 天的平均 1， 082 个细胞增加到第 9 天的 48， 352 个细胞。直径增长呈线性，从第 2 天的平均 136 微米增加到第 9 天的 570 微米。免疫荧光分析证实，神经球和分层细胞在第 9 天和第 13 天表达 CNCC 标志物 AP2 α 和 SOX9 以及 EMT 标志物 TWIST1。
PAX7 仅存在于神经球中。
