El protocolo ofrece un método simple para purificar motores moleculares activos utilizando el sistema de baculovirus Sf9. También detalla la motilidad de una sola molécula y los ensayos de deslizamiento multimotor para estudiar el mecanismo regulador de las proteínas motoras. Toda esa expresión vectorial tradicional de baculovirus Sf9 y la purificación de afinidad de un solo paso, conducirá a la proteína motora pura y activa para estudiar los detalles mecanicistas de las quinesinas superprocesivas en sistemas monomotrices y multimotores.
Además de los motores Kinesin, el protocolo se puede aplicar para estudiar las propiedades bioquímicas y biofísicas de otras proteínas basadas en citoesqueletos como la dionine y la miosina. El protocolo es detallado y fácil de seguir. Algunas sugerencias son manejar las células Sf9 con cuidado, ya que son propensas a la contaminación, y seguir las notas proporcionadas en el protocolo.
La demostración visual es altamente efectiva, fácil de seguir y comprender los pasos críticos, especialmente para aquellos que nunca han realizado estos ensayos. Demostrando el procedimiento estarán Pushpanjali Soppina y Dipeshwari Shewale, estudiantes de doctorado que trabajan conmigo y Pradeep Naik. Para comenzar, siembre las células en un plato de 35 mililitros, a una densidad de 4.5 veces 10 a la quinta celda por mililitro.
Después de 24 horas, mezcle un microgramo de ADN bacmid y 100 microlitros de medios de Grace no suplementados en un tubo. Mezcle seis microlitros de reactivo de transfección en otro tubo con 100 microlitros de medios de Grace no suplementados. Transfiera cuidadosamente el contenido del primer tubo al segundo tubo.
Mezclarlos e incubar la mezcla durante 45 minutos a temperatura ambiente. Agregue 0.8 mililitros de medios de Grace sin suplementar a la mezcla. Mezclar y aspirar los medios Sf900 SFM de las células.
Agregue el medio de transfección preparado gota a gota en la parte superior de las celdas e incube la placa durante seis horas. Luego retire con cuidado la mezcla de transfección. Agregue dos mililitros de medios SF900 SFM e incube aún más a 28 grados centígrados durante 48 horas.
A continuación, verifique la expresión de la proteína motora bajo un microscopio de fluorescencia invertida. Cosechar el medio con células infectadas, y girar durante cinco minutos, a 500 G.Recoger el sobrenadante y congelar las alícuotas. Añadir 10 mililitros de medios SF900 SFM con células y un mililitro de cepa de virus P-cero, en un matraz cónico estéril de 100 mililitros.
Incubar a 28 grados centígrados con agitación constante a 90 rpm. Después de 72 horas, gire las células en un tubo cónico estéril de 15 mililitros a 500 G durante cinco minutos y recoja el sobrenadante. Para la expresión de proteínas a gran escala, infecte 30 mililitros del cultivo en suspensión con un mililitro de virus de stock P1.
72 horas después de la infección, verifique la expresión de proteínas en las células y recoja las células en tubos cónicos estériles de 50 mililitros. Después de hilar, deseche el sobrenadante y recoja el pellet celular. Para lisar las células, agregue tres mililitros de tampón de lisis helada a la bolita celular.
Gire el lisado celular a 150, 000 G durante 30 minutos, a cuatro grados centígrados. Recoger el sobrenadante y mezclarlo con 40 microlitros de resina de afinidad 50% ANTI-FLAG M2. Incubar la mezcla a cuatro grados centígrados durante tres horas con volteo de extremo a extremo.
Ahora pellet la resina FLAG girando a 500 G durante un minuto a cuatro grados centígrados. Lave el pellet de resina FLAG tres veces con tampón de lavado helado. Y después del tercer lavado, drene con cuidado el tampón de lavado.
A continuación, agregue 70 microlitros de tampón de lavado que contenga 100 microgramos por mililitro de péptido FLAG, al pellet de resina, e incube durante la noche a cuatro grados centígrados, como se demostró anteriormente. Después de hilar, recoja el sobrenadante que contiene proteína purificada en un tubo nuevo. Prepare una mezcla de polimerización como se describe en el manuscrito y agregue 10 microlitros de tubulina a la mezcla de polimerización.
Transfiera el tubo a un bloque de calor, precalentado a 37 grados centígrados, e incube durante 30 minutos. Después de preparar el tampón de estabilización de microtúbulos, caliéntelo y agréguelo a los microtúbulos polimerizados. Una vez que la cámara de la celda de flujo de motilidad esté preparada, fluya 30 microlitros de solución de microtúbulos diluidos a través de la cámara.
Después de 30 minutos, fluya de 40 a 50 microlitros de tampón de bloqueo e incubarlo. Prepare una mezcla de motilidad y agréguele un microlitro del motor purificado. Mezclar bien y hacer fluir la solución hacia la cámara de motilidad.
Selle ambos extremos de la cámara de motilidad y la imagen bajo iluminación TIRF. Concéntrese en los motores individuales etiquetados mCitirine, moviéndose procesalmente. Mezcle la tubulina marcada con rodamina con la tubulina no marcada en una proporción de uno a 10.
Después de 30 minutos de polimerización, agregue suavemente 30 microlitros de tampón de estabilización de microtúbulos precalentados e incube más, durante cinco minutos, a 37 grados centígrados. Cizallar los microtúbulos pipeteando con la punta de carga capilar. Después de preparar la cámara de flujo de motilidad, fluyan 50 microlitros de nanocuerpos GFP purificados Sf9 e incuben durante 30 minutos.
Bloquee la superficie deslizante de la cubierta fluyendo 50 microlitros de tampón de bloque. Prepare 50 microlitros de la mezcla del motor. Fluya hacia la cámara después de mezclar suavemente la solución e incube durante 30 minutos.
Lave la cámara, dos veces, con 50 microlitros de P12-caseína. Prepare la mezcla de ensayo deslizante y mézclela suavemente, antes de fluir hacia la cámara de motilidad. Selle los extremos de la cámara de motilidad e imagine el deslizamiento de microtúbulos bajo la iluminación TIRF.
Después de 48 horas de transfección, las células no transfectadas aparecen pequeñas, redondas y firmemente adheridas. Sin embargo, las células transfectadas que expresan proteínas, estaban débilmente unidas a la superficie y mostraron un diámetro celular agrandado. Después de 72 horas, más del 90% de las células Sf9 expresaron KIF1A marcado con fluorescencia, motor de quinesina-3, y las células se unieron libremente a la superficie.
La proteína motora de la quinesina-3 se purificó a partir de las células Sf9 transfectadas. El timógrafo representa el motor de kinesina-3 caminando procesalmente, a lo largo de la superficie de los microtúbulos. Los eventos de motilidad mostraron una velocidad promedio y una longitud de carrera de aproximadamente 2.44 micrómetros por segundo y 10.79 micrómetros respectivamente.
El timógrafo indica un deslizamiento suave de los microtúbulos por los motores de kinesina-3, con una velocidad promedio de aproximadamente 1,37 micrómetros por segundo. Lo más importante es agregar el tampón de estabilización sin alterar la mezcla de microtúbulos y no cortar el microtúbulo. El protocolo sería útil para otras aplicaciones, como mediciones de ATPasa, análisis biofísico, mecanismos, ensayos de reconstitución in vitro, etc.
Usando motores purificados sf9, hemos demostrado recientemente que los motores kinesin-3 son rápidos y superprocesales. Curiosamente, estos motores exhiben altas tasas de rotación de ATP en comparación con el motor bien caracterizado, Kinesin-1.
