Sf9纯化超加工驱动蛋白-3系列电机的单分子分析

该协议提供了一种使用Sf9杆状病毒系统纯化活性分子马达的简单方法。它还详细介绍了单分子运动和多运动滑动测定，以研究运动蛋白的调节机制。所有传统的载体表达Sf9杆状病毒表达和一步亲和纯化，将引导纯活性运动蛋白研究超处理驱动蛋白在单分子和多运动系统中的机理细节。

除了驱动蛋白马达外，该方案还可用于研究其他基于细胞骨架的蛋白质（如薯蓣碱和肌球蛋白）的生化和生物物理特性。该协议详细且易于遵循。一些建议是小心处理Sf9细胞，因为它们容易被污染，并遵循协议中提供的注释。

视觉演示非常有效，易于遵循和理解关键步骤，特别是对于那些从未进行过这些测定的人。演示该程序的将是Pushpanjali Soppina和Dipeshwari Shewale，他们是与我和Pradeep Naik一起工作的博士生。首先，将细胞接种在35毫升培养皿中，密度为4.5乘以每毫升10至第五个细胞。

24小时后，在管中混合一微克杆粒DNA和100微升未补充的格雷斯培养基。在另一个试管中将6微升转染试剂与100微升未补充的Grace培养基混合。小心地将第一管的内容物转移到第二管中。

将它们混合并在室温下孵育混合物45分钟。在混合物中加入0.8毫升未补充的格雷斯培养基。从细胞中混合并吸出Sf900 SFM培养基。

将准备好的转染培养基滴加在细胞顶部，并将板孵育6小时。然后小心地取出转染混合物。加入两毫升SF900 SFM培养基，并在28摄氏度下进一步孵育48小时。

接下来，在倒置荧光显微镜下检查运动蛋白表达。收获带有感染细胞的培养基，并以500G离心五分钟.收集上清液并快速冷冻等分试样。在无菌的100毫升锥形烧瓶中加入10毫升SF900 SFM培养基和1毫升P-零病毒原液。

在 28 摄氏度下孵育，以 90 rpm 的速度持续振荡。72小时后，将细胞在15毫升无菌锥形管中以500G旋转5分钟并收集上清液。对于大规模蛋白表达，用1毫升P1原液病毒感染30毫升悬浮培养物。

感染后72小时，检查细胞的蛋白质表达，并将细胞收集在无菌的50毫升锥形管中。旋转后，弃去上清液，收集细胞沉淀。要裂解细胞，向细胞沉淀中加入三毫升冰冷的裂解缓冲液。

在4摄氏度下以150， 000G旋转细胞裂解物30分钟。收集上清液并将其与40微升50%ANTI-FLAG M2亲和树脂混合。将混合物在 4 摄氏度下孵育三小时，并端到端滚揉。

现在，通过在 500 G 下在 4 摄氏度下旋转一分钟来沉淀 FLAG 树脂。用冰冷的洗涤缓冲液洗涤FLAG树脂颗粒三次。第三次洗涤后，小心地排出洗涤缓冲液。

接下来，将含有每毫升100微克FLAG肽的70微升洗涤缓冲液添加到树脂沉淀中，并在4摄氏度下孵育过夜，如前所述。旋转后，将含有纯化蛋白质的上清液收集到新鲜管中。按照手稿中的描述制备聚合混合物，并向聚合混合物中加入 10 微管蛋白。

将试管转移到加热块中，在 37 摄氏度下预热，并孵育 30 分钟。制备微管稳定缓冲液后，将其加热，然后将其添加到聚合的微管中。一旦运动流通池室准备好，将30微升稀释的微管溶液流过该室。

30分钟后，流动40至50微升封闭缓冲液并孵育。准备运动混合物，并向其中加入一微升纯化的马达。充分混合并将溶液流入运动室。

密封运动室的两端并在TIRF照明下成像。专注于单个mCitirin标记的电机，以过程方式移动。将罗丹明标记的微管蛋白与未标记的微管蛋白以1比10的比例混合。

聚合 30 分钟后，轻轻加入 30 微升预热的微管稳定缓冲液，并在 37 摄氏度下进一步孵育 5 分钟。通过用毛细管加载尖端移液来剪切微管。制备运动流动室后，流动50微升Sf9纯化的GFP纳米抗体并孵育30分钟。

通过流动 50 微升块缓冲液来阻塞盖玻片表面。准备50微升的电机混合物。轻轻混合溶液后将其流入腔室并孵育30分钟。

用50微升P12-酪蛋白清洗腔室两次。准备滑动测定混合物并轻轻混合，然后将其流入运动室。密封运动室的末端，并在TIRF照明下成像微管滑动。

转染48小时后，未转染的细胞看起来很小，圆形且牢固附着。然而，表达蛋白质的转染细胞松散地附着在表面上并显示出增大的细胞直径。72小时后，超过90%的Sf9细胞表达荧光标记的驱动蛋白-3马达KIF1A，细胞松散地结合在表面。

从转染的Sf9细胞中纯化驱动蛋白-3运动蛋白。Kymograph描绘了驱动蛋白-3马达沿着微管表面过程性地行走。运动事件显示平均速度和运行长度分别约为每秒2.44微米和10.79微米。

Kymograph指示驱动蛋白-3电机平滑的微管滑动，平均速度约为每秒1.37微米。最重要的是在不干扰微管混合物的情况下添加稳定缓冲液，并且不要剪切微管。该协议可用于其他应用，例如ATP酶测量，生物物理分析，机制，体外重建测定等。

使用sf9纯化电机，我们最近证明了驱动蛋白-3电机具有快速和超强的加工能力。有趣的是，与表征良好的电机Kinesin-1相比，这些电机表现出较高的ATP周转率。