يقدم البروتوكول طريقة بسيطة لتنقية المحركات الجزيئية النشطة باستخدام نظام الفيروس البقعي Sf9. كما أنه يفصل حركية الجزيء الواحد ومقايسات الانزلاق متعددة المحركات لدراسة الآلية التنظيمية للبروتينات الحركية. كل هذا التعبير الناقل التقليدي Sf9 baculovirus التعبير وتنقية تقارب خطوة واحدة ، سيقود البروتين الحركي النقي والنشط لدراسة التفاصيل الميكانيكية ل Superprocessive Kinesins في جزيء واحد وأنظمة متعددة المحركات.
بالإضافة إلى محركات Kinesin ، يمكن تطبيق البروتوكول لدراسة الخصائص البيوكيميائية والفيزيائية الحيوية للبروتينات الهيكلية الخلوية الأخرى مثل ديونين والميوسين. البروتوكول مفصل وسهل المتابعة. بعض الاقتراحات هي التعامل مع خلايا Sf9 بعناية لأنها عرضة للتلوث ، واتباع الملاحظات الواردة في البروتوكول.
العرض المرئي فعال للغاية وسهل المتابعة وفهم الخطوات الحاسمة ، خاصة بالنسبة لأولئك الذين لم يقوموا بإجراء هذه المقايسات مطلقا. سيتم توضيح الإجراء بوشبانجالي سوبينا وديبيشواري شيوال ، طلاب الدكتوراه الذين يعملون معي وبراديب. للبدء ، بذر الخلايا في طبق 35 ملليلتر ، بكثافة 4.5 مرات 10 إلى الخلايا الخامسة لكل ملليلتر.
بعد 24 ساعة ، امزج ميكروجراما واحدا من الحمض النووي الباكميد و 100 ميكرولتر من وسائط جريس غير المكملة في أنبوب. امزج ستة ميكرولترات من كاشف النقل في أنبوب آخر مع 100 ميكرولتر من وسائط جريس غير المكملة. انقل محتوى الأنبوب الأول بعناية إلى الأنبوب الثاني.
امزجها واحتضن الخليط لمدة 45 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. أضف 0.8 ملليلتر من وسائط جريس غير المكملة إلى الخليط. امزج واستنشق وسائط Sf900 SFM من الخلايا.
أضف وسائط النقل المعدة قطرة على الجزء العلوي من الخلايا واحتضان اللوحة لمدة ست ساعات. ثم قم بإزالة خليط النقل بعناية. أضف ملليلتر من وسائط SF900 SFM واحتضانها أكثر عند 28 درجة مئوية لمدة 48 ساعة.
بعد ذلك ، تحقق من تعبير البروتين الحركي تحت مجهر مضان مقلوب. حصاد وسائل الإعلام مع الخلايا المصابة ، وتدور لمدة خمس دقائق ، في 500 G.جمع الطاف والتقط تجميد القسمة . أضف 10 ملليلتر من وسائط SF900 SFM مع الخلايا وملليلتر واحد من مخزون فيروس P-zero في دورق مخروطي معقم سعة 100 ملليلتر.
احتضان عند 28 درجة مئوية مع اهتزاز مستمر عند 90 دورة في الدقيقة. بعد 72 ساعة ، قم بتدوير الخلايا في أنبوب مخروطي معقم سعة 15 ملليلتر عند 500 جم لمدة خمس دقائق واجمع المادة الطافية. للتعبير عن البروتين على نطاق واسع ، تصيب 30 ملليلتر من ثقافة التعليق مع ملليلتر واحد من فيروس الأسهم P1.
بعد 72 ساعة من الإصابة ، افحص الخلايا بحثا عن تعبير البروتين واجمع الخلايا في أنابيب مخروطية معقمة سعة 50 ملليلتر. بعد الغزل, تجاهل طاف, وجمع بيليه الخلية. لتحليل الخلايا ، أضف ثلاثة ملليلتر من محلول تحلل الجليد البارد إلى حبيبات الخلية.
تدور الخلية lysate في 150،000 غرام لمدة 30 دقيقة ، في أربع درجات مئوية. اجمع المادة الطافية واخلطها مع 40 ميكرولتر من راتنج التقارب 50٪ ANTI-FLAG M2. احتضان الخليط عند أربع درجات مئوية لمدة ثلاث ساعات مع التقليب من طرف إلى طرف.
الآن بيليه راتنج FLAG عن طريق الدوران عند 500 جم لمدة دقيقة واحدة عند أربع درجات مئوية. اغسل حبيبات راتنج FLAG ثلاث مرات باستخدام عازل الغسيل البارد المثلج. وبعد الغسيل الثالث ، استنزاف بعناية عازلة الغسيل.
بعد ذلك ، أضف 70 ميكرولترا من محلول الغسيل الذي يحتوي على 100 ميكروغرام لكل ملليلتر من ببتيد FLAG ، إلى حبيبات الراتنج ، واحتضانها طوال الليل عند أربع درجات مئوية ، كما هو موضح سابقا. بعد الدوران ، اجمع المادة الطافية التي تحتوي على البروتين المنقى في أنبوب جديد. تحضير مزيج البلمرة كما هو موضح في المخطوطة ، وإضافة 10 ميكرولتر من التوبولين إلى خليط البلمرة.
انقل الأنبوب إلى كتلة حرارية ، تم تسخينه مسبقا عند 37 درجة مئوية ، واحتضانه لمدة 30 دقيقة. بعد تحضير المخزن المؤقت لتثبيت الأنابيب الدقيقة ، قم بتسخينه وإضافته إلى الأنابيب الدقيقة المبلمرة. بمجرد تحضير حجرة خلية التدفق الحركي ، قم بتدفق 30 ميكرولترا من محلول الأنابيب الدقيقة المخفف عبر الغرفة.
بعد 30 دقيقة ، تدفق 40 إلى 50 ميكرولتر من المخزن المؤقت المانع واحتضانه. تحضير خليط حركية وإضافة ميكرولتر واحد من المحرك المنقى إليه. تخلط جيدا وتتدفق الحل في غرفة الحركة.
أغلق طرفي غرفة الحركة والصورة تحت إضاءة TIRF. ركز على المحركات الفردية الموسومة mCitirine ، تتحرك بشكل عملي. امزج التوبولين المسمى رودامين مع توبولين غير مسمى بنسبة واحد إلى 10.
بعد 30 دقيقة من البلمرة ، أضف برفق 30 ميكرولتر من المخزن المؤقت لتثبيت الأنابيب الدقيقة قبل التسخين واحتضان أكثر ، لمدة خمس دقائق ، عند 37 درجة مئوية. قص الأنابيب الدقيقة عن طريق سحب رأس التحميل الشعري. بعد تحضير غرفة تدفق الحركة ، قم بتدفق 50 ميكرولتر من الأجسام النانوية GFP المنقاة Sf9 واحتضانها لمدة 30 دقيقة.
سد سطح انزلاق الغطاء عن طريق تدفق 50 ميكرولتر من المخزن المؤقت للكتلة. تحضير 50 ميكرولتر من مزيج المحرك. قم بتدفقه إلى الغرفة بعد خلط المحلول برفق واحتضانه لمدة 30 دقيقة.
اغسل الغرفة مرتين ب 50 ميكرولتر من الكازين P12. تحضير خليط الفحص المنزلق وخلطه برفق ، قبل تدفقه في غرفة الحركة. أغلق نهايات غرفة الحركة ، وصورة الأنابيب الدقيقة تنزلق تحت إضاءة TIRF.
بعد 48 ساعة من النقل ، تبدو الخلايا غير المنقولة صغيرة ومستديرة ومتصلة بإحكام. ومع ذلك ، فإن الخلايا المنقولة التي تعبر عن البروتين ، كانت مرتبطة بشكل فضفاض بالسطح وأظهرت قطر الخلية الموسع. بعد 72 ساعة ، عبرت أكثر من 90٪ من خلايا Sf9 عن محرك kinesin-3 KIF1A الموسوم بالفلورسنت ، وكانت الخلايا مرتبطة بشكل فضفاض بالسطح.
تم تنقية البروتين الحركي Kinesin-3 من خلايا Sf9 المنقولة. يصور kymograph محرك kinesin-3 يمشي بشكل عملي ، على طول سطح الأنابيب الدقيقة. أظهرت أحداث الحركة متوسط سرعة وطول تشغيل يبلغ حوالي 2.44 ميكرومتر في الثانية و 10.79 ميكرومتر على التوالي.
يشير kymograph إلى انزلاق الأنابيب الدقيقة السلس بواسطة محركات kinesin-3 ، بمتوسط سرعة يبلغ حوالي 1.37 ميكرومتر في الثانية. الشيء الأكثر أهمية هو إضافة المخزن المؤقت للتثبيت دون إزعاج مزيج الأنابيب الدقيقة وعدم قص الأنابيب الدقيقة. سيكون البروتوكول مفيدا لتطبيقات أخرى ، مثل قياسات ATPase ، والتحليل الفيزيائي الحيوي ، والآليات ، ومقايسات إعادة التكوين في المختبر ، وما إلى ذلك.
باستخدام المحركات المنقاة sf9 ، أثبتنا مؤخرا أن محركات kinesin-3 سريعة وفائقة المعالجة. ومن المثير للاهتمام ، أن هذه المحركات تظهر معدلات دوران ATP عالية مقارنة بالمحرك المميز جيدا ، Kinesin-1.
